野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙的舌組織學(xué)比較研究

王雪景，陳志男，陳佳艷，黃 鎮(zhèn)，符 文，彭亮躍，劉錦輝，徐永福，王冬武，肖亞梅，劉文彬*

（1.省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長沙 410081；2.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，長沙 410153）

黑斑蛙（Rananigromaculata）是蛙科、側(cè)褶蛙屬、喜群居的兩棲動(dòng)物。其味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值極高，深受廣大消費(fèi)者喜愛［1］。近年來，由于工農(nóng)業(yè)污染及對(duì)野生黑斑蛙的濫捕濫殺，黑斑蛙類的天然資源銳減，成為了紅色名錄上的瀕危物種。為了滿足消費(fèi)者需求，全國各地陸續(xù)開展了黑斑蛙的人工馴養(yǎng)與生態(tài)養(yǎng)殖，而野生黑斑蛙的食性較廣，主要是以昆蟲綱為主。根據(jù)大量試驗(yàn)，在人工誘導(dǎo)下建立條件反射，可改變其食性，順利取食人工餌料，達(dá)到馴化的目的。而味覺直接決定了動(dòng)物對(duì)攝取食物的感知和辨別，這種感知首先由舌頭決定，從而辨別對(duì)食物是接受還是拒絕［2］。同時(shí)，舌頭對(duì)食物在口腔內(nèi)的運(yùn)輸和吞咽起著非常重要的作用。所以，清楚其舌頭的基本結(jié)構(gòu)對(duì)于了解野生與馴食黑斑蛙的攝食有著重要的意義。

已有研究表明，哺乳動(dòng)物的舌表面有一層不同厚度的黏膜［3］，其上的乳頭具有機(jī)械和味覺功能，其超微結(jié)構(gòu)在不同動(dòng)物的形態(tài)中有所不同，可大體分成四種類型的乳頭，即絲狀乳頭（filiform papilla）、菌狀乳頭（fungiform papilla）、輪廓乳頭（circumvallate papilla）和葉狀乳頭（foliate papilla）［4-6］。絲狀乳頭厚，分布于整個(gè)舌背表面，并包含小突起。它們有助于控制食物，并在咀嚼過程中增加摩擦［7-8］。菌狀乳頭數(shù)量較少，多位于舌尖與舌緣，散于絲狀乳頭之間，含有大量的結(jié)締組織和鄰近的上皮層，呈“蘑菇”狀，內(nèi)有味蕾。固有層富含毛細(xì)血管，使乳頭外觀呈紅色。輪廓乳頭位于背表面的尾部區(qū)域，不同的物種，其數(shù)量、尺寸和形狀都不同，一般為7～9個(gè)，排列在界溝的前方，呈圓輪狀，周圍有深溝環(huán)繞，溝內(nèi)有味蕾，尾側(cè)區(qū)域的外邊緣是葉狀結(jié)構(gòu)，通過黏膜內(nèi)陷相互分離，參與與味覺有關(guān)的感覺系統(tǒng)［9-11］。葉狀乳頭位于舌的側(cè)緣，形成褶狀，其數(shù)量可能根據(jù)每個(gè)物種的進(jìn)化而變化［12］。

上述研究主要揭示的是哺乳動(dòng)物的舌形態(tài)結(jié)構(gòu)，然而對(duì)于兩棲類（特別是黑斑蛙）缺乏詳細(xì)組織學(xué)特征的報(bào)道。因此，本研究以馴食黑斑蛙與野生黑斑蛙為研究對(duì)象，從與攝食及消化相關(guān)的舌組織入手，采用光學(xué)顯微技術(shù)、透射和掃描電鏡技術(shù)對(duì)其舌組織進(jìn)行顯微和超微結(jié)構(gòu)的比較研究，以期為黑斑蛙的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和餌料的改良提供試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)，為黑斑蛙野生資源保護(hù)及開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從湖南南縣文建特種水產(chǎn)養(yǎng)殖合作社取1齡野生黑斑蛙和人工配合飼料喂養(yǎng)的馴食黑斑蛙各20只（均健康無病，活動(dòng)狀態(tài)正常）。野生黑斑蛙體重為（69.9±10.8）g，體長為（10.5±0.8）cm；馴食黑斑蛙體重為（87.4±15.6）g，體長為（11.7±0.4）cm。配合飼料的營養(yǎng)成分組成：水分9.34%、粗蛋白質(zhì)41.90%、粗脂肪5.78%、粗灰分9.48%。

