豬肉肌原纖維蛋白氧化對亞硝化的影響

顧如霞，蘭艷麗，葛鳳芹，李鋒，王永麗

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室 山東泰安 271018）

亞硝胺由食品中的亞硝酸鹽、硝酸鹽與蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物氨基酸、胺類物質(zhì)發(fā)生亞硝化反應(yīng)形成。它具有致癌、致畸及致突變作用，過量攝入會威脅人體健康。食品中亞硝胺類化合物的主要形成途徑為：蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨基酸，氨基酸經(jīng)脫羧作用生成腫胺和芳香族叔胺等含氮物質(zhì)；在酸性條件下亞硝酸鹽可生成亞硝酸，并進(jìn)一步分解產(chǎn)生活性亞硝化試劑。兩者在弱酸性環(huán)境下，發(fā)生亞硝化反應(yīng)形成各種亞硝胺類化合物。亞硝酸鹽和胺類化合物是反應(yīng)必不可少的前體物質(zhì)，而酸性pH 值是必須具備的反應(yīng)條件[1]。此外，亞硝胺的形成還受其它諸多因素的影響，如肉基質(zhì)環(huán)境的氧化-還原電位，前體物質(zhì)的濃度、溫度，亞硝化反應(yīng)的促進(jìn)劑和抑制劑，蛋白質(zhì)的含量，蛋白質(zhì)氧化程度及氧化形成的產(chǎn)物等[2]。

蛋白質(zhì)暴露在活性氧環(huán)境下會發(fā)生氧化，導(dǎo)致肽鍵斷裂、側(cè)鏈氨基酸修飾、蛋白質(zhì)分子間共價交聯(lián)等變化，并最終影響蛋白質(zhì)分子性質(zhì)和生物學(xué)功能。最新研究表明，蛋白質(zhì)氧化與亞硝胺形成關(guān)系密切，不僅可直接為亞硝胺形成提供前體物，還可間接影響食品中亞硝化反應(yīng)過程[3-4]。蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生多種含氮衍生物，過氧化氫誘導(dǎo)蛋白氧化產(chǎn)生二級氧化產(chǎn)物，如丙二醛或4-羥基壬烯醛，可作為亞硝胺的前體物質(zhì)[5]。蛋白質(zhì)在加工或儲藏過程中發(fā)生的氧化、亞硝化和分解都會導(dǎo)致肉制品營養(yǎng)價值的降低。蛋白質(zhì)氧化可能影響亞硝化進(jìn)程。目前關(guān)于肉與肉制品中蛋白質(zhì)氧化對N-亞硝胺形成的影響鮮有報道。

本文以豬肉肌原纖維蛋白為研究對象，構(gòu)建羥自由基氧化體系，研究不同氧化程度對肌原纖維蛋白側(cè)鏈修飾、構(gòu)象變化、蛋白交聯(lián)聚集及亞硝化的影響。通過測定羰基、總巰基、二硫鍵、自由氨基、二聚酪氨酸和表面疏水性等指標(biāo)，揭示蛋白質(zhì)氧化程度對NaNO2、3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）和亞硝胺形成的影響。通過相關(guān)性分析闡明蛋白質(zhì)氧化與亞硝化之間的關(guān)系，研究結(jié)果將為了解蛋白氧化體系中亞硝胺形成機(jī)制，控制蛋白氧化，提高肉制品安全品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬背最長肌，購于泰安大潤發(fā)超市雙匯肉食專柜。

