細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)：研究進(jìn)展與未來展望

關(guān)欣，汪丹丹，方佳華，楊若青，費(fèi)卓成，陳堅*

（1 江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心 江蘇無錫214122 2 食品合成生物技術(shù)教育部工程研究中心 江蘇無錫 214122）

1 細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)引領(lǐng)全球食品工業(yè)科技的革命浪潮

1931 年，英國前首相丘吉爾就曾憧憬：“在未來我們將擺脫為了吃雞胸或雞翅而飼養(yǎng)整只雞”，近1 個世紀(jì)后，細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)誕生并迅速興起，丘吉爾當(dāng)初這個“狂野”的暢想成為現(xiàn)實[1]。如今，以細(xì)胞培養(yǎng)肉為代表的未來食品技術(shù)正在掀起一場食品工業(yè)科技的革命浪潮，同時推動全球蛋白質(zhì)供應(yīng)系統(tǒng)的顛覆性變革。

目前，全球主要發(fā)達(dá)國家和地區(qū)均將細(xì)胞培養(yǎng)肉列為重點研究方向并大力推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。2020 年，歐盟撥款270 萬歐元啟動Meat4all 項目進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研發(fā)，以色列創(chuàng)新局投資1 800 萬美元支持“培養(yǎng)肉聯(lián)盟”開展研究[2]。2021 年，美國塔夫茨大學(xué)創(chuàng)辦細(xì)胞農(nóng)業(yè)卓越中心并獲得美國農(nóng)業(yè)部1 000 萬美元經(jīng)費(fèi)資助[3]。2022 年4 月，荷蘭政府宣布投入6 000 萬歐元資助細(xì)胞農(nóng)業(yè)項目，這是至今為止全球在該領(lǐng)域最大的一筆公共基金[4]。在我國，2022 年3 月習(xí)總書記提出“大食物觀”，隨后國家發(fā)改委發(fā)布《“十四五”生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展規(guī)劃》，都強(qiáng)調(diào)了“發(fā)展生物技術(shù)，研發(fā)人造蛋白等新型食品”的重要意義[5]。國家和地方政府也提供了專項資金支持細(xì)胞培養(yǎng)肉的研發(fā)。中國工程院于2020 年和2022 年2 次立項開展細(xì)胞培養(yǎng)肉行業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略研究，2021 年國家科技部撥款2 000 余萬元立項支持 “人造肉高效生物制造技術(shù)”重點研發(fā)項目，細(xì)胞培養(yǎng)肉是其中最主要的研究內(nèi)容。此外，還有一些地方基金如上海高等研究院繁星科學(xué)基金，已連續(xù)2 年資助細(xì)胞培養(yǎng)肉研究項目，總經(jīng)費(fèi)超過4 000 萬元。

在產(chǎn)業(yè)發(fā)展方面，目前全球培養(yǎng)肉相關(guān)初創(chuàng)企業(yè)超過100 家，融資總金額近6 億美元，美國、荷蘭、以色列的代表性企業(yè)均獲得了上億美元的融資。2021 年，已有兩家細(xì)胞培養(yǎng)肉企業(yè)宣布建成細(xì)胞培養(yǎng)肉工廠，預(yù)估年產(chǎn)量超過40 萬磅，已公布的最低成本約4 美元/100 g 培養(yǎng)雞肉與植物蛋白混合產(chǎn)品，說明該領(lǐng)域頭部企業(yè)已初步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。2022 年11 月，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）首次批準(zhǔn)了細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)品。美國將成為繼新加坡之后又一允許銷售細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)品的國家。在我國，目前已有近10 家細(xì)胞培養(yǎng)肉初創(chuàng)企業(yè)成立，大多已獲得千萬元融資。2022 年3 月，我國聯(lián)合新加坡、以色列等國的10 余家細(xì)胞培養(yǎng)肉企業(yè)，共同成立了“亞太細(xì)胞農(nóng)業(yè)協(xié)會”，目的是通過提升與消費(fèi)者的互動來普及培養(yǎng)肉的技術(shù)和影響力，也將與各界政府洽談以促成培養(yǎng)肉在亞太地區(qū)的立法審批[6]。

