接種促生菌對金線蓮生物活性成分及土壤細菌群落的影響

黃 靖， 陳 嬋

(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州 350119)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)別稱金線蘭，廣泛分布于中國、印度、尼泊爾、日本和越南等國，是一種罕見的多年生名貴中草藥[1]。在我國，金線蓮主要種植于福建、浙江、貴州和臺灣等地區(qū)。現(xiàn)有研究表明，金線蓮含有多種生物活性物質(zhì)，包括黃酮類、多糖類、人參皂苷、類固醇、三萜、氨基酸及生物堿等[2]，具有增強免疫力、防止肝損傷和氧化、降低血糖等藥理作用[3]。由于金線蓮藥用價值極高，在醫(yī)藥制劑方面供不應(yīng)求，且在市場需求日益增長的美容和飲品中也逐漸普及，目前已成為我國發(fā)展最為快速的中藥材之一。

金線蓮作為一種遮陰植物，對氣候環(huán)境有著嚴格要求，其植株矮小、根系淺；因此，對各種生態(tài)資源的利用率均較低，且在栽培過程中常發(fā)生軟腐病、莖腐病、灰霉病、難疫病等病害，給種植者造成了巨大的經(jīng)濟損失[4]。根際是土壤、根系和微生物緊密聯(lián)系和相互作用的區(qū)域[5]。藥用植物的根際包括促進植物生長的有益微生物，同時也包括通過自毒作用、改變土壤理化性質(zhì)和降低土壤肥力的有害微生物，因此根際微生物群落影響著藥用作物的產(chǎn)量[6]。目前，化學(xué)農(nóng)藥制劑是防治金線蓮病蟲害的主要手段，但農(nóng)藥殘留超標(biāo)、病原菌抗藥性增加及作用無靶標(biāo)等問題已嚴重影響了金線蓮的安全生產(chǎn)。微生物施用策略表現(xiàn)出的無公害、長效性及費用低廉等優(yōu)勢[7]，使得功能菌防治技術(shù)成為控制植物病害的最佳選擇之一。目前，藥用植物與根際微生物關(guān)系的研究尚處于起步階段。大多數(shù)研究均集中在幼苗和組織培養(yǎng)階段內(nèi)生真菌和金線蓮的共生培養(yǎng)。如郭順星等從金線蓮根際中分離得到21種菌根真菌，離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)6種菌根真菌促進了天麻種子萌發(fā)，5種真菌顯著促進了金線蓮幼苗的生長[8]。然而，目前關(guān)于在溫室或林下進行根系促生菌與金線蓮共培養(yǎng)以改善該植物的生長和代謝的研究仍較少。

植物根際促生菌(PGPR)是一類生活在土壤中或依附于植物根系的有益微生物，PGPR可提高作物病害防治效果并促進植物生長[9]。如Dunlap等發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42可產(chǎn)生多種抗生素化合物和吲哚-3-乙酸(IAA)從而有效防治金線蓮灰霉病的發(fā)生，并促進植株生長[10]。Zhang等的研究表明，菌根真菌(Ceratobasidiumsp.)AR2可與金線蓮共生，促進金線蓮次生代謝水平，提高總黃酮、生物堿、鼠李糖和花青素-3-葡萄糖苷氯化物等活性化合物的含量[11]。Arkhipova等的研究表明，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)組合施用可促進宿主的細胞分裂素(CKs)分泌，從而提高宿主生理代謝[6]。上述研究為促生菌應(yīng)用于金線蓮培養(yǎng)提供了一定的理論依據(jù)。然而，土壤環(huán)境是決定植物生長的重要因素，目前關(guān)于施用促生菌對土壤微生物體系的研究鮮有報道。基于此，本研究基于高通量測序技術(shù)，探索了接種2株芽孢桿菌對金線蓮皂苷、黃酮等生物活性化合物及土壤微生物群落的影響，以期為促進金線蓮產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試地點與材料

試驗于2021年6—7月在福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院光照培養(yǎng)室中進行。培養(yǎng)室條件：光周期(白天/黑夜)為12 h/12 h，空氣相對濕度為75%，溫度為20～25 ℃。金線蓮購自連江金草農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司。

促生菌均屬于芽孢桿菌屬，分別為解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，均由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供，B.amyloliquefaciens保藏編號為ACCC 60428，B.subtilis保藏編號為ACCC 60429，兩者均分離自番茄根際土壤。B.amyloliquefaciens、B.subtilis均采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基在恒溫搖床(30 ℃、180 r/min)振蕩培養(yǎng)24 h獲得接種菌劑(2.0×108CFU/mL)。

