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    抗、感西瓜根系分泌物鑒定及對(duì)枯萎病菌生長(zhǎng)的影響

    2023-01-11 02:56:58張玉錦周文麗崔夢(mèng)嬌耿二康苗巧藝楊嵩涵呂桂云
    中國(guó)瓜菜 2022年12期
    關(guān)鍵詞:抗病品種感病孢子

    張玉錦,周文麗,崔夢(mèng)嬌,耿二康,苗巧藝,楊嵩涵,呂桂云

    (河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 河北保定 071000)

    西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜?;停‵usarium oxysporumf. sp.niveum)寄生所引起的一種土傳病害[1],嚴(yán)重降低西瓜的產(chǎn)量及品質(zhì),從而導(dǎo)致病田減產(chǎn),一般減產(chǎn)20%~30%,嚴(yán)重可達(dá)50%~60%,甚至絕產(chǎn)[2]。已鑒定的生理小種有0、1、2、3,其中生理小種1 為我國(guó)優(yōu)勢(shì)小種[3]。目前,西瓜枯萎病常用的防治方法有化學(xué)藥劑、嫁接、輪作換茬、抗病育種等[4],但化學(xué)藥劑不能有效防治枯萎病的發(fā)生,并且極易造成環(huán)境污染;嫁接又操作繁瑣且極易降低果實(shí)品質(zhì);輪作防治容易受到土地資源的限制;抗病育種因抗病資源匱乏、抗病遺傳規(guī)律復(fù)雜,現(xiàn)階段商品品種中抗病品種還比較少,還未選育出能抗所有生理小種的品種。因此,枯萎病成為西瓜生產(chǎn)中的主要限制因素之一。

    根系分泌物是植物與土壤及土傳病菌相互作用的橋梁,其不僅可以通過(guò)改變土壤環(huán)境間接抑制土傳病菌,還可以通過(guò)自身作用直接抑制土傳病菌[5]。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)植物根系分泌物進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)香蕉抗感品種根系分泌物的酚酸含量在接菌前后發(fā)生了改變,接菌后抗病品種特有的對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸,以及含量多于感病品種的鄰苯二甲酸都對(duì)尖孢鐮刀菌古巴?;停‵usarium oxysporiumf. sp.cubense)4 號(hào)生理小種的生長(zhǎng)起抑制作用[6];抗病棉花品種根系分泌物中綠原酸含量多于感病品種,對(duì)病原菌的抑制作用較強(qiáng),耐病品種根系分泌物中綠原酸含量較少,對(duì)病原菌先促進(jìn)后抑制,感病品種根系分泌物中沒(méi)食子酸含量較高,其對(duì)菌絲生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用[7];甜瓜抗感品種根系分泌物中酚酸種類不同,抗病品種根系分泌物中含有鄰苯二甲酸二丁酯和苯甲酸芐基酯等,對(duì)病原菌有抑制作用,感病品種根系分泌物中含有鄰苯二甲酸、丁香酸、苯甲酸等,對(duì)病原菌有促進(jìn)作用[8]。在對(duì)棉花枯萎病[9]與煙草黑脛病[10]的研究中,抗病品種根系分泌物抑制病原菌生長(zhǎng),感病品種根系分泌物促進(jìn)病原菌生長(zhǎng)。但關(guān)于西瓜抗、感品種間根系分泌物的組分及其與枯萎病菌的相互作用還未見(jiàn)報(bào)道。

    筆者分別以2 個(gè)抗、感西瓜品種為材料,采用水培法和氣相色譜質(zhì)譜儀分析,研究不同抗性的西瓜品種在接菌與不接菌條件下,根系分泌物的組成成分及其對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢量的影響,進(jìn)一步明確根系分泌物接菌前后成分的變化及其對(duì)枯萎病菌生長(zhǎng)的影響,為闡明根系分泌物與枯萎病菌互作提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    西 瓜 品 種:Sugarlee,SL(抗 病 品 種,R);Calhoun Gray,CG(抗病品種,R);早佳8424,ZJ(感病品種,S);Sugarbaby,SB(感病品種,S)。其中SL,CG,SB 由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心許勇研究員惠贈(zèng),ZJ 從山東壽禾種業(yè)有限公司購(gòu)買??菸【硇》N1(Fusarium oxysporumf. sp.niveumrace 1)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施實(shí)驗(yàn)室提供,西瓜品種的抗病性已在前期試驗(yàn)中得到驗(yàn)證。

