金線蓮袋栽模式有效活性成分研究

林 蔚，曹澤宇，劉 怡，蔡宗鑫，何碧珠，3，郭梨錦

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；3.蘭科植物保護(hù)與利用國家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 福建 福州 350002；5.國際鎂營養(yǎng)研究所，福建 福州 350002）

金線蓮[Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl]是我國傳統(tǒng)珍貴藥材，屬國家二級保護(hù)植物，為蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬（Anoec tochilus）多年生草本植物[1]，主要分布在福建、浙江、廣西、廣東、四川、云南、江西、湖南、海南、臺灣等地[2]。金線蓮具有極高的食藥用、觀賞價值，在治療急慢性肝炎、糖尿病、高血壓、心臟病、腎炎等方面具有較好的療效[3]，因此市場需求量不斷劇增。金線蓮之所以具有多種功效是因?yàn)槠渚哂卸喾N活性成分，如多酚、黃酮、多糖、有機(jī)酸及揮發(fā)油等。

傳統(tǒng)設(shè)施大棚及林下平地種植金線蓮種苗，成活率在40%以下，病蟲害嚴(yán)重，農(nóng)藥使用量大，品質(zhì)差，成品保存率在35%以下，產(chǎn)品質(zhì)量難以保障，直接影響農(nóng)戶收獲效益。且種植地域受限局限于我國南部，嚴(yán)重制約金線蓮產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。采用袋栽方式繁殖金線蓮，生長持續(xù)時間可達(dá)480 d以上，比平地栽培持續(xù)時間延長300 d以上，實(shí)現(xiàn)封閉袋內(nèi)開花結(jié)果；產(chǎn)量提高2倍以上；全生育期沒有病蟲害、無需使用農(nóng)藥及人工澆灌管理，產(chǎn)品質(zhì)量安全有保障；成活率高，在96%以上，持續(xù)生育期長，成品保存率高達(dá)95%，品質(zhì)可控制，效益顯著。

目前有研究證實(shí)，采收期對果蔬與藥材品質(zhì)具有顯著的影響[4]，但關(guān)于金線蓮不同采集時間活性成分的比較研究極少[5]。而系統(tǒng)研究金線蓮不同采集時間活性成分變化規(guī)律具有重要的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。因此文中對袋栽金線蓮不同采集時間活性成分的變化規(guī)律進(jìn)行了分析比較，探討影響袋栽金線蓮藥用成分變化的主要因素，以期為金線蓮袋栽培奠定理論依據(jù)，并為其生產(chǎn)種植采收提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

袋栽金線蓮，來源于漳州合作企業(yè)“紅霞”組培品種（圖1）。

圖1 袋栽金錢蓮

1.2 試劑與儀器

試劑：香草醛、冰乙酸、高氯酸、齊墩果酸、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸、石油醚、氯仿、甲醇、蔗糖、苦參堿、三氯甲烷、β-豆甾醇、金線蓮苷、醋酐等；儀器：Lambda 25紫外/可見光光譜儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物學(xué)性狀。對5種栽培時長袋栽金線蓮進(jìn)行采集，解剖，對葉、莖、根進(jìn)行生物學(xué)性狀測量，拍攝金線蓮的各個部位的整體、局部、解剖照片，隨機(jī)挑選3株進(jìn)行生物學(xué)性狀及生物量調(diào)查。軟尺測量莖高（頂芽抽出處至莖基部長度），數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量莖粗（莖最粗處直徑大?。＿x取植株最大展開葉片，用軟尺測量葉長及葉寬。計(jì)算植株葉片數(shù)，并測定單株鮮重及干重。單株鮮重為單株材料清洗干凈并擦拭干水分后稱重所得；單株干重為測定鮮重后于50℃烘箱烘干至恒重。用Avantes可攜帶式光譜儀進(jìn)行反射率、顏色的測定，記錄，整理，用函數(shù)運(yùn)算形成顏色模型構(gòu)建的坐標(biāo)數(shù)據(jù)。

1.3.2 試驗(yàn)材料預(yù)處理。取新鮮的金線蓮樣品，先用流水清洗干凈，后用蒸餾水潤洗，121℃烘箱烘干至恒重，研磨成粉末，過目篩，得金線蓮干燥粉末，密封低溫貯存?zhèn)溆?。樣品烘干，研磨后用于金線蓮總黃酮、多糖、生物堿、甾醇、總?cè)频群康臏y定，每份樣品作3次重復(fù)。