1.2 主要試驗(yàn)藥品和儀器

藥品：戊二醛、磷酸緩沖液、冰醋酸、二甲苯、無水乙醇、苦味酸均購買于上海國藥集團(tuán)；鋨酸（鋨含量1%）購買于上海榕柏生物技術(shù)有限公司；蠟塊、蘇木精、伊紅、Epon 812樹脂均購買于上海生工生物工程有限公司。儀器：石蠟切片機(jī)（LEICA RM2015）、超薄切片機(jī)（LEICA UC7）、掃描電鏡（ZEISS EVO18）、透射電鏡（日立HT7700）。

1.3 石蠟切片

將黑斑蛙搗髓后迅速解剖，取舌組織固定于Bouin氏液中。制成5 μm石蠟切片后，經(jīng)蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，然后進(jìn)行組織學(xué)觀察。具體操作參考本小組發(fā)表的論文［13-16］。

1.4 掃描電鏡

將黑斑蛙搗髓后迅速解剖，取舌組織固定于2.5%的戊二醛中，2 h后加入1%鋨酸固定1 h，丙酮梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，于掃描電鏡下觀察并拍照。具體操作參考本小組發(fā)表的論文［16］。

1.5 透射電鏡

將黑斑蛙搗髓后迅速解剖，取舌組織固定于2.5%的戊二醛中，固定2 h后用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，1%的鋨酸固定后用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗3次，固定樣品經(jīng)酒精、丙酮梯度脫水，Epon 812樹脂包埋，制備超薄切片，透射電鏡下觀察。具體操作參考本小組發(fā)表的論文［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌組織顯微結(jié)構(gòu)的比較

通過對(duì)舌組織橫切面進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙二者都有角質(zhì)化的絲狀乳頭和菌狀乳頭。絲狀乳頭分布在整個(gè)舌背表面，并由主乳頭（圖1中的黑色箭頭）和次級(jí)乳頭（圖1中的藍(lán)色箭頭）構(gòu)成。菌狀乳頭位于舌尖和舌緣，去除上皮后可看到其上皮細(xì)胞呈火山狀（圖1中的紅色箭頭）。野生和馴食黑斑蛙的舌組織學(xué)結(jié)構(gòu)也存在一定的差異：野生黑斑蛙舌表面的絲狀乳頭相對(duì)更加發(fā)達(dá)，且角質(zhì)化程度比馴食黑斑蛙更明顯，可觀察到菌狀乳頭的角化程度不如絲狀乳頭。

圖1 野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌組織的顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 The microscopic structure of tongue tissue of wild Rana nigromaculata and domesticated Rana nigromaculata

2.2 野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌表面掃描電鏡的比較

根據(jù)圖2中野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌背面的掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)二者乳突背表面不規(guī)則，被復(fù)層鱗狀上皮所覆蓋，鱗狀上皮形成嵴（圖2b、2i中的紅色圓圈），表面可見菌狀乳頭的味覺孔（圖2a、2m中的紅色箭頭），菌狀乳頭分布于舌尖和舌緣的絲狀乳頭之間。相鄰單元格之間的單元格邊距增厚（圖2h、2o～2p中的黃色箭頭），形成輕微隆起。野生黑斑蛙舌背面的相鄰細(xì)胞之間的邊緣有一條微絨毛帶（圖2d中的黑色箭頭）。圖中可觀察到葉狀乳頭（圖2e、2o中的紫色箭頭），指狀的葉狀乳頭位于舌背側(cè)表面的邊緣，被一層非角化的鱗狀復(fù)層上皮覆蓋，每個(gè)乳頭由若干個(gè)薄片組成，組成的薄層被上皮裂隙分開，但是在這些類型的乳頭中看不到味蕾。與馴食黑斑蛙相比較來看，野生黑斑蛙舌表面的復(fù)層鱗狀上皮所覆蓋形成的嵴更加的不規(guī)則，角質(zhì)化程度相較于馴食黑斑蛙也更大。

圖2 野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌背面的掃描電子顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Scanning electron microstructures of dorsal tongue of wild and domesticated Rana nigromaculata