盆栽試驗所用土壤取自福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院試驗田(119°38′43″E，25°46′29″N)0～20 cm表層土壤。供試土壤為紅壤，土壤理化性質(zhì)：pH值為5.85，有機質(zhì)含量為24.75 g/kg，全氮含量為 1.22 g/kg，堿解氮含量為65.08 mg/kg，有效磷含量為34.91 mg/kg，速效鉀含量為107.62 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機設(shè)計，設(shè)置4個處理，CK：原土培養(yǎng)，不接種微生物菌劑；BA：接種解淀粉芽孢桿菌；BS：接種枯草芽孢桿菌；BA+BS：接種解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。每個處理重復(fù)8次。

采用黑色圓聚乙烯塑膠桶，每盆裝土1.5 kg，將來自無性繁殖的3株金線蓮小植株移入盆中。對于BA、BS處理皆采用灌根的方式施用10 mL菌劑，BA+BS 處理2種菌劑各5 mL，CK處理即施用同等用量的無菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液。土壤持水量保持為75%，試驗培育40 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 栽培期菌株存活數(shù)及生物膜形成情況測定 為評估施入金線蓮栽培土壤中菌株的存活數(shù)，采用平板計數(shù)，每周檢查土壤中解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌株的活菌數(shù)，重復(fù)3次。

生物膜測定即在96孔塑料培養(yǎng)板中分別加入150 μLD600 nm為0.5的解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液，重復(fù)3次，放入培養(yǎng)箱30 ℃靜置培養(yǎng) 48 h，觀察菌株生物膜形成情況。

1.3.2 解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的功能代謝物分析 2種菌株的溶磷性、植酸酶分泌和嗜鐵能力按照李春雨描述的方法[12]進行。植物生長調(diào)節(jié)劑，如吲哚-3-乙酸、玉米素(ZE)和赤霉素(GA)的檢測如下：將0.5 mL 解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵液接種于50 mL LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在恒溫振蕩器(180 r/min、30 ℃)中振蕩培養(yǎng)18 h；振蕩培養(yǎng)結(jié)束后7 000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，再采用乙酸乙酯萃取。

IAA、ZE和GA的高效液相色譜(HPLC)分析在配備C18小柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)的Agilent Poroshell 1200系統(tǒng)上進行。溶劑體系為甲醇和0.075%乙酸水溶液(體積比為45 ∶55)，流速為 0.7 mL/min，30 ℃條件下反應(yīng) 20 min。使用紫外分光光度法分別在218、270、200 nm處檢測IAA、ZE和GA的吸光度。

1.3.3 金線蓮生物活性化合物的提取與測定 本研究中涉及的金線蓮生物活性化合物包括多糖、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、皂苷等。多糖含量采用優(yōu)化的苯酚-硫酸法測定[13]。槲皮素、山柰酚及異鼠李素皆采用高效液相色譜法測定，具體步驟參照張玲等的研究[14]。皂苷含量采用甲醇-超聲法提取，按NY/T 1842—2010《人參中皂苷的測定》標(biāo)準采用高效液相色譜測定[15]。

1.3.4 金線蓮根際細菌群落的高通量測序 稱取土壤樣品0.25 g，采用土壤DNA試劑盒(MO Bio Laboratories，USA)提取總基因組DNA。采用NanoDrop?ND-2000c紫外-可見分光光度計(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA)通過光度法檢查提取的基因組DNA的數(shù)量和質(zhì)量。細菌qRT-PCR擴增引物采用細菌16S rRNA V3～V4區(qū)間：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

每個樣品的qRT-PCR反應(yīng)體系為25.00 μL，包括5.00 μL反應(yīng)緩沖液、5.00 μL GC緩沖液、2.00 μL dNTP (2.5 mmol/L)、1.00 μL正向引物(10 μmol/L)、1.00 μL反向引物(10 μmol/L)、2.00 μL DNA模板、8.75 μL ddH2O、0.25 μL Q5 DNA 聚合酶。PCR熱循環(huán)條件如下：初始變性 98 ℃ 120 s，30個循環(huán)，98 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，最終72 ℃延伸5 min。通過16S rRNA 擴增子測序檢查土壤細菌多樣性和群落組成，擴增完畢后，借助Illumina MiSeq平臺進行Next Generation Sequencing Service測序。Illumina MiseqTM得到的原始數(shù)據(jù)采用CASAVA-FLASH進行過濾-拼接后，利用QIIME對每條序列與Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)比對進行物種分類注釋。利用Mothur軟件統(tǒng)計每個生物樣本的α多樣性指數(shù)。以上分析委托上海天昊生物科技有限公司完成。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Microsoft excel 2016進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0軟件進行單因素(ANOVA)方差分析，采用最小顯著差異(LSD)法進行顯著性檢驗(α=0.05)，采用Origin 9進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 促生菌生物膜形成情況及在土壤中的存活數(shù)