    1.2 方法

    試驗(yàn)于2021 年3—8 月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新試驗(yàn)園內(nèi)進(jìn)行。將西瓜種子用紗布包好后在1.5%的次氯酸鈉溶液中浸泡15 min,消毒后洗去黃色,于28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中催芽后播種。采用50 孔穴盤育苗,待西瓜2 葉1 心時(shí),換至裝有21 L 營(yíng)養(yǎng)液(Hoagland)的塑料盒中進(jìn)行水培,5 d 后進(jìn)行接菌處理。將生理小種1 接種到PL 培養(yǎng)基中,于搖床培養(yǎng)7 d后,經(jīng)過(guò)菌液過(guò)濾、離心,用超純水溶解孢子沉淀并調(diào)整濃度到5×108CFU·mL-1。接菌前換新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液,將孢子液倒入4 個(gè)接菌處理組中(Inoculation,In),接菌處理組中的孢子濃度最終為5×106CFU·mL-1[11],對(duì)照的4 個(gè)處理組不接菌(Uninoculation,Un),加入等量蒸餾水。共8 個(gè)處理組,每個(gè)處理3 盒,每盒16 株苗。在處理后的3、6、9、12 d 取樣收集根系分泌物,每組至少取3 株,3 次重復(fù)。從營(yíng)養(yǎng)液中取出幼苗后沖洗根部,將幼苗放入盛有超純水的錐形瓶中,超純水的量需沒(méi)過(guò)根系[12]。將錐形瓶在陽(yáng)光下放置4 h 后,倒出溶液并過(guò)濾,所得的濾液冷凍干燥至干。由于根系分泌物中所含物質(zhì)的極性有所不同,因此用丙酮、乙酸乙酯、石油醚、去離子水各3 mL 溶解根系分泌物凍干物,將溶解后的液體混合后放置4 ℃冰箱中。試驗(yàn)共4 個(gè)品種,每個(gè)品種進(jìn)行接菌和不接菌處理,各4 個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣3 次,共有96 管根系分泌物樣品。

    1.3 項(xiàng)目測(cè)定及方法

    1.3.1 根系分泌物成分分析 將處理后3、6、9、12 d 收集的溶解液各取2 mL,均勻混合后,用GC-MS 檢測(cè)溶解液中的成分。所用儀器由Agilent公司提供:6890 GC/5973 MSD,色譜柱為HP-5 MS毛細(xì)管柱。以He 作為載氣,1 mL·min-1的流速,1 μL 體積的進(jìn)樣量。程序升溫到柱溫80 ℃,0.5 min 后以15 ℃·min-1升溫,到230 ℃時(shí)停頓0.5 min,以20 ℃·min-1升 溫,到280 ℃時(shí) 停 頓20 min 后開(kāi)始測(cè)定。掃描范圍30~600 m·z-1,70 eV轟擊電壓,250 ℃離子源溫,四極桿溫度200 ℃全掃描方式。

    1.3.2 根系分泌物對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 制備PDA[13]培養(yǎng)基,在PDA 不燙手時(shí)加入過(guò)濾除菌后的根系分泌物,體積比為1∶2,對(duì)照組加入等量無(wú)菌水,混勻后倒入培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基凝固后在中央接種大小一致的枯萎病菌菌餅,試驗(yàn)重復(fù)3 次,隨后觀察根系分泌物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響;調(diào)整孢子懸浮液的濃度到1×103CFU·mL-1,將0.1 mL 的孢子懸浮液涂布于PDA 上,封口膜密封后,于28 ℃下倒置培養(yǎng),7 d 后計(jì)算菌落直徑[14]并記錄平板上的菌落數(shù),用于觀察根系分泌物對(duì)孢子萌發(fā)的影響。

    菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)率/%=(處理組菌落面積-對(duì)照組菌落面積)/(對(duì)照組菌落面積-菌餅面積)×100;

    菌絲生長(zhǎng)抑制率/%=(對(duì)照組菌落面積-處理組菌落面積)/(對(duì)照組菌落面積-菌餅面積)×100;

    孢子萌發(fā)促進(jìn)率/%=(處理組菌落數(shù)-對(duì)照組菌落數(shù))/對(duì)照組菌落數(shù)×100;

    孢子萌發(fā)抑制率/%=(對(duì)照組菌落數(shù)-處理組菌落數(shù))/對(duì)照組菌落數(shù)×100。

    1.3.3 根系分泌物對(duì)病原菌產(chǎn)孢的影響 在PL 培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌后的根系分泌物,體積比為1∶2,對(duì)照組加入等量的無(wú)菌水,混勻。將濃度為2×105CFU·mL-1的孢子懸液0.1 mL 加入到PL 培養(yǎng)基中,于25 ℃、125 r·min-1的搖床中培養(yǎng)。7 d 后經(jīng)過(guò)菌液過(guò)濾、離心,用去離子水溶解孢子沉淀,在顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)板記錄3 個(gè)相鄰視眼內(nèi)的孢子數(shù)。

    孢子產(chǎn)生促進(jìn)率/%=(處理組孢子數(shù)-對(duì)照組孢子數(shù))/對(duì)照組孢子數(shù)×100;

    孢子產(chǎn)生抑制率/%=(對(duì)照組孢子數(shù)-處理組孢子數(shù))/對(duì)照組孢子數(shù)×100。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用Microsoft Excel 2016、SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖,采用Duncan 新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)差異顯著性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 抗感西瓜品種根系分泌物成分的鑒定

    由表1 可知,抗、感西瓜品種根系分泌物中共檢測(cè)出10 大類,25 種物質(zhì)。只在抗病品種根系分泌物中鑒定出的物質(zhì)為十一烷和苯酚,CG 接菌后十一烷、苯酚分別減少44.13%、100.00%,SL 接菌后十一烷、苯酚分別減少89.12%、59.15%。只在2 個(gè)感病品種根系分泌物中共同鑒定出的物質(zhì)為二十烷、硅烷、棕櫚酸、2-戊烯二酸、癸二酸雙酯、3-羥基-2,4,6-三溴苯甲醛和D-甘露醇。ZJ 接菌后二十烷和D-甘露醇含量分別增加125.93%、88.89%,其他5 種物質(zhì)含量分別減少100.00%、32.89%、70.00%、43.18%、100.00%;SB 接菌后D-甘露醇含量增加485.71%,其他6 種物質(zhì)分別減少93.10%、100.00%、40.28%、100.00%、77.78%、90.24%。接菌后感病品種ZJ、SB 中D-甘露醇含量增加,推測(cè)D-甘露醇可能與西瓜感病有關(guān)。在抗、感品種根系分泌物中鑒定到十八烷酸和鄰苯二甲酸二丁酯,接菌后,抗病品種CG、SL 中十八烷酸含量分別增加79.49%、112.68%,鄰苯二甲酸二丁酯含量分別減少96.33%、25.93%;感病品種ZJ、SB 中十八烷酸含量分別減少6.00%、37.66%,鄰苯二甲酸二丁酯含量分別減少19.67%、24.14%。推測(cè)十八烷酸可能與西瓜抗病有關(guān),鄰苯二甲酸二丁酯含量改變可能與病菌侵染有關(guān)。綜上,十一烷、苯酚、硅烷、棕櫚酸、癸二酸雙酯、2-戊烯二酸、3-羥基-2,4,6-三溴苯甲醛、鄰苯二甲酸二丁酯等物質(zhì)含量的改變可能與枯萎病菌侵染有關(guān),十八烷酸可能與西瓜對(duì)枯萎病的抗性有關(guān),D-甘露醇可能與感病有關(guān)。