1.3.3 活性成分測定。

1.3.3.1 總?cè)坪繙y定：精確稱取金線蓮樣品0.3 g，置2 mL離心管中，加600μL 70%乙醇，振蕩混勻，超聲500 W，30 min，靜置10 min，超聲重復(fù)1次。離心8 000 rpm，5 min。取上清液轉(zhuǎn)至刻度管。沉淀加600μL 70%乙醇，超聲，離心，取上清液。上清液用70%乙醇定容至50 mL。取0.2 mL乙醇提取液，揮干溶劑，加0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，然后加1 mL高氯酸，于60℃反應(yīng)20 min，冰浴10 min，加10 mL冰乙酸稀釋，在波長550 nm處測定吸光值。

5%香草醛-冰乙酸溶液的配制：準(zhǔn)確稱取香草醛1.25 g，迅速用適量冰乙酸溶解，轉(zhuǎn)入25 mL的容量瓶中，用冰乙酸定容，以備當(dāng)日之用。

總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取齊墩果酸對照品10 mg，以無水乙醇為溶劑，定容至50 mL，得終濃度為0.2 mg/mL。精確吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，揮干溶劑。加0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，然后加1 mL高氯酸，于60℃反應(yīng)20 min。冰浴10 min，加10 mL冰乙酸稀釋，在波長550 nm處測定吸光值。

1.3.3.2 總黃酮測定：精確稱取金線蓮樣品0.3 g，置2 mL離心管中，加600μL 70%乙醇，振蕩混勻。超聲500 W，30 min，靜置10 min，超聲重復(fù)1次。離心8 000 rpm，5 min。取上清液轉(zhuǎn)至20 mL刻度管。沉淀加600μL 70%乙醇，超聲，離心，取上清液。重復(fù)該步驟1次。上清液用70%乙醇定容至50 mL。取2 mL溶液置于20 mL刻度管，70%乙醇定容至4 mL，加5%NaNO2和10%Al（NO3）3溶液各0.3 mL搖勻，靜置5 min，加3 mL 4% NaOH溶液，30%的乙醇定容至10 mL，混勻靜置5 min。分光光度計(jì)510 nm處，比色。

總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確稱取干燥蘆丁對照品10 mg，加70%乙醇定容至50 mL，得終濃度為0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5 mL至刻度試管，分別加0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻；加0.3 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻；靜置5 min，加2 mL 4% NaOH溶液，搖勻。在加70%乙醇定容至10 mL顯色5 min，在510 nm波長下測定吸光值。

1.3.3.3 總多糖測定：采用苯酚-硫酸法，參照曾碧玉等[10]所述方法。精確稱取金線蓮樣品0.15 g，置10 mL離心管中，加5 mL的雙蒸水，沸水浴90 min。置離心機(jī)常溫，10 000 rpm，離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)至20 mL刻度管。沉淀加1 mL雙蒸水，沸水浴，離心，取上清液，該步驟重復(fù)1次。雙蒸水漂洗殘?jiān)?，離心，取上清液。上清液用雙蒸水定容置50 mL。加5 mL石油醚于溶液中，臺式恒溫振蕩器常溫200 rpm，10 min。靜置分層，棄上層溶液。下層溶液加氯仿：正丁醇（5∶1）溶液2 mL，混勻至乳濁狀，靜置分層。取50μL上層溶液置20 mL離心管中，雙蒸水定容至2 mL。加1 mL 9%苯酚溶液，搖勻。加5 mL濃硫酸，搖勻。室溫下靜置30 min，分光光度計(jì)485 nm處比色。

多糖標(biāo)曲的制作：精確稱取蔗糖干燥樣品10 mg，去離子水定容100 mL，分別取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL加水定容至2 mL，再依次加1 mL 9%苯酚溶液，搖勻，然后加5 mL濃硫酸搖勻。待冷卻至室溫，以空白為對照，在485 nm波長下比色測定吸光值。