亞硝胺混標(biāo)、1，1-二苯基-2-苦基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、β-巰基乙醇、2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、5，5’-二硫代雙-2-硝基苯甲酸（5，5’-dithio-bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）、4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并氧雜惡二唑（7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazole，NBD-F）、牛血清蛋白，美國Sigma 公司；2-硝基-5-硫代磺基苯甲酸（2-nitro-5-thiosulfobenzoate，NTSB）、食品級亞硝酸鈉（≥99%）、十二烷基磺酸鈉、二氯甲烷、四甲基乙二胺、鹽酸納乙二胺、鄰苯二甲醛、對氨基苯磺酸和水溶性維生素E，上海Solarbio 公司；檸檬酸鈉、丙烯酰胺、過氧化氫、酒石酸鉀鈉等為分析純試劑，上海國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02 分析天平，美國Mettler-Toledo 公司；SpectraMax M2 多功能酶標(biāo)儀，美國MD 公司；7890A/5975C 三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；Bio-Rad 電泳儀，美國Bio-Rad 公司；F-7000 熒光分光光度計，日本日立公司；CTHI-250B型恒溫恒濕箱，STIK 儀器設(shè)備（上海）有限公司；XM-P22H 型無級調(diào)功超聲波清洗機(jī)，小美超聲儀器（昆山）有限公司；Allegra 64R 型高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter 公司；IKAT18basic 型高速分散機(jī)，德國IKA 公司；DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；Turbo Vap LV 全自動濃縮工作站，美國Caliper 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取 肌原纖維蛋白（MP）的提取參考Park 等[6]的方法并略作修改。新鮮豬肉剔除可見脂肪、筋膜等組織，放入絞肉機(jī)絞碎，稱取20 g 肉樣，加入4 倍體積的pH 7.0 磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2），高速勻漿（10 000 r/min，30 s），4 ℃離 心（4 000 r/min，10 min）后棄上清液，此過程重復(fù)3 次。用4 倍體積的氯化鈉洗液（0.1 mol/L）勻漿（10 000 r/min，30 s），置4 ℃離心（4 000 r/min，10 min），棄上清，重復(fù)兩次。第3 次洗液勻漿后，用4 層紗布將其過濾，最后用0.1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)pH 值為6.25，離心，去上清液，所得白色膏狀物即肌原纖維蛋白。將制備好的MP 置離心管中4 ℃冷藏，48 h 內(nèi)使用。采用雙縮脲法測定蛋白的含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.0033x+0.129，R2=0.997。

1.3.2 肌原纖維蛋白氧化處理 用25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）將MP蛋白膏稀釋到40 mg/mL。將稀釋好的MP 溶液加入離心管中，再加入羥自由基氧化體系（0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mmol/L 抗壞血酸，H2O2），最終體系H2O2濃度分別是0，10，30，50，70 mmol/L，蛋白的最終質(zhì)量濃度為25 mg/mL，將氧化體系置于37 ℃氧化1 h。通過添加水溶性維生素E（Trolox，1 mmol/L，終濃度）來終止氧化反應(yīng)。以未加氧化劑，含Trolox 的蛋白溶液為空白對照。

1.3.3 肌原纖維蛋白理化特性分析

1）羰基含量測定 參照Oliver 等[7]的方法，采用2，4-二硝基苯肼（DNPH）法測定，摩爾消光系數(shù)為22 000 mol/（L·cm），羰基含量表示為nmol/mg MP。溶劑對照組，開始時加入2 mL 緩沖液代替蛋白溶液，其余操作相同。

2）總巰基含量測定 參照Cao[8]等的方法，采用5，5’-二硫代雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）法于412 nm 處測定吸光值，采用摩爾消光系數(shù)13 600 mol/（L·cm）計算，總巰基含量表示為nmol/mg MP。

3）二硫鍵含量測定 參考Liu 等[9]的方法，向各蛋白氧化體系溶液中加入2-硝基-5-硫代磺基苯甲酸（NTSB）試劑，避光反應(yīng)，震蕩15 min 后，于412 nm 處測定其吸光值。

4）自由氨基含量測定 參照Adler-Nissen等[10]的方法，采用鄰苯二甲醛法測定，蛋白氧化處理后的自由氨基含量通過L-賴氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，單位為nmol/mg MP。

5）二聚酪氨酸含量測定 參照Davies 等[11]的方法，用20 mmol/L 磷酸鹽溶液（含0.6 mol/L KCl，pH 6.0）將氧化后的蛋白溶液稀釋到1 mg/mL。蛋白溶液經(jīng)離心（10 000 r/min，10 min）除去不溶性物質(zhì)。用熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為325 nm，發(fā)射波長為420 nm，狹縫寬度為10 nm。二聚酪氨酸含量用所測熒光強(qiáng)度除以蛋白濃度獲得，為相對熒光值，單位為（arbitrary units，簡寫A.U）。