圖3舌截面的掃描電鏡分析顯示，野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙的舌背表面可見絲狀乳頭和菌狀乳頭。二者舌背表面絲狀乳頭最多，或成絲狀（圖3a～3c中的紅色圓圈），或成錐形（圖3d～3e中的黑色箭頭）。菌狀乳頭（圖3b、3d～3e中的紅色箭頭）基部比頂端寬，分布于背表面的舌尖和舌緣的絲狀乳頭之間。野生黑斑蛙的絲狀乳頭明顯比馴食黑斑蛙更發(fā)達(dá)。在高倍放大圖中多見細(xì)長的絲狀乳頭交錯(cuò)成網(wǎng)狀，而在馴食黑斑蛙中絲狀乳頭呈低錐形。而且，野生黑斑蛙成簇的絲狀乳頭的角化程度不如馴食黑斑蛙中呈低錐形的絲狀乳頭。絲狀乳頭分布于舌背側(cè)表面，有助于控制食物，并在咀嚼過程中增加摩擦。野生黑斑蛙食性比馴食黑斑蛙食性更加復(fù)雜，所以攝食器官舌頭表面的絲狀乳頭更加長且多。

圖3 野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌截面的掃描電子顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Scanning electron microstructures of tongue cross sections of wild and domestic Rana nigromaculata

根據(jù)圖4中野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌底面的掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)野生黑斑蛙的舌表面在高倍放大圖中可見絲狀乳頭成簇存在（圖4中的紅色圓圈）。馴食黑斑蛙舌表面的高倍放大的掃描電子顯微鏡圖中可見，乳突背表面不規(guī)則，被復(fù)層鱗狀上皮所覆蓋，鱗狀上皮形成嵴（圖4中的黑色箭頭）。菌狀乳頭分布于舌尖和舌緣的絲狀乳頭之間，表面可見其味覺孔（圖4d中的紅色箭頭）。野生黑斑蛙和馴食黑斑蛙的背側(cè)上皮與腹側(cè)上皮相比，腹側(cè)上皮薄，無角質(zhì)化，無乳頭。相鄰單元格之間的單元格邊距有增厚，形成輕微隆起。

圖4 野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌底面的掃描電子顯微結(jié)構(gòu)Fig.4 Scanning electron microstructures of undertongue of wild and domesticated Rana nigromaculata

2.3 野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌組織超微結(jié)構(gòu)的比較

如圖5中野生黑斑蛙和馴食黑斑蛙的舌頭腺體透射電鏡超微照片所示，與舌的背側(cè)上皮相比，腹側(cè)上皮較薄，無角化，無乳頭。由于與食物摩擦，舌頭磨損更大的背表面的上皮厚而堅(jiān)硬。舌心由骨骼肌纖維、結(jié)締組織和舌腺組成。肌纖維在三個(gè)平面上交叉，通常由結(jié)締組織（圖5b中的紅色圓圈）隔開。固有層和黏膜下層包含有血管（圖5d中左下角的紅星）和神經(jīng)纖維（圖5d中的黃色箭頭），其厚度較薄。唾液腺局限于舌的后部，由許多漿液腺泡（圖5c～5d中的黑色箭頭）和黏液腺泡（圖5a、5c～5d中的藍(lán)色箭頭）組成。小葉內(nèi)導(dǎo)管（圖5a中的紅色箭頭）周圍環(huán)繞著薄的結(jié)締組織纖維。細(xì)胞間（圖5d中白色箭頭）存在大量的細(xì)胞間連接。上皮淺層細(xì)胞中存在無定形碎片。透明角質(zhì)顆粒（圖5a、5d中的紅色橢圓）呈不規(guī)則或細(xì)長狀，電子密度高。游離神經(jīng)末梢被漿液腺泡包圍，周圍有幾個(gè)線粒體，中央部分有神經(jīng)絲。

圖5 野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙舌頭腺體透射電鏡超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Ultramicrostructure of tongue glands in wild and domesticated Rana nigromaculata by transmission electron microscopy