1.3.3.4 總生物堿測定：精確稱取金線蓮樣品0.3 g，置2 mL離心管中，加600μL甲醇，振蕩混勻。超聲100 W，70℃，40 min，靜置10 min，超聲重復(fù)1次。離心8 000 rpm，5 min。取上清液轉(zhuǎn)至20 mL刻度管。沉淀加600μL甲醇，超聲，離心，取上清液。重復(fù)該步驟1次。上清液用甲醇定容至50 mL。取甲醇提取液0.5 mL、pH 5.6檸檬酸鈉緩沖液7 mL、溴麝香草酚藍(lán)2 mL置于分液漏斗中，氯仿萃取3次，每次7.5 mL，每次振蕩60 s、靜置30 min后過濾，取氯仿層并合并萃取液，取萃取液0.5 mL，加入4.5 mL甲醇進(jìn)行10倍稀釋，稀釋液于418 nm測定OD值。

溴麝香草酚藍(lán)指示劑：取溴麝香草酚藍(lán)0.1 g，加0.05 mol/L NaoH（0.02 g/10 mL）溶液3.2 mL使其溶解，再加蒸餾水稀釋至200 mL即得。

總生物堿標(biāo)曲的制作：稱取苦參堿10 mg于50 mL容量瓶中，以甲醇鹽酸溶液（100∶1）定容，配成0.2 mg/mL溶液備用。分別吸取0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL，于分液漏斗中，隨后加入pH 5.6檸檬酸鈉緩沖液7 mL、溴麝香草酚藍(lán)2 mL，氯仿萃取3次，每次15 mL，每次振蕩60 s、靜置30 min后過濾，取氯仿層并合并萃取液?？瞻捉M隨行，于418 nm測定OD值。

1.3.3.5 總甾醇測定：精確稱取金線蓮樣品0.15 g，置10 mL離心管中，加600μL石油醚，振蕩混勻。超聲500 W，30 min，靜置10 min，超聲重復(fù)1次。離心8 000 rpm，5 min。沉淀加600μL石油醚，超聲，離心，取上清液。重復(fù)該步驟1次。上清液用三氯甲烷定容至25 mL。精密量取4 mL，加人醋酐2 mL，濃硫酸20μL，搖勻，顯色40～60 min后，于678 nm測定。

總甾醇標(biāo)曲的制作：精確稱取60℃減壓干燥至恒重的β-豆甾醇對照品20.0 mg，置10 mL量瓶中，加入三氯甲烷適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精確量取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，分別置10 mL量瓶中，用三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，分別精 密量取4 mL，加入醋酐2 mL，濃硫酸20μL，搖勻，顯色40～60 min后，于678 nm測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同袋栽時長金線蓮生物學(xué)性狀

金線蓮袋栽時長生物學(xué)性狀如表1、圖2所示。最大葉長、葉寬和最長的根長是3個月袋栽金線蓮，分別為5.25、4.16、10.13 cm；12個月袋栽金線蓮的株高、真葉數(shù)和根直徑最大，分別為15.83、9、0.3 cm，1個月袋栽金線蓮莖節(jié)間長最長，為8.94 cm，6個月袋栽金線蓮莖粗最大，為0.48 cm。

圖2 不同袋栽時長金錢蓮生育期形態(tài)

隨著移栽時間的延長，單株鮮重及干重呈先上升后下降趨勢。從表1可以看出1個月的袋栽金線蓮干重和鮮重最低，分別為1.23和5.43 g。12個月袋栽金線蓮的干重和鮮重最高分別為1.45和7.78 g。

表1 不同袋栽時長金線蓮生物學(xué)性狀

2.2 不同袋栽時長金線蓮活性成分含量變化

2.2.1 總?cè)坪孔兓?。不同袋栽時長金線蓮總?cè)坪砍氏壬仙笙陆翟偕仙内厔荩▓D3），可以看出，9個月最低，到12個月時，總?cè)坪可?.047 mg/g，達(dá)到最高。

圖3 不同袋栽時長金線蓮總?cè)坪孔兓?/p>

2.2.2 總黃酮含量變化。不同袋栽時長金線蓮總黃酮含量如圖4所示，可以看出，隨著移栽時間延長，黃酮含量先降后升再下降。3個月黃酮含量最低；9個月黃酮含量最高（0.034 mg/g），3個月與12個月黃酮含量之間無顯著差異。

圖4 不同袋栽時長金線蓮總黃酮含量變化

2.2.3 總多糖含量變化。不同袋栽時長金線蓮總多糖含量呈先下降后上升的趨勢（圖5），可以看出，1個月多糖含量較高，為0.476 mg/g；隨后多糖含量隨著移栽時間延長而下降，6個月最低；到9個月時，多糖含量升至0.492 mg/g，達(dá)到最高。