同時，國內(nèi)外已有一批大學(xué)和科研院所集中力量進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)肉創(chuàng)新研究，從細(xì)胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)開展基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究，不斷提升其生產(chǎn)技術(shù)水平。本文以論文檢索為基礎(chǔ)，總結(jié)全球細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域主要研究機(jī)構(gòu)和核心研究方向，并對生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)的最新進(jìn)展和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行分析，提出細(xì)胞培養(yǎng)肉未來重點攻關(guān)方向，以期為我國細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)發(fā)展提供借鑒。

2 細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域論文產(chǎn)出分析

在Web of science（WOS）數(shù)據(jù)庫中以“TS=（cell -based meat * OR culture -meat * OR clean-meat * OR cell-meat * OR cultivatedmeat * OR cellular-meat * OR cultured-meat *OR cell-cultured-meat * OR in-vitro-meat）為關(guān)鍵詞搜索到996 篇細(xì)胞培養(yǎng)肉相關(guān)領(lǐng)域的論文。圖1 為近年來細(xì)胞培養(yǎng)肉文章發(fā)表情況，可以看出，近年來細(xì)胞培養(yǎng)肉相關(guān)文章發(fā)表日益增多，產(chǎn)業(yè)發(fā)展非常迅速，尤其近5 年，論文發(fā)表速度以每年50%左右的速度增長。從2017 年到現(xiàn)在，論文發(fā)表量增加約9 倍。細(xì)胞培養(yǎng)肉涉及多個研究領(lǐng)域，如圖2 所示，主要涉及食品科學(xué)與技術(shù)，細(xì)胞農(nóng)業(yè)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)，營養(yǎng)飲食，環(huán)境學(xué)和生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域。其中，細(xì)胞培養(yǎng)肉在食品科學(xué)和細(xì)胞農(nóng)業(yè)領(lǐng)域發(fā)展迅速，相關(guān)研究占總研究論文比例分別約為29%和14.5%。在這兩個領(lǐng)域，主要利用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)從動、植物中提取細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)，生產(chǎn)出所需農(nóng)業(yè)產(chǎn)品和食品，后期利用食品加工工藝，使其生物構(gòu)成、營養(yǎng)成分等品質(zhì)與從動、植物本體上獲得的產(chǎn)品類似。此外，還有一些論文進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)肉的可行性分析，包括細(xì)胞培養(yǎng)肉的環(huán)境生態(tài)影響、經(jīng)濟(jì)效益分析、消費(fèi)者心理接受度等。可見，隨著細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)的飛速發(fā)展，它帶動了細(xì)胞農(nóng)業(yè)、食品科學(xué)、營養(yǎng)飲食等熱門研究領(lǐng)域的發(fā)展。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)肉論文發(fā)表情況Fig.1 Publication of articles on cultured meat

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)肉論文涉及的研究領(lǐng)域Fig.2 Research fields of cultured meat articles

表1 從事細(xì)胞培養(yǎng)肉研究的國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)Table 1 Research institutions engaged in cultured meat research

3 細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)研究進(jìn)展

3.1 種子細(xì)胞的分離提取

3.1.1 肌肉干細(xì)胞 肌肉干細(xì)胞（Muscle stem cells，MSCs）是一種具有自我更新能力和肌源性分化特性的細(xì)胞，也是制備細(xì)胞培養(yǎng)肉的主要種子細(xì)胞類型之一。在細(xì)胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)過程中，首先需要將肌肉干細(xì)胞從肌肉組織中分離出來，隨后在體外進(jìn)行細(xì)胞的大量增殖、誘導(dǎo)成肌分化，產(chǎn)生成熟的肌纖維，再經(jīng)食品化加工過程制備出細(xì)胞培養(yǎng)肉。

