重組人Neuritin蛋白生物學活性的定量分析方法

王宿潔，宋丹丹，李煜，孟平平，朱金輝，朱禮彥，黃瑾*

(1 石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 832000；2 杭州師范大學公共衛(wèi)生學院，浙江 杭州 310036)

Neuritin(又稱可塑性候選相關基因15，CPG15)是Nedivi等人首次發(fā)現的一種新的神經營養(yǎng)因子[1-2]。研究表明，Neuritin在神經發(fā)育、損傷修復、學習認知等方面均具有很大的作用[3-6]。Neuritin能夠促進突觸素的聚集、突觸發(fā)生以及成熟[7-8]，促進神經元突起的生長與分支[9-10]，保護神經元細胞免于凋亡[11-12]。Neuritin還能促進細胞的遷移[13]。目前在學習記憶、認知方面的相關研究發(fā)現：Neuritin既可產生抗抑郁的作用[14]；又可以影響學習能力[15]和修復認知功能[16-17]。

本課題組率先在國內開展了重組人Neuritin蛋白(recombinant human Neuritin，rhNeuritin)的功能研究，研究發(fā)現rhNeuritin蛋白能促進骨髓間充質干細胞遷移，并誘導其向神經元樣細胞分化，還會影響骨髓間充質干細胞的衰老、凋亡、增殖和遷移；該重組蛋白能夠挽救受損中樞神經細胞[18]，維持神經元的存活、抑制凋亡，提高殘存神經軸突的再生能力和可塑性，加速急性脊髓損傷后的神經功能恢復，本課題組明確了rhNeuritin蛋白對中樞神經損傷后再生修復的有效性。

本課題組用于檢測rhNeuritin蛋白活性的方法有兩種，一種是雞胚背根神經節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)組織培養(yǎng)檢測法[19]，另一種是通過未分化的PC12細胞突起的生長狀況檢測法[20]。這兩種方法雖然都具有直觀、準確地反映rhNeuritin蛋白生物學活性的優(yōu)點，但是這兩種方法也有許多不足之處。

首先DRG的取材不易，這導致了實驗的可操作性很差，其次由于實驗動物存?zhèn)€體差異，從而導致實驗的重復性也很差。當通過未分化的PC12細胞突起的生長狀況檢測rhNeuritin蛋白的生物學活性時，未分化的PC12細胞的培養(yǎng)條件嚴苛，實驗結果易受外界培養(yǎng)條件的干擾，不易控制，從而導致實驗結果的不可控性；其次PC12細胞的培養(yǎng)周期長，實驗受到時間上的制約?；谏鲜龅膬煞N方法都有所局限，我們試圖尋找一種短時高效的從細胞水平反應rhNeuritin蛋白對神經系統(tǒng)功能作用的新方法來檢測rhNeuritin蛋白的生物學活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

小鼠海馬神經元(Hippocampal neuronal cell line，HT22)(復祥生物)

1.1.2 蛋白

重組人Neuritin蛋白(recombinant human Neuritin，rhNeuritin)(課題組利用酵母表達系統(tǒng)制備，疏水層析法純化，SDS-PAGE電泳檢驗純度為99.9%)

腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)(Abcom公司)

1.1.3 實驗器械

倒置顯微鏡(Nikon 公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司)；高壓蒸汽滅菌器 (日本SANYO Labo Autoclave 公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；低速離心機(江東儀器)；生物安全柜(Thermo 公司)；冰箱(中國海爾集團)；液氮罐(Thermo 公司)；移液器(德國Eppendorf 公司)；Handeld Automated Cell Counter (Millipore公司)；分光吸收讀板機(Molecular Devices 公司)。

1.1.4 實驗試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(以色列Biological Industries 公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone 公司)；胰酶細胞消化液(上海碧云天生物技術有限公司)；Promega Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent(美國Promega 公司)；20×PBS緩沖液(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)條件對HT22細胞的影響

HT22細胞，培養(yǎng)條件在37 ℃ 5%CO2條件下，使用含10% FBS的1640培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將對數生長期的HT22細胞平均接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，約為1×104個細胞/孔，3孔/組，用于后續(xù)實驗。上述接種HT22細胞的96孔細胞培養(yǎng)板于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄掉孔內培養(yǎng)基，重新加入無血清的1640培養(yǎng)基，于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后將培養(yǎng)基換成分別含有0%、0.2%、0.4%、0.6% FBS的1640培養(yǎng)基于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔48 h換1次上述培養(yǎng)基，每隔24 h利用倒置顯微鏡觀察不同濃度FBS培養(yǎng)的細胞狀態(tài)后，利用Promega Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent試劑盒檢測HT22細胞的存活率，其公式為(實驗組的OD值-空白組OD值)/(陰性對照組的OD值-空白組OD值)，比較5 d內不同濃度 FBS對HT22細胞存活的影響，并篩選出僅維持HT22細胞存活的FBS的濃度。