1.3.4 肌原纖維蛋白構(gòu)象變化分析 表面疏水性：參照曹云剛等[12]的方法，采用溴酚藍(lán)（bromphenol blue，BPB）結(jié)合法。將肌原纖維蛋白用20 mmol/L 磷酸鹽溶液（pH 6.25）溶解，稀釋至5 mg/mL。吸取各處理組蛋白溶液1 mL 置于離心管中，加200 μL 溴酚藍(lán)溶液（1 mg/mL）混合均勻，在6 000 r/min 條件下離心15 min，吸取上清液于595 nm 處測量吸光值。表面疏水性用蛋白暴露的疏水性氨基酸殘基與溴酚藍(lán)的結(jié)合量表示。

SDS-PAGE 凝膠電泳：參照Laemmli 等[13]研究方法，分離膠12%，濃縮膠4%，pH 8.3 電極緩沖液（0.05 mol/L Tris-HCl 溶液，0.384 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS）。將電泳樣品用樣品溶解液（含10% SDS、50%甘油、加或不加10% β-巰基乙醇、0.1%溴酚藍(lán)、1 mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH6.8）配制蛋白終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，漩渦混合1 min，沸水浴5 min。樣品上樣量10 μL。電泳結(jié)束后取出膠片，用蛋白染色液染色1 h 后脫色，結(jié)合Tanon軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。

1.3.5 肌原纖維蛋白亞硝化處理 肌原纖維蛋白亞硝化處理參考Yang 等[14]方法并稍作改動。將處理好的氧化蛋白各體系用25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mmol/L NaCl、430 μmol/L 亞硝酸鈉，pH 6.0）稀釋，蛋白終質(zhì)量濃度為20 mg/mL（所有濃度均為最終濃度）。亞硝化反應(yīng)在37 ℃下孵育4 h，用NaOH 調(diào)整pH 值至13，終止反應(yīng)。各反應(yīng)體系置于4 ℃下，待測。

1.3.5.1 亞硝酸鹽殘留量測定 按照GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》方法測定。

1.3.5.2 3-硝基酪氨酸（3-NT）含量測定 參照Feng 等[15]的方法，取處理好的肌原纖維蛋白溶液100 μL，加入0.36 mL乙腈、0.04 mL 1 mol/L NBD-F、0.5 mL 0.1 mol/L 四硼酸鈉溶液，混勻，60℃水浴2 min。冷卻后過0.45 μm 濾膜，進(jìn)液相色譜分析。色譜柱為250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相為磷酸氫鉀-磷酸緩沖液/乙腈（20 mmol/L，pH 3），流速1.0 mL/min，上樣量10 μL。

1.3.5.3 N-亞硝胺含量的測定 取各處理組的肌原纖維蛋白溶液2 mL，用5 mL 二氯甲烷渦旋超聲提取，10 000×g，4 ℃離心5 min，重復(fù)1 次。二氯甲烷層氮吹后用2 mL 二氯甲烷復(fù)溶，過0.25 μm微孔濾膜，進(jìn)行GC-MS 分析。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-WAX（30 m×250 μm，0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣；采用程序升溫：初始溫度50 ℃，保持2 min，以8 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min，然后以20 ℃/min 升至250 ℃，保持2 min；載氣流速1 mL/min。串聯(lián)質(zhì)譜條件：掃描模式：選擇離子掃描（SIM）；離子源：EI 源；離子源和四極桿溫度分別為230 ℃和250 ℃；電子倍增器電壓1 301 eV；電離電壓70 eV；燈絲電流：50 μA；掃描質(zhì)量范圍：m/z 30～150，溶劑延遲時間：2.5 min；碰撞氣：99.99%高純氬氣，進(jìn)樣量1 μL。采用外標(biāo)法定量計算亞硝胺，每次測定重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計分析

指標(biāo)測定均重復(fù)3 次，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SAS 8.2 統(tǒng)計軟件進(jìn)行不同處理間單因素方差分析（one-way ANOVA analysis）和各指標(biāo)間的Pearson 相關(guān)性分析。當(dāng)P＜0.05 時，表示均值間差異顯著；P＜0.01 時，表示均值間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化強(qiáng)度對肌原纖維蛋白理化特性的影響