肌肉干細(xì)胞可以通過酶消化法、組織塊法、單根肌纖維法等方法獲得[7-8]，其中，酶消化法是目前最常用的肌肉干細(xì)胞提取方法。從動物體內(nèi)獲得新鮮的肌肉組織后，先通過物理破碎的方法使肌肉組織變?yōu)槿饷?，再用蛋白酶消化使肌肉組織解離并釋放細(xì)胞（圖3），因此蛋白酶種類的選擇和消化工藝條件的優(yōu)化對肌肉干細(xì)胞的提取數(shù)量及活性至關(guān)重要。Choi 等[9]總結(jié)了多個物種肌肉組織消化所使用的蛋白酶，結(jié)果顯示多種蛋白酶雖都具有消化肌肉組織的能力，如不同類型的膠原酶（Collagenase）、鏈霉蛋白酶（Pronase）、分散酶（Dispase）和胰酶（Trypsin）等，但消化效力顯著不同且具有種間差異。睢夢華等[10]使用I 型膠原酶、胰蛋白酶，兩步法消化山羊胎兒背長肌組織，獲得了山羊胎兒肌肉干細(xì)胞；江南大學(xué)研究團(tuán)隊根據(jù)蛋白酶的作用機(jī)理系統(tǒng)設(shè)置了多種酶組合并進(jìn)行研究[11]，發(fā)現(xiàn)鏈霉蛋白酶（Pronase）與分散酶Ⅱ（Dispase Ⅱ）的全新酶組合能夠高效消化豬肌肉組織，獲得的細(xì)胞數(shù)量是現(xiàn)有報道的最高水平。

圖3 肌肉干細(xì)胞分離純化流程示意圖Fig.3 Work flow of isolating and purifying muscle stem cells

使用酶消化法獲得的肌肉干細(xì)胞通?；煊衅渌N類細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，因此需要對獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行純化。流式細(xì)胞分選是一種經(jīng)典的細(xì)胞純化方法，分選后的細(xì)胞幾乎100%表達(dá)肌肉干細(xì)胞特定標(biāo)志物Pax7，純度極高[12]。然而，流式分選所需儀器及試劑價格昂貴且單次分選規(guī)模小、時間長，并不適合工業(yè)化的細(xì)胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)。Benedetti 等[13]利用肌肉干細(xì)胞黏附性低的特性，將混合細(xì)胞置于冰上30 min，使肌肉干細(xì)胞脫落至上清中并轉(zhuǎn)移上清重新培養(yǎng)，進(jìn)而實現(xiàn)了低成本純化肌肉干細(xì)胞。江南大學(xué)研究團(tuán)隊[11]探索了不同初始純度對豬肌肉干細(xì)胞體外增殖和肌管形成能力的影響，并通過優(yōu)化差速貼壁法建立高效、低成本的肌肉干細(xì)胞純化方法，每克肌肉組織可以獲得2.1×106個肌肉干細(xì)胞，適用于細(xì)胞培養(yǎng)肉工藝化生產(chǎn)。

3.1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一種基質(zhì)細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能。它可以從骨髓、脂肪和臍帶中分離得到，并根據(jù)細(xì)胞來源被分為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose mesenchymal stem cells，AMSCs）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs）。在體外培養(yǎng)過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)能夠分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等中胚層來源細(xì)胞，是一種優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)肉種子細(xì)胞[14]。不同組織部位來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法也有所不同（圖4）。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通常通過直接抽取骨髓液，再經(jīng)密度梯度離心等純化方法獲得[15-16]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞則通常使用酶消化法與組織塊貼壁法進(jìn)行分離。劉亭等[17]將人臍帶切為1 mm2大小的組織塊，貼壁培養(yǎng)7d后組織塊周圍長出梭形細(xì)胞，經(jīng)鑒定成功獲得了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；許韌等[18]利用膠原酶、透明質(zhì)酸酶和氯化鈣溶液消化處理新生兒臍帶，2 cm 的臍帶可分離得到約4.2×105個間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖4 間充質(zhì)干細(xì)胞分離流程示意圖Fig.4 Work flow of isolation of mesenchymal stem cells

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可從來源更為廣泛、易得的脂肪組織中分離獲得，是一種理想的培養(yǎng)肉種子細(xì)胞。其分離方法主要為酶消化法。張雅群等[19]采用I 型膠原酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化分離得到大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，每mL 獲得1.34×105個細(xì)胞；Yao 等[20]對脂肪組織使用機(jī)械力進(jìn)行反復(fù)破碎，以10 mL/s 流速在兩個10 mL 規(guī)格的注射器之間來回機(jī)械處理脂肪組織1 min，待脂肪組織呈乳狀物后再使用膠原酶消化，每毫升脂肪組織可得到約9.9×104個細(xì)胞。

