骨折愈合中誘導(dǎo)H型血管形成因素的研究進(jìn)展*

向煒 黃山峻 曹家全 陳孝均 劉安銘 吳佳奇

骨折愈合是一個(gè)時(shí)空調(diào)控的再生過程，理想情況下骨折可完整恢復(fù)且沒有纖維瘢痕形成[1]。目前，骨折的治療已取得了巨大進(jìn)展，但仍有5%～10%的骨折因?yàn)橹委煵划?dāng)或其他原因?qū)е鹿钦垩舆t愈合，甚至不愈合。從骨折愈合的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，除了軟骨區(qū)域外，骨是高度血管化、代謝活躍的組織[2]，血管生成和骨生成相互耦合[3]，從而維持正常骨的形態(tài)和功能。近年來，骨科領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)了一種可成骨并促進(jìn)骨折愈合的動(dòng)脈分支亞型（H 型血管），是一種高表達(dá)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（PECAM-1/CD31）和內(nèi)皮黏蛋白的毛細(xì)血管，主要分布在骨內(nèi)膜和干骺端，周圍有豐富的Osterix+骨祖細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，可以增加骨量，加速骨形成[4]。眾所周知，血管再生在骨折愈合中起著關(guān)鍵作用，血管的形成將為骨折愈合提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、分泌活躍生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)運(yùn)代謝產(chǎn)物，從而增強(qiáng)血管和成骨細(xì)胞間的通信，加強(qiáng)血管和成骨耦合[5]。骨折后的前2 周是血管生成-成骨耦合的關(guān)鍵窗口，在此過程中新生血管的生長(zhǎng)對(duì)骨折愈合起了不可替代的作用。因此，在骨折愈合窗口期使用H 型血管誘導(dǎo)劑促進(jìn)H 型血管形成，恢復(fù)骨折處血供，這將是一種促進(jìn)骨折愈合的可靠的治療新方法。本文旨在綜述誘導(dǎo)H 型血管形成的因素并歸納其可能形成的主要機(jī)制，為骨折愈合相關(guān)研究提供一個(gè)新的視角。