圖5 不同袋栽時長金線蓮總多糖含量變化

2.2.4 生物堿含量變化。袋栽金線蓮不同移栽時長總生物堿含量呈先上升后下降的趨勢如圖6所示。1個月袋栽金線蓮總生物堿含量最低，隨著移栽時間延長，生物堿含量先上升，6個月袋栽金線蓮總生物堿含量最高（0.157 mg/g），后來逐漸下降。

圖6 不同袋栽時長金線蓮總生物堿含量變化

2.2.5 總甾醇含量變化。不同袋栽時長金線蓮的總生甾醇含量如圖7所示，可以看出，隨著移栽時間延長，總生甾醇含量先上升后下降。1個月總生甾醇含量最低，9個月總生甾醇含量最高（0.997 mg/g）。

圖7 不同袋栽時長金線蓮總甾醇含量變化

3 討論

本試驗(yàn)通過對5種栽培時長袋栽金線蓮進(jìn)行采集和生物學(xué)性狀測量，測得3個月袋栽金線蓮葉長、葉寬和根長最大，分別為5.25、4.16、10.13 cm；12個月袋栽金線蓮的株高、真葉數(shù)和根直徑最大，分別為15.83、9、0.3 cm，1個月袋栽金線蓮莖節(jié)間長最長，為8.94 cm，6個月袋栽金線蓮莖粗最大，為0.48 cm。1個月袋栽金線干重和鮮重最低，分別為1.23和5.43 g。12個月袋栽金線蓮的干重和鮮重最高，分別為1.45和7.78 g。邵清松等[6]通過對以13份金線蓮種質(zhì)為研究對象，對其9個性狀進(jìn)行相關(guān)、通徑和主成分分析，可將金線蓮形態(tài)學(xué)性狀分為“高產(chǎn)型形態(tài)決定因子”和“產(chǎn)量的葉部決定因子”，認(rèn)為在進(jìn)行金線蓮高產(chǎn)種質(zhì)創(chuàng)新時，應(yīng)將株高、葉片鮮重和葉片數(shù)作為首要選擇指標(biāo)，然后再對其他性狀進(jìn)行選擇，以達(dá)到種質(zhì)改良的目的。

多糖及黃酮是金線蓮的重要活性成分，二者的含量是評價金線蓮品質(zhì)的重要指標(biāo)[7]。金線蓮多糖具有提高機(jī)體免疫力的作用，在降血糖、保護(hù)肝臟、抗炎及抗腫瘤等方面均有顯著療效，具有很高的開發(fā)價值[8]。三萜類成分齊墩果酸是常用于治療急性黃疸性肝炎和慢性肝炎且不良反應(yīng)較少的藥物[9]。黃酮類成分具有多種生物活性，主要有槲皮素、鼠李素、山奈酚的衍生物，大多具有抗氧化自由基作用。生物類黃酮對心腦血管疾病有治療和保護(hù)作用，還具有降血壓、降血脂、抗菌、抗腫瘤、抗氧化自由基、提高機(jī)體免疫力、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛等藥理活性[10-11]。生物堿是中草藥中重要的有效成分之一，有顯著的生物活性。朱善嵐等[12]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，首次在金線蓮中發(fā)現(xiàn)了石杉堿甲和烏頭堿，并測定了其含量，認(rèn)為石杉堿甲與異亮石松堿（Isoselagine）骨架相似，為金線蓮在抗阿爾茨海默病方面研究及在臨床鎮(zhèn)痛方面的利用提供了理論依據(jù)。甾醇是以環(huán)戊烷多氫為骨架的天然醇類化合物，具有消炎、降低膽固醇的作用[13]。

該試驗(yàn)中，袋栽金線蓮總?cè)坪恳?2個月最高，達(dá)到0.047 mg/g；9個月袋栽金線蓮的黃酮、多糖、生甾醇含量最高分別為0.034、0.492、0.997 mg/g；6個月袋栽金線蓮總生物堿含量最高達(dá)到0.157 mg/g。因此，結(jié)合生物量和活性成分的變化趨勢，認(rèn)為移栽9個月或12個月為袋栽金線蓮最佳采收期。