    表1 西瓜根系分泌物的組成成分

    2.2 根系分泌物對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

    由表2 可以看出,與對(duì)照相比,2 個(gè)感病品種未接菌處理3~12 d 的根系分泌物菌落直徑增加了0.90~3.04 cm,促進(jìn)率為19.87%~67.11%,第3天促進(jìn)作用最強(qiáng);接菌后3~9 d 根系分泌物菌落直徑大于未接菌菌落,促進(jìn)率提高了2.88%~12.36%。與對(duì)照相比,抗病品種未接菌處理的3~12 d 的根系分泌物菌落直徑減少了1.84~3.87 cm,抑制率為37.02%~77.87%,第9 天的抑制作用最強(qiáng);接菌后根系分泌物的菌落直徑小于未接菌菌落,抑制率提高了2.01%~9.26%。感病品種根系分必物對(duì)病原菌菌絲的促進(jìn)作用在前期較為明顯,抗病品種的抑制作用在中期較為明顯。

    表2 根系分泌物對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

    2.3 根系分泌物對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響

    由表3 可以看出,與對(duì)照相比,感病品種未接菌處理3~12 d 的根系分泌物菌落數(shù)增加了2.00~6.00 個(gè),促進(jìn)率為21.18%~81.82%,第12 天的促進(jìn)作用最強(qiáng);接菌后3~9 d 根系分泌物的菌落數(shù)多于未接菌菌落,促進(jìn)率提高了4.55%~22.73%。與對(duì)照相比,抗病品種未接菌處理3~12 d 的根系分泌物菌落數(shù)減少了1.66~6.00 個(gè),抑制率為13.51%~40.54%,第12 d 的抑制作用最強(qiáng)。接菌后根系分泌物的菌落數(shù)少于未接菌菌落,抑制率提高了2.00%~21.62%。

    表3 根系分泌物對(duì)枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響

    2.4 根系分泌物對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

    由表4 可以看出,與對(duì)照相比,感病品種未接菌處理3~12 d 的根系分泌物孢子數(shù)增加了1.33~6.00 個(gè),促進(jìn)率為15.38%~72.00%,第12 天的促進(jìn)作用最強(qiáng);接菌后3~9 d 根系分泌物的孢子數(shù)多于未接菌孢子數(shù),促進(jìn)率提高了11.54%~44.00%。與對(duì)照相比,抗病品種未接菌處理3~12 d 的根系分泌物孢子數(shù)減少了2.34~8.33 個(gè),抑制率為17.11%~58.14%,第12 天的抑制作用最強(qiáng);接菌后根系分泌物的孢子數(shù)少于未接菌孢子數(shù),抑制率提高了2.33%~14.63%。