3.2 高效無血清培養(yǎng)基研制

3.2.1 干細(xì)胞增殖及功能調(diào)控化合物 培養(yǎng)基是細(xì)胞在體外培養(yǎng)一切營養(yǎng)物質(zhì)的來源，高效、低成本培養(yǎng)基的研制是細(xì)胞培養(yǎng)肉工業(yè)化生產(chǎn)的先決條件。由于體、內(nèi)外環(huán)境的巨大差異，通常情況下動物干細(xì)胞的體外增殖能力有限，且分化能力也會隨體外培養(yǎng)時間的增加而大幅下降。因此，首先需要對各類型干細(xì)胞分裂增殖、成肌/成脂分化過程的關(guān)鍵調(diào)控因子以及相關(guān)信號通路進(jìn)行解析，找到有效促進(jìn)細(xì)胞增殖、特性維持、功能調(diào)控的化合物，這些化合物并非完全來自基礎(chǔ)培養(yǎng)基或胎牛血清，可以利用高通量篩選的方法從天然活性化合物庫、小分子化合物庫中篩選得到。

目前，對于肌肉干細(xì)胞已有相關(guān)研究，多個研究團(tuán)隊報道了具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的化合物（表2）。Lei 等[21]得到促進(jìn)豬肌肉干細(xì)胞體外長期增殖的細(xì)胞因子組合，可減少50%的胎牛血清使用量。Fang 等[22]使用價格低廉的食品級小分子化合物維生素C 促進(jìn)豬肌肉干細(xì)胞體外增殖及成肌分化。Liu 等[23]利用小分子激活劑YAP 實現(xiàn)了高密度培養(yǎng)，減少了培養(yǎng)基的使用。Leng 等[24]通過體外添加花生四烯酸，促進(jìn)了牛肌肉干細(xì)胞的增殖和成肌。

表2 肌肉干細(xì)胞增殖及功能調(diào)控化合物Table 2 Compounds that promote the proliferation of muscle stem cells

3.2.2 血清替代化合物 胎牛血清中含有豐富的細(xì)胞生長必需營養(yǎng)成分，對動物細(xì)胞，特別是干細(xì)胞體外存活和生長具有重要作用。然而，在細(xì)胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)過程中，使用胎牛血清不僅使得培養(yǎng)基成本大幅提高，并且違背了細(xì)胞培養(yǎng)肉避免動物屠宰的初衷，因此需對胎牛血清成分進(jìn)行研究，建立化學(xué)成分的血清替代物成分庫。目前已有多種組分可作為血清替代物，主要包括能源物質(zhì)、激素、生長因子、蛋白質(zhì)、蛋白水解物、氨基酸、維生素、微量元素、脂類、抗剪切保護(hù)劑等，詳見表3。

表3 常見的血清替代物Table 3 Common serum substitutes

3.2.3 干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 在獲得一系列促進(jìn)干細(xì)胞增殖以及具有血清替代作用的化合物后，需針對特定的細(xì)胞類型，基于統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行多種化合物的復(fù)配研究，確定有效組合后再通過響應(yīng)面分析等手段優(yōu)化各化合物的使用濃度，最終開發(fā)出細(xì)胞類型特異性的無血清完全培養(yǎng)基。目前，已有研究團(tuán)隊成功研發(fā)出肌肉干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基用于細(xì)胞增殖或分化誘導(dǎo)，并發(fā)表相關(guān)論文或?qū)＠ū?）。

表4 肌肉干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基研究總結(jié)Table 4 Summary of serum-free medium for muscle stem cells

3.3 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)體系

3.3.1 微載體材料及制備 隨著種子細(xì)胞分離提取方法的改善，低成本細(xì)胞培養(yǎng)基的開發(fā)，細(xì)胞培養(yǎng)肉種子細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)將成為產(chǎn)業(yè)化核心技術(shù)之一。首先，因細(xì)胞培養(yǎng)肉的種子細(xì)胞多為貼壁細(xì)胞，故需要借助微載體進(jìn)行培養(yǎng)，于反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。微載體是一種固體細(xì)胞生長支持基質(zhì)，通常為直徑在微米級別的球體，球體表面或內(nèi)部能使細(xì)胞貼附，主要用于生物反應(yīng)器系統(tǒng)中貼壁細(xì)胞的生長[31]。與單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，球體擁有更大的表面積與體積比，因此使用微載體可大幅提高細(xì)胞培養(yǎng)的密度。目前，已有多種類型的培養(yǎng)動物細(xì)胞，即哺乳動物、鳥類、魚類和昆蟲細(xì)胞通過微載體技術(shù)成功培養(yǎng)[32-34]。