蛋白羰基含量是表征蛋白質(zhì)氧化的重要指標(biāo)之一。由表1 所示，在羥自由基氧化體系中，羰基含量隨H2O2濃度的上升顯著增加（P＜0.05）。氧化1 h 后，空白對照組羰基含量為7.27 nmol/mg，與0 mmol/L H2O2濃度條件下無顯著差異（P＞0.05），與曹云剛等[12]研究結(jié)果一致。當(dāng)H2O2濃度為70 mmol/L 時，羰基含量為22.04 nmol/mg，比空白對照增加203.16%。羰基含量的升高可能是由于肌原纖維蛋白氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)經(jīng)自由基攻擊直接氧化產(chǎn)生，或肽鏈斷裂加速羰基化進(jìn)程，賴氨酸、蘇氨酸和脯氨酸易受到自由基攻擊而產(chǎn)生羰基衍生物；還可通過和還原糖反應(yīng)，以及結(jié)合非蛋白羰基化合物形成[16]。Nyaisaba 等[17]研究阿拉斯加鱈魚MP 羰基含量隨H2O2濃度增加而顯著上升，羰基的形成對H2O2有濃度依賴性。Xia 等[18]研究豬肉肌原纖維蛋白氧化，發(fā)現(xiàn)H2O2濃度從0 到20 mmol/L，羰基含量顯著增加79.75%，與本研究結(jié)果一致。

表1 氧化程度對MP 羰基、總巰基、二硫鍵和自由氨基含量的影響Table 1 Effect of oxidation degrees on carbonyl，total sulfhydryl，disulfide bond and free amino content of MP

蛋白富含巰基，在氧化條件下巰基極易被氧化成二硫鍵，因此總巰基和二硫鍵含量常被用來表征蛋白的氧化程度[19]。總巰基與二硫鍵含量見表1。隨著H2O2濃度的升高，總巰基含量顯著下降（P＜0.05），二硫鍵含量顯著增加（P＜0.05）?？瞻讓φ战M總巰基含量為102.32 nmol/mg，當(dāng)H2O2濃度為0 mmol/L H2O2時，總巰基含量與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）。氧化組（10，30，50，70 mmol/L H2O2）與空白對照樣品相比，總巰基含量分別降低10.46%，17.95%，22.24%和25.21%，二硫鍵含量分別升高了240%，277%，426%和461%。Wang 等[20]研究鐵催化氧化系統(tǒng)處理牦牛MP 時發(fā)現(xiàn)，巰基含量下降，二硫鍵含量升高，巰基含量的降低依賴于羥自由基的濃度，與本研究結(jié)果一致。氧化導(dǎo)致巰基含量下降，可能是由于MP 中半胱氨酸殘基極易受到羥自由基攻擊，巰基被氧化成二硫鍵。另外，MP 在氧化過程中變性展開，使巰基暴露，進(jìn)而被氧化成二硫鍵。Soladoye 等[21]指出隨著H2O2濃度增加，蛋白片段交聯(lián)聚集，形成多肽分子間或分子內(nèi)二硫鍵，進(jìn)一步氧化成亞磺酸、磺酸或其它氧化產(chǎn)物，從而導(dǎo)致蛋白表面巰基含量減少，二硫鍵含量升高。

蛋白自由氨基含量如表1 所示。自由氨基含量隨H2O2濃度的升高呈下降的趨勢，與H2O2濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這與總巰基含量的變化趨勢一致?？瞻讓φ战M和0 mmol/L H2O2處理組的自由氨基含量分別為104.72 nmol/mg 和105.51 nmol/mg，兩者無顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)H2O2濃度為70 mmol/L 時自由氨基含量為85.10 nmol/mg，與空白對照組相比降低了18.74%。這與曹云剛等[12]報道的豬肉MP 自由氨基下降趨勢一致。自由氨基含量下降可能是由于蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈含有的-NH2基團(tuán)在自由基的攻擊下，通過脫氨基作用轉(zhuǎn)化為羰基，羰基再與氨基反應(yīng)形成席夫堿，從而使自由氨基含量降低[22]。