1.2.2 rhNeuritin蛋白作用于HT22細胞的檢測時間

接種HT22細胞的96孔細胞培養(yǎng)板于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄掉孔內培養(yǎng)液，重新加入無血清的1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。之后棄掉孔內培養(yǎng)基，重新加入含有1 000 ng·mL-1的rhNeuritin蛋白的維持培養(yǎng)液，含有1 000 ng·mL-1陽性對照的BDNF蛋白的維持培養(yǎng)液，以及含有上述蛋白同體積陰性對照PBS的維持培養(yǎng)液，每隔48 h換1次上述培養(yǎng)液。每隔24 h利用倒置顯微鏡觀察含有rhNeuritin蛋白和BDNF蛋白維持培養(yǎng)液的細胞狀態(tài)后，利用Promega Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent試劑盒檢測HT22細胞的存活率。比較4 d內rhNeuritin蛋白和BDNF蛋白對于HT22細胞存活的影響并篩選出rhNeuritin蛋白對HT22細胞作用的檢測時間。

1.2.3 rhNeuritin蛋白對HT22細胞存活的影響

接種HT22細胞的96孔細胞培養(yǎng)板于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄掉孔內培養(yǎng)液，重新加入無血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后棄掉孔內培養(yǎng)液，重新加入分別含有0、7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 ng·mL-1的rhNeuritin蛋白的維持培養(yǎng)液，含有500 ng·mL-1的BDNF蛋白的維持培養(yǎng)液，以及含有上述蛋白同體積PBS的維持培養(yǎng)液。每隔48 h換1次上述培養(yǎng)液，每隔24 h利用倒置顯微鏡觀察上述細胞狀態(tài)后，利用Promega Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent試劑盒檢測HT22細胞的存活率，比較3 d內不同濃度rhNeuritin對HT22細胞存活的影響。

1.2.4 不同濃度的rhNeuritin蛋白與HT22細胞存活的量效關系研究

根據上述11組濃度的rhNeuritin蛋白作用于HT22細胞72 h，其對HT22細胞存活影響的量化結果，擬合rhNeuritin蛋白與HT22細胞的劑量-效應曲線，并計算出rhNeuritin蛋白(標準品)對HT22細胞存活的EC50值，同時摸索rhNeuritin蛋白與HT22細胞存活呈正比例函數關系的濃度范圍，確定rhNeuritin蛋白的檢測線。新制備2批rhNeuritin蛋白作為測試品進行上述實驗，在檢測限范圍內，以EC50標準品為一個活性單位，比較測試品與標準品的蛋白活性。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

所有實驗計量數據都以平均值±標準差表示，運用GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖，用**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1，表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同培養(yǎng)條件對HT22細胞的影響

0% FBS培養(yǎng)HT22細胞，在1～5 d內，隨著時間的推移，細胞突起回縮，細胞變圓，細胞皺縮，細胞活力越來越差，HT22細胞的存活率在逐漸降低(圖1A、B)，(**，P<0.01); 0.2% FBS培養(yǎng)HT22細胞，在第2天，HT22細胞突起增多，HT22細胞的存活率達到最高，之后隨著時間的推移，細胞突起回縮，細胞變圓，細胞皺縮，HT22細胞的存活率降低(圖1A、圖1B),(**，P<0.01)；0.4% 、0.6% FBS培養(yǎng)HT22細胞，在1～3 d內隨時間推移，細胞突起增多，能夠建立細胞間的聯系，符合細胞生長趨勢(排除細胞接觸抑制)，細胞活力也隨之增高，HT22細胞的存活率在第3天達到最高，之后隨著時間的推移，細胞突起回縮，細胞變圓，細胞逐漸皺縮，HT22細胞的存活率在緩慢降低(圖1A、圖1B)(**，P<0.01)。由于0.4% FBS和0.6% FBS培養(yǎng)條件下的HT22細胞的狀態(tài)差別不大，最終選擇0.4% FBS作為本次實驗HT22細胞維持培養(yǎng)條件。

2.2 rhNeuritin蛋白對HT22細胞作用的檢測時間

維持培養(yǎng)液濃度為0.4% FBS，以市售的BDNF(Abcam公司)標定的有效濃度(500～1 500 ng·mL-1)為參考，用1 000 ng·mL-1rhNeuritin蛋白處理HT22細胞，檢測96 h內HT22細胞存活狀況。發(fā)現在干預的72～96 h，rhNeuritin組HT22細胞的存活率高于對照組，BDNF組HT22細胞的存活率也高于對照組(**，P<0.01)，見圖2。因此選擇最早檢測到rhNeuritin蛋白有效作用72 h作為最佳檢測時間。