制備微載體的生物材料大致可分為不可降解、可降解但不可食用、可食用3 種類型。早期微載體一般基于聚乳酸-羥基乙酸、聚羥乙基甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、聚苯乙烯和聚氨酯聚合物組成[35]。然而，這些高分子聚合物通常不可降解，也不可食用，在培養(yǎng)肉應(yīng)用方面受到較大的限制，因此可食用微載體的研制對細(xì)胞培養(yǎng)肉具有重要意義。Park 等[36]以魚明膠為材料，制備出具備輸送營養(yǎng)物質(zhì)能力的可食用微載體，成功使小鼠肌肉干細(xì)胞貼壁、增殖和分化，并培養(yǎng)出高細(xì)胞密度的肌肉干細(xì)胞片層，最終通過物理疊加和食品后加工的方式生產(chǎn)出細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)品。Norris 等[37]使用油包水乳液作為明膠微粒子的模板，研制出具有凹槽拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、可伸縮性的可食用微載體，并利用該微載體培養(yǎng)C2C12 成肌細(xì)胞和牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，細(xì)胞成功增殖和分化產(chǎn)生肌肉微組織。隨后，通過離心收集攜帶細(xì)胞的微載體制作成可烹調(diào)的肉餅，該肉餅在烹飪過程中形狀得到較好地維持并能夠正常褐變。

3.3.2 反應(yīng)器放大工藝 隨著細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)在實驗室水平研究的逐步成熟，如何建立規(guī)模化技術(shù)體系成為細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題。在動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中，生物反應(yīng)器是不可或缺的關(guān)鍵設(shè)備。生物反應(yīng)器可以提供一個類似于體內(nèi)環(huán)境的三維空間，并搭配探針或傳感器能夠自動檢測內(nèi)部環(huán)境并實時動態(tài)調(diào)整，從而實現(xiàn)大規(guī)模、高密度的動物細(xì)胞培養(yǎng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)肉的產(chǎn)量。目前常用的生物反應(yīng)器類型有攪拌式生物反應(yīng)器、波浪式生物反應(yīng)器及氣升式生物反應(yīng)器。其中，攪拌式生物反應(yīng)器在生物行業(yè)內(nèi)廣泛應(yīng)用，其優(yōu)點在于應(yīng)用工藝較為成熟，罐內(nèi)傳氧與傳質(zhì)較好，缺點是剪切力較大，可能會對細(xì)胞造成一定損傷[38]。此外，WAVE 波浪生物反應(yīng)器也是細(xì)胞培養(yǎng)良好的設(shè)備，其采用非介入的波浪式搖動混合，避免了攪拌漿葉端和鼓泡對細(xì)胞的傷害，提供溫和低剪切力、高溶氧的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，然而，其需要配套價格較高的一次性反應(yīng)袋，且培養(yǎng)規(guī)模通常限制在200 L 以內(nèi)[39]。氣升式生物反應(yīng)器適用于較大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，其液體湍動溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小，對細(xì)胞的損傷較小，氧的傳遞效率高，然而，其在高密度培養(yǎng)時混合不夠均勻[40]?？梢姡枰约?xì)胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)為目的進(jìn)行生物反應(yīng)器裝備的選擇、改良，以及控制參數(shù)的優(yōu)化。