由圖1-A可知，隨試驗培養(yǎng)周期的延長，土壤中解淀粉芽孢桿菌(BA)、枯草芽孢桿菌(BS)及其組合施用處理(BA+BS)的濃度均呈下降趨勢。在培養(yǎng)第1周中，BA、BS處理的活菌數(shù)明顯下降，其中，BS處理的下降幅度最為明顯；培養(yǎng)第2周時，BA、BS處理的活菌數(shù)進一步降低，此時，BA、BS處理的活菌數(shù)僅為原菌劑的1/2；此后3周BA、BS處理的活菌數(shù)下降減緩，當(dāng)培養(yǎng)第5周時BA、BS處理的活菌數(shù)分別約為0.25×108、0.33×108CFU/g。而當(dāng)兩者組合施用(BA+BS)情況下，其活菌數(shù)下降幅度緩慢，且任一培養(yǎng)周期段皆明顯高于單一菌株施用處理(BA、BS)，施入土壤5周后，BA+BS處理的活菌數(shù)為0.81×108CFU/g。

由圖1-B可知，單一培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌(BA)不形成聚集體生物膜，單一培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(BS)形成少量生物膜(圖1-C)，表明BS處理比BA處理更容易形成生物膜。當(dāng)解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌組合施用時，生物膜的數(shù)量明顯增加，明顯高于單一菌株處理(圖1-D)，表明解淀粉芽孢桿菌的存在可促進枯草芽孢桿菌生物膜的形成，且共培養(yǎng)條件下比單一培養(yǎng)更容易形成聚集體。

2.2 促生菌的功能代謝物分析

由表1可知，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均能分泌植酸酶和鐵載體，且前者具備溶磷能力。基于HPLC分析顯示，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均可分泌生長素、玉米素，2種菌株均不分泌赤霉素，且前者的IAA分泌能力大于后者，而后者的ZE分泌能力大于前者。結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌可通過自身代謝產(chǎn)生多種植物激素從而有利于宿主植物生長。

2.3 接種促生菌對金線蓮生物活性化合物含量的影響

由圖2可知，當(dāng)解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌與金線蓮培養(yǎng)時，多糖含量降低，生物量、皂苷和3種黃酮(槲皮素、山柰酚、異鼠李素)的含量整體增加。由圖2-A可知，生物量中，以BA+BS處理整體較高，CK、BS、BA處理較BA+BS處理降低10.10%～45.26%，其中，BA+BS與CK處理差異顯著(P<0.05)。由圖2-B可知，多糖含量中，各處理表現(xiàn)為CK>BA>BS>BA+BS，其中，CK、BS、BA處理較BA+BS處理分別顯著提高65.26%、39.46%、30.61%。由圖2-C可知，皂苷含量以 BA+BS 處理最高，CK處理其次，兩者無顯著差異，且與BA、BS處理相比，BA+BS處理分別顯著提高26.72%、19.92%。由圖2-D至圖2-F可知，3種黃酮(槲皮素、山柰酚、異鼠李素)的含量均整體表現(xiàn)為CK

表1 解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的功能代謝物分析

2.4 接種促生菌對金線蓮栽培土壤α多樣性的影響

細菌α多樣性是用于評估細菌物種數(shù)量(Sobs指數(shù))、多樣性(Shannon指數(shù))和豐富度(Chao1指數(shù))的重要指標(biāo)。由圖3可知，在2種菌株組合施用處理(BA+BS)與不接種處理(CK)的α多樣指數(shù)中，Sobs指數(shù)以BA+BS處理大于CK，Shannon指數(shù)則以CK大于BA+BS處理，但2個處理的Sobs、Shannon指數(shù)均無顯著差異。而在Chao1指數(shù)中，以BA+BS處理顯著大于CK處理，表明2種菌株組合施用對金線蓮?fù)寥兰毦锓N總量及多樣性無明顯影響，但可提高細菌的豐富度。