酪氨酸殘基易被活性氧自由攻擊發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，生成二聚酪氨酸，因此，可以通過測定二聚酪氨酸的含量來反映蛋白質(zhì)氧化程度。自由基氧化體系對MP 二聚酪氨酸含量的影響如圖1 所示。氧化1 h 后，不同的氧化濃度（10，30，0、70 mmol/L H2O2）條件下，相對于空白對照組，二聚酪氨酸含量分別增長到390.73，566.94，651.00，716.21 AU，增長率分別為37.00%，98.79%，128.27%和151.13%，0 mmol/L H2O2處理組與空白對照組無顯著差異（P＜0.05）。Wang 等[20]研究自由基對牦牛MP 氧化時發(fā)現(xiàn)，二聚酪氨酸含量隨羥自由基氧化體系濃度的升高而增加，與本研究結(jié)果一致。高濃度羥自由基使蛋白氧化暴露出更多的氨基酸殘基，蛋白氨基酸殘基被氧化后，通過共價和非共價相互作用形成蛋白聚合物[23-24]。二聚酪氨酸可以由兩條不同氨基酸多肽鏈或由同一氨基酸多肽鏈上的兩個不同位置的酪氨酸自由基反應(yīng)產(chǎn)生，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)，蛋白質(zhì)氨基酸殘基的共價或非共價修飾可導(dǎo)致蛋白構(gòu)象和功能性質(zhì)發(fā)生顯著改變[25]。

圖1 氧化強(qiáng)度對MP 二聚酪氨酸含量的影響Fig.1 Effect of protein oxidation degree on dityrosine content of MP

2.2 氧化強(qiáng)度對肌原纖維蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性的影響

表面疏水作用力是維持蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能特性的一種重要作用力，溴酚藍(lán)分子可與蛋白質(zhì)分子表面的疏水性結(jié)合位點結(jié)合，如色氨酸和苯丙氨酸。在羥自由基氧化體系內(nèi)，大量的自由基會不斷攻擊蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸殘基，從而通過結(jié)合的溴酚藍(lán)含量反映蛋白質(zhì)表面疏水性的變化。如圖2 所示，蛋白表面疏水性隨H2O2濃度的增加先降低后增大。0 mmol/L H2O2濃度的MP 溴酚藍(lán)的結(jié)合量為96.17 μg，與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）；30 mmol/L H2O2濃度的MP 溴酚藍(lán)的結(jié)合量最低為86.77 μg，與空白對照組相比降低了11.68%。曹云剛等[12]研究不同氧化強(qiáng)度對豬肉MP 結(jié)構(gòu)的影響時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H2O2濃度為10 mmol/L 時，表面疏水性與空白對照組相比降低了11%，與本研究結(jié)果一致。這可能是由于氧化導(dǎo)致MP 結(jié)構(gòu)展開后又通過疏水相互作用聚集，使表面疏水性下降。當(dāng)H2O2濃度增到70 mmol/L 時，溴酚藍(lán)的結(jié)合量升到111.08 μg，與空白對照組相比增長了13.07%（P＜0.05）。說明強(qiáng)氧化導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開，使蛋白內(nèi)部的非極性基團(tuán)暴露在分子表面，蛋白分子之間交聯(lián)減少，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增強(qiáng)。Zhang 等[26]對翹嘴鲌MP 在羥基自由基氧化體系中的結(jié)構(gòu)、功能及凝膠特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨著H2O2濃度的增加，MP 表面疏水性增加。蛋白質(zhì)氧化后導(dǎo)致的表面疏水性的差異可能與氧化劑濃度以及氧化劑與肌原纖維蛋白的比重有關(guān)[27]。

圖2 氧化強(qiáng)度對MP 表面疏水性的影響Fig.2 Effect of protein oxidation degree on surface hydrophobicity of MP