細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝的研發(fā)和建立需經(jīng)歷小試、中試、放大等過程，各個環(huán)節(jié)所使用的生物反應(yīng)器類型和規(guī)模各不相同。生物反應(yīng)器內(nèi)部存在復(fù)雜的氣、液兩相或氣、液、固3 相的流動、傳遞及反應(yīng)過程，因此生物反應(yīng)器的放大涉及生物特征、反應(yīng)動力學(xué)、流體力學(xué)、傳質(zhì)傳熱、自動控制等跨學(xué)科復(fù)雜原理，研究過程十分復(fù)雜。通?；谛≡嚰爸性嚨脑囼灁?shù)據(jù)，綜合CFD 建模與仿真、大數(shù)據(jù)共享與分析、智能算法等技術(shù)手段，根據(jù)參數(shù)以及生物反應(yīng)器和細(xì)胞系特性進(jìn)行理性工藝放大。此外，通常將工藝控制系統(tǒng)設(shè)計成模塊化形式，包含設(shè)備模型（Physical Model）和過程順序控制模型（Procedural Model）。通過罐溫控制模塊、罐壓控制模塊、pH 控制模塊、DO 溶氧控制模塊、攪拌器控制模塊等多種模塊的自動化調(diào)節(jié)，可實現(xiàn)生物反應(yīng)器內(nèi)部環(huán)境的實時穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。Udomsom 等[41]開發(fā)了一種帶有控制程序的可編程生物反應(yīng)器和實時pH 監(jiān)測的新型pH傳感器，允許其每個組件自動操作，并利用該生物反應(yīng)器實現(xiàn)了小鼠成纖維細(xì)胞的自動化培養(yǎng)，與常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。

3.4 三維培養(yǎng)及組織塑形

三維塑形作為培養(yǎng)肉產(chǎn)品生產(chǎn)最重要的環(huán)節(jié)，是將大規(guī)模擴(kuò)增得到的細(xì)胞接種于細(xì)胞支架上進(jìn)行三維培養(yǎng)，使細(xì)胞分化形成細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)品的過程。目前已有多種三維細(xì)胞培養(yǎng)及組織塑形技術(shù)可用于培養(yǎng)肉產(chǎn)品制備，包括固體支架或模具、3D 生物打印、靜電紡絲和片層堆疊技術(shù)等（圖5）。

圖5 培養(yǎng)肉三維塑形方式Fig.5 3D molding of cultured meat

3.4.1 固體支架或模具 固體支架或模具塑形及培養(yǎng)技術(shù)是將細(xì)胞接種于固體支架或模具中并進(jìn)行三維培養(yǎng)，使細(xì)胞增殖分化進(jìn)而形成肌纖維、脂肪等組織，再經(jīng)加工獲得塊狀細(xì)胞培養(yǎng)肉[42]。水凝膠由具有高細(xì)胞相容性的聚合物通過物理或化學(xué)方法進(jìn)行交聯(lián)制得，因其結(jié)構(gòu)接近細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），故可滲透細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)素，是影響細(xì)胞三維培養(yǎng)過程的核心因素[43]。Zhu 等[44]設(shè)計了一種用于細(xì)胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)的模具，并將豬肌肉干細(xì)胞與膠原蛋白水凝膠混合注入模具中塑形，經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)獲得網(wǎng)狀豬肌肉組織。然而，水凝膠存在易降解且機(jī)械性能不足的缺陷，與之相比，植物蛋白支架具有穩(wěn)定的海綿狀結(jié)構(gòu)，可為接種細(xì)胞的生長和分化提供所需的機(jī)械穩(wěn)定性[45]。Ben-Arye 等[46]利用組織化植物蛋白（Textured vegetable protein，TVP）作為細(xì)胞支架進(jìn)行成肌細(xì)胞的三維培養(yǎng)，研究表明TVP 支架具有支持細(xì)胞生長和細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用，并促進(jìn)肌肉組織的形成。

3.4.2 3D 生物打印 3D 生物打印塑形是利用3D 生物打印機(jī)的擠壓式打印模式，將含細(xì)胞和非細(xì)胞成分的生物墨水構(gòu)建為復(fù)雜組織，并經(jīng)過長時間培養(yǎng)形成培養(yǎng)肉的塑形方式。打印產(chǎn)品的性能取決于生物墨水的生化特性、流變性等材料屬性，生物墨水取材常為可食用的多糖或蛋白質(zhì)組成的聚合物，比如膠原蛋白、明膠、絲素蛋白、纖連蛋白、角蛋白等[47]，均具有良好的生物相容性。該類材料通常也具備合適的打印特性，即擠出性、細(xì)絲保真度和溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變性[48]。3D 生物打印塑形的優(yōu)勢在于可以調(diào)節(jié)樣品形狀和孔隙大小，精確地定位并分配細(xì)胞和非細(xì)胞成分[49]，且允許多種生物墨水材料同時打印[50]。近年來，將3D 生物打印塑形應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)肉塑形的案例層出不窮，如Kim 等[51]以纖維蛋白原、明膠、透明質(zhì)酸和聚己內(nèi)酯為生物墨水材料，與牛衛(wèi)星細(xì)胞混合并通過3D 打印構(gòu)建出牛骨骼肌組織；Oliveira 等[52]以結(jié)冷膠和乳清分離蛋白為生物墨水材料，與肌肉干細(xì)胞混合并通過3D 打印構(gòu)建出可食用的培養(yǎng)肉產(chǎn)品。