1 藥物因素

1.1 去鐵胺（DFO）DFO 是一種低氧模擬劑，已被FAD 批準(zhǔn)用于治療輸血鐵過量疾病，其不僅可用于治療缺血性疾病，還可作為脯氨酸羥化酶抑制劑（PHDi）和血管生成興奮劑。在移植BMSCs 的大鼠中，使用去鐵胺模擬組織缺氧環(huán)境發(fā)現(xiàn)，去鐵胺可通過增強(qiáng)SDF-1/CXCR4 信號(hào)軸通路功能促進(jìn)BMSCs 靶向歸巢，加速BMSCs 在缺血組織中的分化，促進(jìn)缺血皮瓣血管化，增加皮瓣缺血缺氧處細(xì)胞因子的表達(dá)，從而改善局部血流，減少壞死面積，有助于骨折處血管的生成及周圍損傷組織的修復(fù)[6]。還發(fā)現(xiàn)去鐵胺可以穩(wěn)定HIF-1α 的表達(dá)，激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，上調(diào)下游SDF-1、VEGF等因子的表達(dá)從而有效地促進(jìn)EPCs 向損傷處遷移、靶向歸巢，提高缺血組織血管化[7]。去鐵胺不僅可通過促進(jìn)骨內(nèi)H 型血管形成改善骨密度[8]，還在牽張成骨和小鼠股骨骨折愈合過程中發(fā)現(xiàn)可提高骨的再生能力。在愈傷組織部位，去鐵胺螯合鐵觸發(fā)血管生成，可以抑制HIF-1α 的脯氨酸羥基化，使HIF-1α 積累，引起核易位、二聚作用與HIF-1β，反式激活VEGF 和其他下游介質(zhì)的新血管的形成，因此，注射去鐵胺可以部分挽救切除卵巢小鼠受損的H 型血管[9]。在體外，去鐵胺已被證明可以促進(jìn)血管生成[10]，在動(dòng)物模型骨折部位連續(xù)注射去鐵胺時(shí)可增強(qiáng)骨痂新生血管生成，從而改善骨生成。去鐵胺通過刺激HIF-1α 表達(dá)促H 型血管增殖，以H 型血管聯(lián)合生成大量成骨轉(zhuǎn)錄因子Osx 為中心的高代謝成骨分化區(qū)域，可有效促進(jìn)節(jié)段性骨缺損修復(fù)[11]。有研究首次發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A（HSYA）與DFO 聯(lián)合用藥，上調(diào)HIF-1α 分泌，促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面新生血管相對(duì)細(xì)胞聚集，使傷口內(nèi)形成更多的血管，從而加速創(chuàng)面修復(fù)[12]。因此，去鐵胺促進(jìn)血管成骨耦合機(jī)制可以歸納為主要通過調(diào)節(jié)HIF-1α 引起下游細(xì)胞分子的集連反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)血管成骨耦合?；仡櫸墨I(xiàn)發(fā)現(xiàn)將DFO 與生物支架聯(lián)合用于促進(jìn)骨折愈合可能也是一種很好的治療方法。最近有DFO 在人體內(nèi)的首次應(yīng)用報(bào)道[13]，即將可植入式血管生成/成骨刺激劑HA-DFO，用于骨折后血管生成關(guān)鍵時(shí)期內(nèi)，將DFO 緩慢釋放至骨折部位。作者主要是對(duì)一名繼發(fā)于放療后上頜發(fā)育不全的年輕患者進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)DFO 通過上調(diào)HIF-1α 途徑間接刺激血管生成從而使治療區(qū)域的骨面積和骨密度增加，因此，可推測(cè)植入式緩慢釋放去鐵胺將會(huì)取得好的臨床療效，但其具體效果如何、具體注入體內(nèi)時(shí)間、劑量等仍需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。綜合現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：DFO 可通過調(diào)節(jié)HIF-1α 有效促進(jìn)H 型血管生成和成骨，有利于骨折后血供的建立從而促進(jìn)骨折愈合，但其具體治療的標(biāo)準(zhǔn)仍需大量實(shí)驗(yàn)深入研究。