2.5 接種促生菌對金線蓮栽培土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

在為期40 d的培養(yǎng)中，在門水平組成上，CK處理與BA+BS處理基本一致，但在豐度上存在一定差異。由圖4-A可知，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)最為豐富，三者總豐度在CK、BA+BS處理中各占總豐度的84.55%、79.26%。綠彎菌門(Chloroflexi)在CK、BA+BS處理中各占比總豐度的13.869%、2.454%。浮霉菌門(Planctomycetes)的豐度從CK處理的3.75%在接種處理后略微增加至4.05%。芽孢桿菌屬(Bacillus)為厚壁菌門(Firmicutes)的重要屬類，與CK處理相比，添加2種菌株培養(yǎng)后土壤中厚壁菌門的豐度由0.78%顯著提高至2.13%。

在屬水平上，由圖4-B可知，CK處理中熱酸菌屬(Acidothermus)相對豐度為8.04%，添加2種菌株顯著提高了熱酸菌屬的相對豐度，此時豐度為11.75%。類似地，康奈斯氏桿菌屬(Conexibacter)從CK處理的1.24%在接種促生菌后升高至3.33%。相比之下，黃色桿菌科類(norank_f_Xanthobacteraceae)的豐度急劇降低。

2.6 接種促生菌對金線蓮栽培土壤細菌屬水平群落差異的影響

由圖5可知，在CK、BA+BS處理間豐度差異最大的前15個菌屬，除出芽菌科未分類屬(norank_f_Gemmataceae)外，CK、BA+BS處理間的其他14屬皆存在顯著差異。其中，熱酸菌屬(Acidothermus)、慢生根瘤菌屬(Bradyhizobium)、norank_o_Subgroup_2、酸桿菌目未分類屬(norank_o_Acidobacteriales)、康奈斯氏桿菌屬(Conexibacter)、玫瑰彎菌屬(Roseiarcus)、norank_c_Actinobacteria、不動桿菌屬(Acidibacter)的相對豐度以BA+BS顯著高于CK處理。而在黃色桿菌科未分類屬(norank_f_Xanthobacteraceae)、norank_c_AD3、norank_o_IMCC26256、norank_o_Elsterales、norank_c_Subgroup_6、Candidatus_Solibacter則以CK處理的相對豐度顯著高于BA+BS處理。

2.7 促生菌處理下土壤細菌豐度與生物活性化合物的相關(guān)性分析

由表2可知，Candidatus_Solibacter與多糖、皂苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素等的含量之間皆不存在明顯相關(guān)性。就多糖含量而言，其與熱酸菌屬(Acidothermus)、慢生根瘤菌屬(Bradyhizobium)、norank_o_Subgroup_2、norank_o_Acidobacteriales、康奈斯氏桿菌屬(Conexibacter)、玫瑰彎菌屬(Roseiarcus)、norank_c_Actinobacteria、不動桿菌屬(Acidibacter)呈顯著或極限顯著負相關(guān)，與黃色桿菌未分類屬(norank_f_Xanthobacteraceae)、norank_c_AD3、norank_o_IMCC26256、norank_o_Elsterales、norank_c_Subgroup_6、norank_f_Gemmatacea呈顯著或極顯著正相關(guān)。14個菌屬的豐度與皂苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量的相關(guān)性與多糖含量的相關(guān)性趨勢相反。

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌屬具有較佳的生防及促生功能，可形成菌液制劑且產(chǎn)孢穩(wěn)定，因此越來越多地用于農(nóng)業(yè)系統(tǒng)[7]。其中，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌是應(yīng)用最為廣泛的芽孢桿菌屬成員，兩者皆可分泌低分子量多肽及胞外水解酶等活性物質(zhì)以抑制病原菌，且可產(chǎn)生植物激素促進植物生長發(fā)育[16]。

本研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌可在金線蓮的根際土壤存活，且這2種菌株可以相互促進形成生物膜。生物膜是不同細菌交換代謝產(chǎn)物的場所，其中，一些細菌可利用其他細菌的代謝產(chǎn)物作為電子受體或供體，從而提高生物膜的功能[17]。前人的研究表明，多物種的協(xié)同作用可促進群落生物膜的形成[18]，這可能是菌株間的生防分泌物與細胞膜鐵離子轉(zhuǎn)運通道FeuABC的調(diào)控蛋白特異性結(jié)合，并誘導(dǎo)feuABC基因的表達，從而提高胞內(nèi)鐵離子濃度和促進生物膜形成[19]。