3.4.3 靜電紡絲 靜電紡絲技術(shù)是利用靜電作用力將明膠等高聚物溶液以一定流速擠出注射器針頭形成微納米級超細(xì)纖維，隨后將細(xì)胞接種于超細(xì)纖維間隙并誘導(dǎo)分化為組織的塑形方式[53]。該超細(xì)纖維可支持細(xì)胞的黏附并為其提供氧氣和營養(yǎng)素的輸送間隙[54]，且該纖維細(xì)絲排列一致，有助于促進(jìn)肌肉纖維的形成。MacQueen 等[55]通過靜電紡絲技術(shù)制備出明膠纖維細(xì)絲，并將兔成肌細(xì)胞和牛平滑肌細(xì)胞接種在明膠纖維細(xì)絲上，經(jīng)長時間培養(yǎng)形成完整組織，并證明培養(yǎng)肉制品與真實肌肉具有類似的結(jié)構(gòu)和機(jī)械特性。Apsite 等[56]以甲基丙烯酸海藻酸鹽（AA-MA）和聚己內(nèi)酯為紡絲原料制作出雙層纖維支架，并成功接種骨骼肌細(xì)胞形成功能性肌肉組織。

3.4.4 片層堆疊 片層堆疊塑形技術(shù)是將細(xì)胞接種于微載體上，經(jīng)增殖、誘導(dǎo)分化形成完整細(xì)胞片層，并通過多片層堆疊得到培養(yǎng)肉產(chǎn)品。該塑形方式節(jié)省了細(xì)胞消化步驟，無需去除用于細(xì)胞擴(kuò)培的微載體，在細(xì)胞培養(yǎng)肉的工業(yè)化生產(chǎn)中具有明顯優(yōu)勢。該方法使用的微載體需由可食用材料制成，如明膠、纖維素、交聯(lián)葡聚糖、多聚半乳糖醛酸等[57]，且表面覆蓋膠原蛋白、纖連蛋白、層黏連蛋白等以促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化[58]。首先將細(xì)胞接種于微載體上，培養(yǎng)形成具有高表面積/體積比的細(xì)胞片層，再將數(shù)十片細(xì)胞片層堆疊，形成整塊細(xì)胞培養(yǎng)肉。Park 等[36]以明膠為原料，運(yùn)用該塑形方式實現(xiàn)了培養(yǎng)肉的制備，并將培養(yǎng)肉產(chǎn)品與真實肉類進(jìn)行比較，證明其質(zhì)構(gòu)特性與雞胸肉相近。

4 細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)化面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)

1）降低生產(chǎn)成本 因細(xì)胞培養(yǎng)肉的成本主要來自于培養(yǎng)基，故需從降低培養(yǎng)基的單位成本和減少培養(yǎng)基用量兩方面著手攻關(guān)。在降低培養(yǎng)基單位成本方面，研制無血清培養(yǎng)基是首要環(huán)節(jié)；其次還需優(yōu)化培養(yǎng)基組分及配比，以增強(qiáng)培養(yǎng)基的促增殖/分化效力，同時建立昂貴組分的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)體系以降低成本。此外，需研發(fā)和建立高密度的細(xì)胞培養(yǎng)體系，減少培養(yǎng)基用量，這對降低培養(yǎng)肉的生產(chǎn)成本也起重要作用。