氧化誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)共價交聯(lián)和聚集，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)變化。通過非還原型（-β-ME）和還原型（+β-ME）SDS-PAGE 凝膠電泳反映氧化體系中肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的變化。如圖3 所示，在非還原狀態(tài)下，隨著H2O2氧化濃度的增加，肌球蛋白重鏈（MHC）、肌動蛋白（Actin）和肌鈣蛋白（Troponin）條帶的強(qiáng)度明顯降低，同時，在濃縮膠頂端大分子高聚物明顯增多，且分子質(zhì)量超過了200 ku，說明這些聚合物主要是來自肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和肌鈣蛋白的聚合。高分子聚合物的形成可能是由于氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)二硫鍵共價交聯(lián)，以及蛋白質(zhì)的交聯(lián)和聚集引起的[6]，與巰基含量降低和二硫鍵含量升高結(jié)果一致。在還原狀態(tài)下，隨著H2O2氧化濃度的增加，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶強(qiáng)度明顯加深，說明在氧化體系中蛋白交聯(lián)和聚集的主要形式是二硫鍵，這與阿拉斯加鱈魚在羥基自由基氧化條件下研究結(jié)果一致[17]。然而，仍有一部分聚合物在濃縮膠頂部，部分肌球蛋白重鏈沒有恢復(fù)，說明聚合物中還存在除二硫鍵以外的其它共價交聯(lián)，如：氧化導(dǎo)致二聚酪氨酸交聯(lián)，羰基-氨基之間共價交聯(lián)等誘導(dǎo)的聚集[12]，這與二聚酪氨酸隨H2O2濃度的增加，含量升高的結(jié)果一致。

圖3 氧化強(qiáng)度對MP 影響的SDS-PAGE 圖譜Fig.3 Effect of protein oxidation degree on SDS-PAGE patterns of MP

2.3 氧化強(qiáng)度對肌原纖維蛋白亞硝化的影響

氧化強(qiáng)度對MP 亞硝化的影響見表2?？瞻讓φ战MNaNO2殘留量為60.57 mg/kg，NaNO2殘留量隨著H2O2濃度的增加而顯著降低（P＜0.05），說明NaNO2在羥自由基氧化體系中，可作為前體物生成3-NT、NDEA 和NDMA，這與Vossen 等[3]研究NaNO2對MP 氧化的影響結(jié)果一致。NaNO2和羥基自由基反應(yīng)能夠產(chǎn)生活性氮，引發(fā)蛋白質(zhì)的亞硝化和氧化反應(yīng)[4，15]，酪氨酸殘基被活性氮修飾生成3-NT，因此其被認(rèn)為是蛋白質(zhì)亞硝化的標(biāo)記物。MP 中3-NT 含量隨H2O2氧化強(qiáng)度的增加而顯著增加（P＜0.05），當(dāng)H2O2濃度增到70 mmol/L時，3-NT 含量升到7.04 nmol/mg，與空白對照組相比增長了43.38%（P＜0.05）。結(jié)果表明，氧化強(qiáng)度增加促進(jìn)了蛋白質(zhì)亞硝化作用，這與Vossen 等[3]研究結(jié)果一致?？瞻讓φ战M的NDMA 含量為0.93 μg/mL，70 mmol/L H2O2處理后NDMA 含量升到1.05 μg/mL，比空白對照組增加了12.9%。70 mmol/L H2O2處理組中NDEA 含量為1.04 μg/mL，比空白對照組顯著增加了11.54%（P＜0.05）。楊華等[28]研究反復(fù)凍融的豬肉蛋白對亞硝胺形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融造成蛋白質(zhì)氧化，促進(jìn)了二乙基亞硝胺（NDEA）的形成。

表2 氧化程度對MP 亞硝化的影響Table 2 Effect of oxidation degrees on protein nitrosation of MP

肌肉中易發(fā)生亞硝化的游離氨基酸包括脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和纈氨酸，以及具有生物活性的腐胺和尸胺，被認(rèn)為是亞硝胺的前體物質(zhì)[5]。在氧化體系中，抗壞血酸和亞硝酸鈉反應(yīng)可以產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮進(jìn)一步與超氧化物自由基反應(yīng)形成過氧硝酸鹽，過氧硝酸鹽可以啟動蛋白質(zhì)的亞硝化作用，產(chǎn)生3-NT[15]。在氧化體系中加入硝酸鹽或亞硝酸鹽，羰基的形成和巰基的氧化以及可能的脫氨作用都能導(dǎo)致新鮮豬肉中產(chǎn)生仲胺化合物，仲胺化合物與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺[29-30]。蛋白質(zhì)氧化過程復(fù)雜，能夠產(chǎn)生多種含氮衍生物，蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的仲胺能促進(jìn)亞硝胺的生成。本研究也證實蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物作為亞硝化反應(yīng)的前體物質(zhì)，促進(jìn)了N-亞硝胺的形成。