1.2 雷帕霉素 雷帕霉素是一種免疫抑制劑，最早用于器官移植以減輕排斥反應(yīng)，后來發(fā)現(xiàn)也是一種有效的自噬誘導(dǎo)劑，近年來在實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)血管和骨生成的作用，可能會(huì)對(duì)H 型血管的形成也有很大的促進(jìn)作用。有關(guān)骨質(zhì)疏松的研究表明：鐵積聚可通過mTOR/STAT1/Cxcl9 通路損害骨質(zhì)疏松癥的骨再生，鐵積聚激活mTOR，而雷帕霉素作為mTOR 抑制劑，可改善骨丟失，促進(jìn)高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥的血管生成和成骨，從而增加骨量[14]。雷帕霉素可促進(jìn)骨折部位血管的生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，抑制破骨細(xì)胞的分化，從而在成骨和骨保護(hù)中發(fā)揮重要作用[15]，而且還可以通過抑制mTOR活性進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性，抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)骨折部位血管生成，加速骨折的有效愈合[16]。新近研究表明，在脊髓橫斷后，將聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）微球從施萬細(xì)胞（SC）負(fù)載的帶正電荷的富馬酸聚乙二醇支架中持續(xù)釋放雷帕霉素，可使軸突再生的能力增強(qiáng)并改善脊髓功能，促進(jìn)新生血管的正?；痆17]。但也有研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的雷帕霉素對(duì)骨愈合有不同的影響：使用中、低劑量的雷帕霉素可改善血管的數(shù)量、長(zhǎng)度和表面積[18]；如果持續(xù)或過多使用雷帕霉素將會(huì)抑制骨折愈合[19]，研究發(fā)現(xiàn)高劑量雷帕霉素可通過過度的抗增殖作用、自噬或抑制VEGF 的產(chǎn)生而損害血管形成或抗血管生成[17]，使血管數(shù)量、長(zhǎng)度和表面積下降到未植入細(xì)胞或藥物時(shí)的水平。在骨折部位血管的生成和成骨中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)過多的雷帕霉素劑量將會(huì)抑制血管生成使骨折延遲愈合，甚至不愈合；適當(dāng)?shù)膭┝繉?huì)促進(jìn)血管生成從而加速骨折愈合。很顯然，不同劑量的雷帕霉素和/或不同實(shí)驗(yàn)對(duì)象以及雷帕霉素的不同分子的作用機(jī)制都會(huì)對(duì)骨和血管的作用有不同的影響，因此，雷帕霉素雖然有研究表明可促進(jìn)血管和成骨耦合，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1.3 紅景天苷 藏藥紅景天具有活血化瘀、通脈止痛、扶正固本和補(bǔ)腎強(qiáng)身等功效?，F(xiàn)代研究表明：紅景天含有40 多種化合物，主要成分為紅景天苷、酪醇等，具有抗缺氧、抗病毒、抗衰老以及神經(jīng)系統(tǒng)的雙向調(diào)節(jié)作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，紅景天可以促進(jìn)骨折部位血管新生以及對(duì)成骨具有保護(hù)作用，其中紅景天苷（salidroside，SAL）是最重要的成分，具有上調(diào)成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）促進(jìn)骨生成，在低氧和常氧條件下，SAL 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及成管都有明顯的促進(jìn)作用。SAL 通過調(diào)節(jié)HIF-1α 信號(hào)通路改善骨折部位血供，促進(jìn)骨折部位血管和新骨的形成，并且可以很大程度改善骨的力學(xué)性能、韌性和強(qiáng)度，同時(shí)SAL 被證實(shí)可通過上調(diào)HIF-1α 信號(hào)通路，促進(jìn)其下游靶基因VEGF 表達(dá)促進(jìn)胎鼠跖骨的血管新生[21]，能直接和間接誘導(dǎo)ECs 的增殖、遷移和毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成，并在胎鼠長(zhǎng)骨中產(chǎn)生血管生成活性因子，通過HIF-1α 介導(dǎo)的VEGF 誘導(dǎo)骨組織血管生成，促進(jìn)血管和骨生成的偶聯(lián)[22]，并可以有效上調(diào)bFGF、VEGF 等細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)血管新生，改善成骨細(xì)胞的供血供氧狀態(tài)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟，調(diào)節(jié)骨代謝動(dòng)態(tài)平衡，最終骨化形成骨組織[23]。紅景天苷作為中藥紅景天里的重要成分，對(duì)骨折部位血管形成具有重大的促進(jìn)作用，其機(jī)制大致歸納為：一可直接上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 促進(jìn)成骨；二通過調(diào)節(jié)HIF-1α，使下游靶基因VEGF 等細(xì)胞因子充分表達(dá)，從而調(diào)節(jié)H 型血管形成，促進(jìn)血管成骨耦合。紅景天苷的臨床應(yīng)用有利于發(fā)揮中醫(yī)藥對(duì)骨折愈合的作用，但其促進(jìn)H 型血管形成的具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。