2）擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模 目前，雖然很多研究團(tuán)隊和企業(yè)都已實現(xiàn)小規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)肉制備，但是工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)仍具有挑戰(zhàn)。隨著生物反應(yīng)器體積的不斷擴(kuò)大，為實現(xiàn)均勻混合將不斷加大攪拌或通氣速率，剪切力或氣泡破裂導(dǎo)致的細(xì)胞損傷會更加嚴(yán)重，因此需要開發(fā)適用于細(xì)胞培養(yǎng)肉工業(yè)化生產(chǎn)的反應(yīng)器裝置并明確最佳的控制參數(shù)。此外，當(dāng)細(xì)胞大量增殖后如何在反應(yīng)器內(nèi)創(chuàng)造一個適合細(xì)胞分化形成肌纖維/脂肪細(xì)胞的三維環(huán)境及營養(yǎng)傳輸方式也需進(jìn)一步探討。

3）提升風(fēng)味品質(zhì) 肉制品的風(fēng)味取決于其中可溶性糖、游離氨基酸、游歷脂肪酸以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量。從生理結(jié)構(gòu)來看，真實肌肉組織含有肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，每種細(xì)胞都含有獨(dú)特的化學(xué)成分，這些成分共同構(gòu)成了肉的風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)。相比而言，大部分細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)品由單種細(xì)胞和細(xì)胞支架、植物蛋白構(gòu)成，組成和結(jié)構(gòu)較為單一，呈味物質(zhì)含量相對較少，因此尚需開發(fā)含有多種細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)品，同時添加風(fēng)味營養(yǎng)成分，從而提升細(xì)胞培養(yǎng)肉制品的風(fēng)味品質(zhì)。

5 細(xì)胞培養(yǎng)肉未來重點攻關(guān)方向

為進(jìn)一步提高細(xì)胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)效率，降低成本，提升產(chǎn)品風(fēng)味與營養(yǎng)，推動細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，未來細(xì)胞培養(yǎng)肉研究應(yīng)聚焦以下4 個方面：

1）構(gòu)建培養(yǎng)肉良種細(xì)胞資源庫 選育畜、禽、水產(chǎn)動物優(yōu)良品種，研發(fā)肌肉干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞培養(yǎng)肉種子細(xì)胞的高效、低成本分離提取方法，探索安全、高效的細(xì)胞永生化技術(shù)；制定種子細(xì)胞鑒定和病原微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建種類豐富、品質(zhì)優(yōu)良的種子細(xì)胞資源庫，支撐細(xì)胞培養(yǎng)肉基礎(chǔ)研究與應(yīng)用。

2）深化組織發(fā)育機(jī)理基礎(chǔ)研究 根據(jù)動物肌肉、脂肪等組織的胚胎及成體發(fā)育過程，從蛋白、非編碼RNA、轉(zhuǎn)錄因子等多維度解析成肌/成脂命運(yùn)決定因子；研究肌肉干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等的體內(nèi)微環(huán)境的理化特性和細(xì)胞內(nèi)、外信號傳遞過程，明確調(diào)控各類型細(xì)胞靜息、激活、分裂等不同狀態(tài)的分子機(jī)制，強(qiáng)化完善細(xì)胞培養(yǎng)肉基礎(chǔ)科學(xué)理論。

3）建立無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)體系 篩選及研究有效調(diào)控各類種子細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子、維生素、蛋白、活性肽、天然化合物等營養(yǎng)組分；分析細(xì)胞各發(fā)育階段的營養(yǎng)偏好和代謝特點，構(gòu)建促進(jìn)種子細(xì)胞長期穩(wěn)定增殖和支持肌纖維/脂肪高效產(chǎn)生的無血清培養(yǎng)技術(shù)體系，形成國際領(lǐng)先的細(xì)胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)原創(chuàng)技術(shù)路線。

4）開發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)肉智能制造系統(tǒng)及裝備 研發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)肉大規(guī)模生物反應(yīng)器，借助計算流體力學(xué)、時空多尺度耦合仿真等技術(shù)建立生物過程多層級動態(tài)智能模型，實現(xiàn)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的精準(zhǔn)調(diào)控與理性放大；構(gòu)建生物過程數(shù)字孿生系統(tǒng)，形成集成設(shè)計、仿真、管理的細(xì)胞培養(yǎng)肉制造過程全流程數(shù)字化技術(shù)平臺，推進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)肉的工業(yè)化發(fā)展。