2.4 肌原纖維蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)與亞硝化的相關(guān)性分析

肌原纖維蛋白各氧化指標(biāo)與亞硝化之間的相關(guān)性見表3。H2O2濃度與MP 中羰基（r=0.905）、二硫鍵（r=0.908）和二聚酪氨酸（r=0.956）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），H2O2濃度與總巰基（r=-0.934）和自由氨基（r=-0.936）呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。說明隨著氧化強(qiáng)度的增加，提高了MP 表面疏水性和二聚酪氨酸含量，降低了自由氨基和總巰基含量，蛋白結(jié)構(gòu)受到破壞。NaNO2與MP 中羰基（r=-0.844）、二硫鍵（r=-0.879）和二聚酪氨酸（r=-0.888）呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與總巰基（r=0.849）和自由氨基（r=0.924）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明NaNO2能抑制蛋白氧化，避免巰基和氨基受羥自由基攻擊。Feng 等[15]研究不同亞硝酸鹽添加量對火腿肌原纖維蛋白氧化的影響，結(jié)果高劑量的NaNO2能顯著抑制蛋白羰基和二聚酪氨酸的形成。

表3 肌原纖維蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)與亞硝化之間的相關(guān)性Table 3 Correlation coefficients between protein oxidation variables and protein nitrosation of MP

3-NT 與蛋白質(zhì)氧化各指標(biāo)呈顯著相關(guān)性。3-NT 與MP 中羰基（r=0.860）、二硫鍵（r=0.835）和二聚酪氨酸（r=0.792）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總巰基（r=-0.824）、自由氨基（r=-0.865）和NaNO2（r=-0.778）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。3-NT 與NDMA（r=0.788）和NDEA（r=0.812）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），這與Feng 等[1]研究亞硝酸鹽對香腸中蛋白質(zhì)氧化的影響結(jié)果一致。說明3-NT 與蛋白氧化程度及亞硝胺含量呈正相關(guān)，可能是蛋白質(zhì)氧化和亞硝化的一個標(biāo)志性產(chǎn)物[3]。蛋白質(zhì)氧化和添加NaNO2促進(jìn)了MP 亞硝化進(jìn)程。

NDMA 含量與MP 氧化指標(biāo)中羰基（r=0.779）、二硫鍵（r=0.757）和二聚酪氨酸（r=0.762）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與總巰基（r=-0.817），自由氨基（r=-0.769）和NaNO2（r=-0.654）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。NDEA 含量與MP 氧化指標(biāo)中羰基（r=0.797）、二硫鍵（r=0.808）和二聚酪氨酸（r=0.829）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與總巰基（r=-0.864），自由氨基（r=-0.857）和NaNO2（r=-0.760）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。說明肌原纖維蛋白氧化促進(jìn)NDMA 和NDEA 的形成。Sun 等[30]研究豬肉蛋白氧化與二乙基亞硝胺（NDEA）生成量的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，MP 氧化導(dǎo)致羰基化合物生成，自由氨基降低，MP 蛋白氧化促進(jìn)NDEA 的形成。Yang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)NDEA 隨蛋白質(zhì)氧化程度的增加而增加，并與蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生和巰基的減少顯著相關(guān)（P＜0.05）。

3 結(jié)論

在羥自由基氧化體系中，隨著氧化強(qiáng)度的增加，肌原纖維蛋白羰基、二硫鍵、疏水性和二聚酪氨酸含量上升，總巰基和自由氨基含量下降。同時研究了氧化強(qiáng)度對蛋白亞硝化的影響，發(fā)現(xiàn)隨著H2O2濃度的增加，NaNO2殘留量降低，3-NT、NDEA 和NDMA 含量升高，3-NT 與亞硝胺含量呈顯著正相關(guān)，說明3-NT 是蛋白亞硝化的標(biāo)志物，氧化促進(jìn)蛋白的亞硝化進(jìn)程，導(dǎo)致NDMA 和NDEA 的形成。通過蛋白氧化指標(biāo)與亞硝化之間的相關(guān)性分析，揭示蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物可作為亞硝化反應(yīng)的前體物質(zhì)促進(jìn)N-亞硝胺的形成。研究結(jié)果將為闡明肉制品在氧化條件下亞硝胺的形成機(jī)制及建立抑制蛋白氧化和亞硝化進(jìn)程相應(yīng)的控制技術(shù)提供理論依據(jù)。