A：依次為0% FBS、0.2% FBS、0.4% FBS、0.6% FBS +1640培養(yǎng)HT22細胞5 d內倒置顯微鏡下的細胞狀態(tài)圖；B：5 d內不同濃度的FBS培養(yǎng)HT22細胞的細胞存活狀況的量化圖(n=3，** P<0.01, vs同一天內0% FBS+1640培養(yǎng)HT22細胞的細胞存活率)。圖1 5 d內不同濃度FBS對HT22細胞的存活的影響

A：0.4% FBS+1 640+1 000 ng·mL-1 rhNeuritin培養(yǎng)HT22細胞72 h和96 h倒置顯微鏡下的細胞狀態(tài)圖；B：0.4% FBS+1 640+1 000 ng·mL-1 rhNeuritin培養(yǎng)HT22細胞72 h的細胞存活狀況的量化圖(n=3，** P<0.01 vs 0.4% FBS+1640+PBS培養(yǎng)HT22細胞72 h的細胞存活率)；0.4%FBS+1 640+1 000 ng·mL-1 rhNeuritin培養(yǎng)HT22細胞 96 h的細胞存活狀況的量化圖(n=3，** P<0.01 vs 0.4% FBS+1640+PBS培養(yǎng)HT22細胞96 h的細胞存活率)。圖2 rhNeuritin對HT22細胞分別作用72 h和96 h對細胞存活的影響

2.3 探討不同濃度的rhNeuritin蛋白對HT22細胞存活的影響

分別給予HT22細胞(0～4 000 ng·mL-1)11組濃度梯度的rhNeuritin蛋白培養(yǎng)72 h。結果發(fā)現，HT22細胞的存活率隨著rhNeuritin蛋白濃度的增加而升高，rhNeuritin蛋白的濃度為1 000 ng·mL-1時，HT22細胞的存活率達到最高，之后即使增加rhNeuritin蛋白的濃度，HT22細胞的存活率也不再增加，進入平臺期(圖3)。

2.4 rhNeuritin蛋白與HT22細胞存活的量效關系研究

根據(0～4 000 ng·mL-1)11組濃度梯度的rhNeuritin蛋白干預HT22細胞72 h后測得的細胞OD值計算出HT22細胞的存活率(表1，表2)，同時擬合rhNeuritin蛋白濃度與HT22細胞存活之間的量效曲線(圖4)，并計算出rhNeuritin蛋白(標準品)對HT22細胞存活的EC50值為85.111 6 ng·mL-1。

表1 不同濃度的rhNeuritin蛋白(標準品)分別作用于HT22細胞72 h后的OD值

表2 不同濃度的rhNeuritin蛋白(標準品)分別作用于HT22細胞72 h后的細胞存活率

圖4 標準品的rhNeuritin蛋白與HT22細胞存活的擬合曲線

之后我們又新制備了兩批rhNeuritin蛋白作為測試品重復上述實驗，根據測得的細胞OD值計算HT22細胞的存活率(表3，表4)，同時計算出測試品1的EC50值為89.229 6 ng·mL-1，測試品2的EC50為86.451 3 ng·mL-1(圖5，圖6)，與85.111 6 ng·mL-1(EC50值標準品)差值分別為4.8%和1.6%，二者均小于5%，相距較小，重復性較好。同時還發(fā)現標準品和測試品的rhNeuritin蛋白的濃度在62.5～1 000 ng·mL-1的范圍內，rhNeuritin蛋白的濃度與HT22細胞的存活呈正比例函數關系，即Y=0.013 5X+115.42 (R2=0.908 3)，Y1= 0.015 1X+115.86 (R2=0.943 2)，Y2=0.014 6X+117.32 (R2=0.901 7)，X代表rhNeuritin蛋白的濃度，Y表示HT22細胞的存活率(圖7，圖8，圖9)。