    表4 根系分泌物對(duì)枯萎病菌產(chǎn)孢量的影響

    3 討論與結(jié)論

    不同抗性作物品種根系分泌物的組成成分存在差異并且在病原菌侵染下會(huì)發(fā)生改變,目前發(fā)現(xiàn)根系分泌物的組成成分主要有糖類、苯類、酚類、酯類和酸類等[15-17]。在對(duì)西瓜叢枝菌根真菌研究中發(fā)現(xiàn),感病品種接種枯萎病菌后,叢枝菌根真菌降低了根系分泌物中琥珀酸和草酸含量,提高了香豆酸和蘋果酸的含量,植株發(fā)病減輕,抗性增強(qiáng)[18]??箍菸∠憬镀贩N根系分泌物中乙酸和脯氨酸的含量高于感病品種[19]??箍菸〔葺贩N根系分泌物中鄰苯二甲酸二丁酯含量高于感病品種,阿魏酸、丁香酸等含量低于感病品種[20]。在對(duì)煙草黑脛病的研究中發(fā)現(xiàn),抗病品種接菌后根系分泌物中水楊酸、阿魏酸等含量高于感病品種,酒石酸、月桂酸等含量低于感病品種[21],其通過(guò)抑制病原菌生長(zhǎng)增強(qiáng)抗病性。趙媛媛[22]研究發(fā)現(xiàn),接菌后辣椒根系分泌物中正十八烷的含量與抗病性呈正相關(guān)。湯麗川等[23]發(fā)現(xiàn),十八碳脂肪酸含量的提高可以抑制大豆種子傳播的莖潰瘍病菌的定殖。黃玉茜等[24]發(fā)現(xiàn),高濃度的花生根系分泌物中,D-甘露醇可作為碳源影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性,從而導(dǎo)致連作障礙。前人研究發(fā)現(xiàn),根系分泌物中酚類、酸類以及酯類可能與抗病有關(guān),部分酸類可能與感病有關(guān),其可以通過(guò)自身作用直接抑制病原菌生長(zhǎng),也可以為病原菌提供碳源促進(jìn)其生長(zhǎng)[25]。在筆者的研究中,抗、感品種根系分泌物組成成分存在差異并且接菌前后發(fā)生了改變,其中十八烷酸在抗、感品種根系分泌物中均鑒定到,但接菌后抗病品種CG 和SL 中十八烷酸的含量增加,感病品種ZJ 和SB 中含量減少,可能與西瓜抗病有關(guān),D-甘露醇僅在感病品種根系分泌物中鑒定到并且在接菌后含量增加,可能與西瓜枯萎病感病有關(guān)。關(guān)于十八烷酸與D-甘露醇在西瓜枯萎病抗感反應(yīng)中的作用還有待進(jìn)一步研究。

    抗、感品種的根系分泌物對(duì)病原菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響不同。Zhang 等[10]研究發(fā)現(xiàn),在煙草黑脛病中,抗病品種根系分泌物在接菌前后對(duì)菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制率分別為30.00%~46.00%和25.00%~40.00%,感病品種根系分泌物未接菌時(shí)對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的促進(jìn)率為7.00%~14.00%,而接菌后有輕微的抑制作用(<5.00%),但對(duì)孢子萌發(fā)沒(méi)有影響。婁曉平等[26]發(fā)現(xiàn),煙草黑脛病中抗病品種根系分泌物對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為5.93%~20.78%;感病品種根系分泌物對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)率為2.15%~16.47%。李巍等[20]在草莓枯萎病研究中發(fā)現(xiàn),抗病品種根系分泌物對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制率為18.20%~21.40%,感病品種根系分泌物對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的促進(jìn)率為22.10%~34.50%??共∑贩N根系分泌物主要對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)起抑制作用,感病品種根系分泌物起促進(jìn)作用,并且在棉花黃萎病[27]、煙草青枯病[28]、番茄青枯病[29]上也有類似結(jié)論。在筆者的研究中,抗病品種根系分泌物抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)與產(chǎn)孢,未接菌抑制率分別為37.02%~77.87%、13.51%~40.54%和17.11%~58.14%,并在接菌后抑制作用增強(qiáng);感病品種根系分泌物促進(jìn)病原菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)與產(chǎn)孢,未接菌促進(jìn)率分別為19.87%~67.11%、21.18%~81.82%和15.38%~72.00%,并在接菌后3~9 d 促進(jìn)作用增強(qiáng)。接菌后前期根系分泌物對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較大,后期對(duì)孢子萌發(fā)與產(chǎn)孢影響較大。

    綜上,在筆者的試驗(yàn)中西瓜抗感品種根系分泌物中共檢測(cè)出10 大類、25 種物質(zhì),十八烷酸可能與西瓜抗病有關(guān),D-甘露醇可能與西瓜感病有關(guān);抗病品種根系分泌物抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)與產(chǎn)孢;感病品種根系分泌物促進(jìn)病原菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)與產(chǎn)孢,并在接菌后抑制或促進(jìn)作用增強(qiáng)。

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