1.4 其他藥物 在骨折局部使用氯化錳，使骨痂中細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外VEGF-A 和VEGF-C 的增加，從而增加骨折骨痂處骨膜下血管生成，促進(jìn)成骨[24]。層粘連蛋白α4 鏈功能肽修飾脫鈣骨基質(zhì)支架材料可促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附并顯著促進(jìn)H型血管的生成，從而在骨缺損修復(fù)中實(shí)現(xiàn)血管生成和骨再生的有效耦聯(lián)[25]。中成藥骨疏康（GSK）可通過增強(qiáng)HIF-1α 的表達(dá)誘導(dǎo)H 型血管并促進(jìn)骨形成[26]。目前H 型血管形成機(jī)制不唯一，除了通過增強(qiáng)HIF-1α 的表達(dá)誘導(dǎo)H 型血管并促進(jìn)成骨之外，還有通過促進(jìn)PDGF-BB 分泌增加，從而促進(jìn)H 型血管形成，誘導(dǎo)成骨。黃芪總黃酮（TFRD）在大鼠牽張成骨（DO）模型中可通過PDGFBB/PDGFR-β代替HIF-1α/VEGF 軸，加快H 型血管形成，并增強(qiáng)血管成骨耦合[27]。在骨質(zhì)疏松小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，注射肉葉蕓香堿（harmine）后可抑制破骨前細(xì)胞向破骨細(xì)胞的融合，使破骨前細(xì)胞和CM 中分泌的PDGF-BB 顯著增加，使小鼠骨質(zhì)中PDGF-BB 濃度和H 型血管數(shù)量明顯增加[28]。不同藥物誘導(dǎo)H 型血管形成雖然有個(gè)例報(bào)道，但其研究的實(shí)驗(yàn)支持較少，具體的促進(jìn)H 型血管形成機(jī)制不唯一，因此其誘導(dǎo)H 型血管促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制仍值得我們進(jìn)一步研究。

2 物理因素

2.1 超聲 目前，研究超聲在骨愈合過程中的作用已經(jīng)很普遍，尤其是低強(qiáng)度脈沖超聲。低強(qiáng)度脈沖超聲可以在細(xì)胞水平誘導(dǎo)機(jī)械力，而且已被證實(shí)可以調(diào)節(jié)血管和骨的形成[29]。從數(shù)學(xué)模型解釋超聲的作用發(fā)現(xiàn)，超聲在血管生成中起關(guān)鍵作用，可加速血管生成，縮短骨愈合時(shí)間[30]。例如，在大鼠創(chuàng)傷性椎體骨折模型中發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度脈沖超聲可通過在時(shí)間和空間上增加軟骨形成，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞成骨以及促進(jìn)H 型血管生成來加速創(chuàng)傷性椎體骨折愈合[31]；在體外和體內(nèi)HADSC/HUVEC 共培養(yǎng)中，使用低強(qiáng)度脈沖超聲可以增強(qiáng)血管生成，制備的膠原聯(lián)合Col/0.5HA 支架以及低強(qiáng)度脈沖超聲應(yīng)用于干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，可有效促進(jìn)血管生成[32]。研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度脈沖超聲處理可以激活YAP/TAZ，并將其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中激活靶基因，該過程可以被siYAP 滅活，被shLATS1/2 激活，通過低強(qiáng)度脈沖超聲治療，與Hippo 通路的交叉作用啟動(dòng)血管生成，從而促進(jìn)骨折愈合[33]。在使用低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)13 名腓骨延遲愈合患者的研究中發(fā)現(xiàn)，血管大小和類骨質(zhì)體積之間有顯著的相關(guān)性，在腓骨延遲愈合患者的骨中，低強(qiáng)度脈沖超聲增加血管體積，使延遲愈合中類骨質(zhì)體積增加，從而增加骨折部位血液供應(yīng)和灌注[34]，促進(jìn)血管生成和骨折愈合。超聲作為一種無創(chuàng)、無痛苦、便捷、價(jià)廉的方法，對(duì)骨折愈合具有顯著的競(jìng)爭(zhēng)力，雖然目前已有相當(dāng)多的實(shí)驗(yàn)研究，但其具體促進(jìn)血管成骨耦合的機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，具有深遠(yuǎn)的研究?jī)r(jià)值。