表3 不同濃度的rhNeuritin蛋白(測試品)分別作用于HT22細胞72 h后的OD值

表4 不同濃度的rhNeuritin蛋白(測試品)分別作用于HT22細胞72 h后的細胞存活率

圖5 測試品1 的rhNeuritin蛋白與HT22細胞存活的擬合曲線

圖7 檢測限內HT22細胞存活與rhNeuritin蛋白(標準品)濃度的量效關系曲線

圖8 檢測限內HT22細胞存活與rhNeuritin蛋白(測試品1)濃度的量效關系

圖9 檢測線內HT22細胞存活與rhNeuritin蛋白(測試品2)濃度的量效關系

2.5 rhNeuritin蛋白活性單位的制訂及方法學驗證

擬定標準品的EC50(85.111 6 ng·mL-1)為一個活性單位，在62.5～1 000 ng·mL-1的檢測限范圍時，標準品rhNeuritin蛋白濃度與HT22細胞的存活率呈正比例函數關系，計算得到此時的細胞存活率為116.57%；在62.5～1 000 ng·mL-1的檢測限范圍時，標準品和測試品的rhNeuritin蛋白濃度與HT22細胞的存活率呈正比例函數關系，本研究選擇500 ng·mL-1作為干預濃度，實驗測得標準品的細胞存活率為124.38%，此濃度時標準品的活性單位為1.067；實驗測得此濃度時測試品1的細胞存活率為125.21%，測試品2的細胞存活率為126.80%。由于測試品與標準品的存活率之比即為二者的活性單位之比，那么500 ng·mL-1時測試品1的活性單位為1.074，測試品2的活性單位為1.088。通過劑量效應關系計算獲得的500 ng·mL-1時測試品1的活性單位為1.059、測試品2的活性單位為1.069，實際測得與計算獲得的500 ng·mL-1時測試品1的活性單位的誤差為1.4%、測試品2的活性單位的誤差為1.7%，實際測得與計算獲得的測試品1和測試品2的活性單位的誤差均小于2%，證明該方法準確性很好。

3 討論

目前缺乏針對重組人Neuritin蛋白生物學活性的量化評價方法，本研究按照藥典要求，建立了一種定量評價rhNeuritin蛋白生物學活性的高效易行的新方法。

首先是細胞系的選擇和培養(yǎng)條件的確定。眾所周知Neuritin在神經可塑性方面發(fā)揮重要作用的，特別是在學習記憶相關的海馬區(qū)域，因此，根據rhNeuritin的功能特點，本實驗選定小鼠海馬神經元HT22細胞為受試細胞，以細胞的存活率作為評價指標。接著我們對HT22細胞的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)液的FBS含量進行了摸索，確定了維持培養(yǎng)液中FBS濃度為0.4%。

其次，針對該重組蛋白的檢測要求，進行了檢測時間及檢測限的探索，最終建立了針對rhNeuritin蛋白生物學活性的評價體系。研究發(fā)現HT22細胞在維持培養(yǎng)后，給予Neuritin蛋白觀察72 h，在62.5～1 000 ng·mL-1的檢測限范圍內，rhNeuritin蛋白與HT22細胞的存活率存在劑量效應關系，此法可作為rhNeuritin蛋白生物學活性的定性判斷標準。

為了進一步定量檢測rhNeuritin蛋白活性，設置了(0～4 000 ng·mL-1)11組濃度梯度，根據rhNeuritin蛋白與HT22細胞存活率的擬合曲線(圖4)，我們繪制了標準品的量效關系曲線(圖7)，在檢測限范圍內，標準品rhNeuritin蛋白與HT22細胞的存活率之間呈正比例函數關系，且R2為0.098 3，將標準品的EC50(85.111 6 ng·mL-1)擬訂為一個活性單位。

為了驗證該方法的重復性，我們分別建立了2批測試品rhNeuritin蛋白與HT22細胞存活的擬合曲線(圖5，圖6)，并繪制了相應的量效關系曲線(圖8，圖9)，兩組測試品重組人Neuritin蛋白的量效關系曲線與標準品呈現相同趨勢，3者R2均大于0.9，說明該方法的重復性很好。由于測試品與標準品的活性單位之比即為它們的細胞存活率之比，由擬訂的標準品蛋白的活性單位，即可計算得測試品蛋白在EC50的活性單位。

為了證實該方法的準確性，選取檢測限范圍內500 ng·mL-1，實際檢測2批測試品的細胞存活率，進而推算出二者的活性單位分別為1.074 1和1.087 8，而通過量效關系計算獲得的測試品1的活性單位1.058 7、測試品2的活性單位1.069 1。500 ng·mL-1時實際測得的活性單位與通過量效關系計算的活性單位相比，測試品1誤差為1.4%、測試品2的誤差為1.7%，均小于2%，證明該方法準確性較好。

綜上所述，本研究通過rhNeuritin蛋白對HT22細胞存活的影響，建立了rhNeuritin蛋白與HT22細胞的量效關系曲線，并擬定了rhNeuritin蛋白的活性單位，為進一步快速高效地評價rhNeuritin蛋白的生物學活性提供了新方法。與本課題組之前使用的rhNeuritin蛋白活性檢測方法——雞胚背根神經節(jié)法相比，該方法不僅具有重復性好、操作簡便、實驗周期短的優(yōu)點，還實現了對不同批次的rhNeuritin蛋白的生物學活性的定量檢測，并制定了明確的活性單位。