3 討論

黑斑蛙俗稱青蛙、田雞，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、低脂肪、高蛋白等優(yōu)點(diǎn)而被人們喜愛。近年來野生黑斑蛙數(shù)量已遠(yuǎn)不能滿足人們的需求，因此，人工馴食養(yǎng)殖逐漸興起。但要把以昆蟲類為主食的野生黑斑蛙成功馴食為以人工配合飼料為食的馴食蛙，首先第一步就是解決食物的攝取問題。而味覺直接決定動(dòng)物對(duì)攝取食物的感知和辨別，動(dòng)物可以對(duì)不同的味道做出不同的反應(yīng)，最終決定接受還是拒絕。舌頭又是一個(gè)重要的味覺器官，動(dòng)物攝食后首先由舌感覺基本的味覺。兩棲綱無尾目動(dòng)物的味覺器官一般被稱為味覺盤（taste disc）［18］，黑斑蛙的味覺盤主要位于舌背面的舌中部和舌尖的菌狀乳突的頂端，一個(gè)菌狀乳突僅其頂端具備一個(gè)味覺盤，菌狀乳突側(cè)壁上皮層中無味覺盤。舌尖上菌狀乳頭的積聚可能與預(yù)先選擇食物有關(guān)［19］。舌背面的絲狀乳突頂端上皮層中主要為黏液細(xì)胞，而舌腹面無乳突和味覺盤，上皮層中亦無黏液細(xì)胞。這與蛙捕食時(shí)，舌后端外翻拉長伸出口外黏捕食物是相符的［20］。舌背面菌狀乳突頂端的味覺盤絲狀乳和突頂端的黏液細(xì)胞分別對(duì)獵物的選擇和黏捕起一定的作用。

目前對(duì)于舌的研究主要集中于哺乳動(dòng)物的四種舌乳頭［21-25］，并且國內(nèi)外對(duì)于黑斑蛙的研究主要集中在對(duì)野生黑斑蛙的基礎(chǔ)研究、養(yǎng)殖、毒性物質(zhì)對(duì)胚胎或蝌蚪期生長發(fā)育的影響和黑斑蛙病害及防治等方面，而對(duì)黑斑蛙的舌組織學(xué)研究卻尚未見報(bào)道。因此，本研究從與攝食及消化相關(guān)的舌組織入手，采用石蠟切片、掃描電鏡和透射電鏡對(duì)野生和馴食黑斑蛙的組織學(xué)進(jìn)行了較詳細(xì)的比較研究。

在食肉目中，研究者們對(duì)貓、叢林犬、熊、黑背豺、老虎、獅子和波斯豹［26-33］等的舌頭進(jìn)行了研究，確定了其解剖學(xué)和組織學(xué)特征及區(qū)別，發(fā)現(xiàn)它們舌背黏膜內(nèi)襯都有復(fù)層鱗狀上皮，且舌乳頭可分為絲狀乳頭、菌狀乳頭、葉狀乳頭和輪廓乳頭，絲狀乳頭分布于整個(gè)舌背表面。這些類型的乳頭角質(zhì)化良好，由固有層結(jié)締組織支撐。一般來說，每個(gè)大的絲狀乳頭周圍都有小突起，且具有類似的上皮細(xì)胞層和薄的角質(zhì)化細(xì)胞。本試驗(yàn)中的石蠟切片研究表明，野生黑斑蛙與馴食黑斑蛙二者都有角質(zhì)化的絲狀乳頭和菌狀乳頭。絲狀乳頭分布在整個(gè)舌背表面，并由主乳頭和次級(jí)乳頭構(gòu)成，這與食肉動(dòng)物有相似之處。另有研究認(rèn)為，舌頭中絲狀乳頭的二級(jí)突起可以擴(kuò)展表面，使固體和半液體食物黏附到舌頭上［34］，并且在一些哺乳動(dòng)物的舌頭中也觀察到了這些過程（如駱駝和山羊）［35］。菌狀乳頭都位于舌尖和舌緣，去除上皮后，菌狀乳頭的上皮細(xì)胞呈火山狀，頂部有一個(gè)味蕾腔。在本研究中，二者在舌組織學(xué)結(jié)構(gòu)上存在一定的差異：野生黑斑蛙舌表面的絲狀乳頭相對(duì)更加發(fā)達(dá)，且角質(zhì)化程度比馴食黑斑蛙更明顯。這與野生黑斑蛙的食性是相關(guān)的。野生黑斑蛙相較與馴食黑斑蛙來說食性更加復(fù)雜，多取食活動(dòng)的昆蟲等，因此，這可能與野生黑斑蛙對(duì)食物選擇性的弱傾向有關(guān)。舌體中部也可見圓柱形絲狀乳頭。在食肉目的舌頭研究中也出現(xiàn)了有助于吞咽咀嚼食物團(tuán)的圓柱形絲狀乳頭，舌后乳頭變?yōu)閳A錐形，覆蓋整個(gè)舌根后部，上皮細(xì)胞增厚，舌前部基底上皮細(xì)胞高度相對(duì)更厚。所以可推測，作為攝食器官的舌頭，其上有助于抓食的結(jié)構(gòu)更加發(fā)達(dá)，而絲狀乳頭結(jié)構(gòu)厚且分布于整個(gè)舌背側(cè)表面，它們有助于控制食物，并在咀嚼過程中增加摩擦。