2.2 機(jī)械應(yīng)力 力學(xué)環(huán)境影響骨折愈合過程中的組織血管化，機(jī)械不穩(wěn)定力較穩(wěn)定力更能促進(jìn)早期血管生成和骨修復(fù)[35]。文獻(xiàn)[36]表明，血管重建和骨形成依賴于碎片間運(yùn)動(dòng)的方向，其中循環(huán)壓迫最能促進(jìn)血管重建從而刺激骨愈合過程。因?yàn)檠h(huán)機(jī)械載荷不僅對(duì)細(xì)胞行為（如增殖、遷移和分化）有直接影響，還對(duì)改變生化和生物物理環(huán)境有間接影響，在骨愈合早期，適度的運(yùn)動(dòng)會(huì)改善無血管化骨折血腫細(xì)胞或血管化不足的早期肉芽組織內(nèi)的供氧，從而促進(jìn)血管生成和骨折的愈合[37]。通過離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，機(jī)械牽張力能夠通過調(diào)控成骨細(xì)胞促進(jìn)相關(guān)血管生成因子的分泌[38]，在牽張成骨（DO）實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，形成的骨和血管比單純骨折愈合過程中更多，因此機(jī)械牽拉應(yīng)力有利于血管生成和成骨[27]。雖然有相關(guān)文獻(xiàn)論述機(jī)械應(yīng)力能夠促進(jìn)骨折部位血管生成以及成骨，但其具體機(jī)制仍然有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。機(jī)械應(yīng)力的改變，一方面可能會(huì)刺激骨折斷端與周圍組織的接觸，從而促進(jìn)周圍相關(guān)細(xì)胞因子的分泌和活躍；另一方面可能是通過機(jī)械應(yīng)力的改變使周圍血管收縮，加快血流速度，促進(jìn)周圍各種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)運(yùn)以及獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為進(jìn)一步促進(jìn)血管生成和成骨提供機(jī)會(huì)。

3 展望

大量研究表明H 型血管可以協(xié)調(diào)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞譜系細(xì)胞之間的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，并產(chǎn)生促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖和分化的因子，促進(jìn)骨愈合。作為一種新發(fā)現(xiàn)的動(dòng)脈分支的毛細(xì)血管亞型，H 型血管在骨折愈合中的形成將會(huì)為骨折部位提供充足的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，傳輸成血管和成骨生長(zhǎng)因子以及排出代謝產(chǎn)物，使血管生成和成骨處于動(dòng)態(tài)平衡之中，從而加快骨折愈合。通過回顧文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：（1）目前關(guān)于H 型血管在骨折愈合中形成的研究較多，但多處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，在臨床實(shí)驗(yàn)中不多，個(gè)體差異較大，需要更加深入的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以便進(jìn)一步驗(yàn)證H 型血管形成的機(jī)制，為進(jìn)一步靶向治療提供確切指導(dǎo)。（2）通過歸納H 型血管在骨折愈合中形成的誘導(dǎo)因素發(fā)現(xiàn)：藥物中去鐵胺誘導(dǎo)H 型血管形或成為重要因素；H 型血管形成的主要機(jī)制可能是通過調(diào)控HIF-1α，激活下級(jí)靶細(xì)胞因子相關(guān)作用，從而促進(jìn)血管生成和成骨。（3）超聲和機(jī)械應(yīng)力均是一種無創(chuàng)、痛苦小、便捷、價(jià)廉的方法，適合大眾人群，可行性較高，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，H 型血管形成的誘導(dǎo)因素主要集中在藥物、超聲和機(jī)械應(yīng)力方面，但缺乏系統(tǒng)的歸納，且已有相當(dāng)多的綜述論述H 型血管的形成機(jī)制，但促進(jìn)H 型血管形成的最主要機(jī)制尚不明確，通過對(duì)H 型血管在骨折愈合中形成的誘導(dǎo)因素進(jìn)行回顧發(fā)現(xiàn)：目前主要可能誘導(dǎo)因素為DFO；H 型血管形成的機(jī)制主要可能是HIF-1α 信號(hào)通路。本文雖然不能對(duì)所有已知的誘導(dǎo)因素進(jìn)行全面的論述，但筆者希望通過對(duì)涉及H 型血管在骨折愈合中形成的誘導(dǎo)因素回顧，找到主要可能誘導(dǎo)因素，并找到促進(jìn)H型血管在骨折愈合中形成的主要可能機(jī)制，為骨折愈合的相關(guān)研究提供一個(gè)新的視角。