表2 促生菌處理下土壤細菌屬水平差異菌屬豐度與生物活性化合物含量的相關(guān)性分析結(jié)果

本研究中，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的功能代謝產(chǎn)物分析結(jié)果表明，2種菌株皆可分泌植酸酶、鐵載體、生長素和玉米素；此外，枯草芽孢桿菌可溶解磷。土壤微生物可為植物生長提供養(yǎng)分，溶解土壤中難溶的磷，在非共生條件下固氮[20]；此外，部分促生菌可分泌鐵載體從而提高土壤中鐵的利用率[21]。由此可見，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌具有較佳的促生及生防潛力。Idris等的研究表明，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensFZB42)分泌IAA是該菌株影響植物生長的主要機制之一[22]。另一項研究報道，PGPR通過產(chǎn)生亞精胺和赤霉素促進植物生長[23]。本研究中，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液中未檢出亞精胺和赤霉素，說明不同促生菌分泌的植物生長激素的種類和含量不同。

金線蓮含有黃酮、多糖、皂苷、生物堿、甾醇、有機酸及微量元素等多種活性成分[2-3]，不同活性成分對植物生長發(fā)育及藥用功能不同。本研究中，2種芽孢桿菌屬菌株與金線蓮共培養(yǎng)時，皂苷和3種黃酮(槲皮素、山柰酚、異鼠李素)的含量普遍增加，但多糖含量下降。植物多糖作為環(huán)境響應(yīng)物質(zhì)，可作為碳源產(chǎn)生細胞外基質(zhì)輸送至根際從而介導(dǎo)植物根部周圍細菌生物膜的形成[24]。因此，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌可使用金線蓮中的多糖及其衍生物以便更好地在根際定殖，因此多糖含量下降。此外，在活性成分中，皂苷和黃酮是金線蓮的特征成分，具有藥用和食用價值，且金線蓮生物量在接種促生菌的條件下增加；因此，多糖含量的降低并不代表金線蓮多糖分泌水平的降低，可能是根際微生物截取的結(jié)果。Rahman等的研究表明，植物促生菌芽孢桿菌屬和伯霍爾德桿菌屬(Paraburkholderia)可提高草莓果實中抗氧化劑的含量，如酚類物質(zhì)、類胡蘿卜素、黃酮類化合物和花青素[25]。這些研究表明，添加有益微生物可誘導(dǎo)宿主作物的生物活性成分的合成。

近年來，微生物肥料對根際微生物群或植物微生物群的調(diào)控得到廣泛研究，且根際微生物群落比寄主植物編碼更多的基因，通過合作和競爭形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，對植物的健康和生長至關(guān)重要。本研究中，細菌α多樣性指數(shù)表明，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌組合施用對金線蓮?fù)寥兰毦锓N總量及多樣性無明顯影響，但提高了細菌群落的豐富度。根際細菌群落中，在門水平上，部分細菌門豐度發(fā)生顯著變化，如綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度皆明顯提高，Chloroflexi是光合細菌的主要細菌門之一，Planctomycetes是全球氮循環(huán)和污水處理貢獻最大的主要細菌門，在厭氧和自養(yǎng)代謝中具有獨特的氧化銨的作用，芽孢桿菌屬于厚壁菌門(Firmicutes)，是主要的生防菌株來源門類[12，26]。此外，在屬水平上，以熱酸菌屬(Acidothermus)、慢生根瘤菌屬(Bradyhizobium)、玫瑰彎菌屬(Roseiarcus)為主的菌屬豐度發(fā)生顯著上調(diào)，而病原菌較多的黃色桿菌科未分類屬(norank_f_Xanthobacteraceae)的豐度急劇降低。相關(guān)分析結(jié)果進一步表明，皂苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的含量與以熱酸菌屬(Acidothermus)、慢生根瘤菌屬(Bradyhizobium)、玫瑰彎菌屬(Roseiarcus)為主的有益菌屬的豐度皆呈顯著或極顯著正相關(guān)，而與黃色桿菌科未分類屬(norank_f_Xanthobacteraceae)的豐度呈極顯著負相關(guān)。這些結(jié)果表明接種解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌可通過增加有益微生物的豐度和降低有害微生物的豐度來改善金線蓮的健康及生物活性化合物的合成水平。