許多研究通過掃描電鏡觀察嚙齒動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)小鼠、豚鼠、美洲海貍等不同物種的舌乳頭的表面和結(jié)締組織核心的三維結(jié)構(gòu)有不同的形狀，且這些嚙齒類舌乳頭的類型在分類、形狀和味蕾的形態(tài)特征上表現(xiàn)出一定的共性和差異［7，36-40］。它們在中部和尾部區(qū)域可以發(fā)現(xiàn)細(xì)長的多絲乳頭，去除上皮后，絲狀乳頭頂端呈錐形，基部比頂端寬。大鼠的乳頭間區(qū)有細(xì)束，這與其他絲狀乳頭不同，且去除上皮后可觀察到火山狀的菌狀乳頭。本試驗(yàn)通過掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)的比較觀察，發(fā)現(xiàn)野生和馴食黑斑蛙都可以觀察到位于背表面尾部區(qū)域舌側(cè)的大尺寸輪廓乳頭，以及由上皮褶皺組成的葉狀乳頭，并也有平行的凹槽分隔開，同時(shí)可觀察到舌中部絲狀乳頭由較大的主乳頭和多根次級(jí)乳頭構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)與嚙齒動(dòng)物基本相似。但二者的亞顯微結(jié)構(gòu)也存在一定的差異：野生黑斑蛙舌表面的絲狀乳頭更加發(fā)達(dá)，上皮細(xì)胞增厚，舌前部基底上皮細(xì)胞更厚，角質(zhì)化程度比馴食黑斑蛙更大。這可能是因?yàn)?，吞咽過程中舌頭和食物之間的摩擦力更大，因此角質(zhì)化程度也更大。總之，動(dòng)物絲狀乳頭的類型和分布差異與年齡、食物和喂養(yǎng)以及咀嚼模式有關(guān)。

也有學(xué)者在偶蹄目中研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛、黑犀牛、印度羚、大角野綿羊、單峰駱駝、河馬等［41-54］動(dòng)物舌表面的三維結(jié)構(gòu)中，不同物種舌背表面乳頭的形態(tài)分布特征有共同點(diǎn)也有差異性。它們的真菌狀乳頭呈圓形，舌體的絲狀乳頭由一個(gè)主乳頭組成，與舌尖的絲狀乳頭相比較大。輪廓乳頭呈扁平橢圓形，乳頭周圍有半圓溝槽。大多舌核由骨骼肌纖維、結(jié)締組織和舌腺組成，肌纖維由結(jié)締組織分開，固有層和黏膜下層是含有血管和神經(jīng)的致密結(jié)締組織。唾液腺局限于舌頭的后部，由許多漿液細(xì)胞和少量黏液細(xì)胞組成，小葉內(nèi)導(dǎo)管內(nèi)覆鱗狀上皮細(xì)胞。本試驗(yàn)通過透射電鏡超微結(jié)構(gòu)的比較觀察發(fā)現(xiàn)，野生和馴食黑斑蛙的舌心也基本由骨骼肌纖維、結(jié)締組織和舌腺組成。肌纖維在三個(gè)平面上交叉，由結(jié)締組織隔開，固有層和黏膜下層厚度較薄，包含有血管和神經(jīng)纖維。唾液腺由許多漿液細(xì)胞和黏液細(xì)胞組成。黏液細(xì)胞已被證明有助于吞咽干食物，漿液細(xì)胞可能在非舌味蕾的味覺機(jī)制中發(fā)揮作用［32］。

綜上所述，本研究結(jié)果既豐富了黑斑蛙乃至兩棲類動(dòng)物舌組織學(xué)結(jié)構(gòu)的研究，同時(shí)又可為馴食黑斑蛙的人工配合飼料的改進(jìn)及野生黑斑蛙種質(zhì)資源的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。