基于代謝組學分析補喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒糞便代謝物的影響

鐘浩杰，姚新奎,2，羅鵬輝，孟 軍,2，姚岳揚，王川坤，任萬路

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆馬繁育與運動生理重點實驗室/新疆農(nóng)業(yè)大學馬產(chǎn)業(yè)研究院，烏魯木齊 830052；3.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】代謝組學可以系統(tǒng)、高效、全面的反映動物機體對復雜營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程，是一種非常適合研究營養(yǎng)與代謝復雜關(guān)系的方法[1]。代謝組學利用先進的分析化學技術(shù)更系統(tǒng)、更全面的檢測血液、尿液或糞便中的小分子代謝物。生物醫(yī)學科學樣本包括組織或組織提取物以及生物液體[2]。糞便中大量的化合物直觀的展現(xiàn)了消化道以及不同空間的菌群對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收的過程。識別飲食改變引起的細微代謝變化，使用更綜合的方法全面的分析糞便代謝物，對獲得更多馬匹消化、吸收和代謝的相關(guān)信息具有重大意義?！厩叭搜芯窟M展】發(fā)酵工藝已被廣泛用于提高豆粕的營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度[3]和降低抗營養(yǎng)因子的水平[4]。Frias等[5]也證實了發(fā)酵過程能夠降解SBM的抗營養(yǎng)和致敏物質(zhì)。Wang等[6]、Espinosa等[7]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中添加發(fā)酵豆粕對氨基酸消化率、代謝能、表觀回腸消化率均無顯著影響，但可以顯著改善斷奶后的生長性能。吳丹丹等[8]研究表明，奶牛飼糧中添加100g/d小肽能顯著提高微生物蛋白產(chǎn)量，有效提高氮的消化利用率和沉積效率，減少氮排放，提高奶牛生長性能。Feng等[9]研究發(fā)現(xiàn)，相比于普通豆粕，發(fā)酵豆粕可以顯著提高肉雞腸道中胰蛋白酶、脂肪酶和蛋白酶活性，提高空腸黏膜絨毛高度，降低隱窩深度?！颈狙芯壳腥朦c】發(fā)酵豆粕在牛、羊、豬、雞以及水產(chǎn)等動物營養(yǎng)研究中獲得了相應(yīng)的研究成果，但是在馬匹上的研究鮮見報道。需研究補喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒糞便代謝物的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于UPLC-MS/MS檢測方法以及多元統(tǒng)計分析，研究補喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒糞便代謝物的影響，從分子水平分析發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒代謝的影響機制，為伊犁馬駒專用飼料的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 馬 匹

試驗于2021年5月至2021年10月在昌吉良源農(nóng)牧業(yè)發(fā)展有限公司馬場進行，選取10匹體況相近、無消化系統(tǒng)疾病病史的12月齡伊犁馬駒，隨機分為兩組，每組5匹馬。對照組和試驗組分別在干草和普通精飼料的基礎(chǔ)上添加5%的普通豆粕和5%的發(fā)酵豆粕。分別飼于不同圈舍，預飼7 d，試驗期為56 d，整個試驗過程中，所有馬均為舍飼，墊料選取清潔干燥的木屑，每天分3次給料，自由飲水和舔食舔磚。

1.1.2 基礎(chǔ)飼料

試驗所用發(fā)酵豆粕由新疆酵博仕生物科技有限公司生產(chǎn)，菌種為植物乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母等。試驗過程中，所有試驗馬匹每天飼喂干草(1.5 kg/100 kg體重)，每天按照每匹馬駒體重的1%飼喂精飼料。表1

1.1.3 樣品采集

試驗56 d無菌采集試驗馬匹直腸糞便，所有用于非靶向代謝組學分析的樣品均收集在5 mL無菌凍存管中，樣品立即放入液氮中儲存，直到糞便代謝產(chǎn)物的提取。

1.1.4 儀器與試劑

(1)質(zhì)譜：四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific)；

(2)色譜：超高效液相色譜系統(tǒng)(Dionex)；

(3)離心機(Thermo Fisher Scientific)；

(4)色譜柱：Waters, ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column；

(5)試劑：乙腈、乙酸銨、甲醇等。

1.2 方 法

1.2.1 代謝物提取

稱取100 mg糞便樣本，將甲醇、乙腈和水按4∶4∶2的比例混勻，預冷后取400 μL加入糞便樣本中，充分混勻，-20℃靜置60 min，離心機調(diào)至4℃離心20 min，將上清液進行干燥處理，乙腈和水按1∶1的比例混勻，取100 μL加入上述經(jīng)過干燥處理的容器中再次溶解提取到的代謝物，混勻后 4℃離心15 min，取2 μL上清液質(zhì)譜分析。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平

1.2.2 LC-MS/MS

(1)色譜條件

采用 ACQUITY UPLC BEH C18柱進行色譜分離，色譜柱柱溫為40℃，流速為 0.3 mL/min。對代謝物進行不同梯度脫洗。個樣品檢測量為5 μL。分析過程中樣品始終處于4℃環(huán)境中。采用隨機分析。將設(shè)置好的QC樣品置于各樣品間依次檢測。

(2) 質(zhì)譜條件

各組樣品將在正、負電場兩種環(huán)境下檢測，經(jīng)UHPLC分離后用四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Compound Discoverer 3.0軟件對質(zhì)譜條件下獲得的原始數(shù)據(jù)進行峰提取、峰對齊、峰校正、標準化等處理。輸出由樣本名稱、譜峰信息、及峰面積組成的三維數(shù)據(jù)矩陣。采用二級譜圖匹配和精確質(zhì)量數(shù)匹配的方式對化合物分子結(jié)構(gòu)進行鑒定，與數(shù)據(jù)庫比對。數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預處理后，進行PCA和OPLS-DA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 QC樣本總離子流圖譜比較

研究表明，各色譜峰保留時間和峰響應(yīng)強度均波動小，在實驗過程中儀器誤差引起的變異較小。圖1

2.2 正、負離子模式PCA模式下數(shù)據(jù)分離趨勢

說明2組樣品在代謝物組成上有明顯差異。圖2

圖1 QC樣本TIC圖譜

a：對照組Control group b：試驗組Experimental group

2.3 POLS-DA分析

研究表明，在正、負離子模式下的POLS-DA置換檢驗，各組Q2均小于0.05，沒有過度擬合。表2，圖4

a：對照組Control group b：試驗組Experimental group

圖4 正(a)、負(b)離子模式OPLS-DA得分比較

表2 OPLS-DA模型評價參數(shù)

2.4 差異代謝物篩選對比

研究表明，在試驗組與對照組的對比中，共篩選出211種差異代謝物，其中130種代謝物上調(diào)，181種代謝物下調(diào)。圖5

圖5 正(a)、負(b)離子模式火山對比

試驗組和對照組的對比中，共篩選出顯著性差異代謝物9種，添加5%的發(fā)酵豆粕顯著提高了馬駒糞便中果糖基甘氨酸、甜菜堿、甘露醇等物質(zhì)的含量(P<0.05)，顯著降低了高香草酸、丙酮酸、苯乙醇、煙酸和對羥苯基乙醇的含量(P<0.05)。 表3

2.5 差異代謝物聚類對比

研究表明，正、負離子模式下分別有4個和5個簇，正離子熱圖中的簇1、簇2在對照組中分布最多，在試驗組的部分個體中少量分布；簇3和簇4在試驗組中的分布明顯高于對照組。負離子熱圖中的簇1、簇2在對照組中分布最多，而簇3、簇4、簇5集中分布在試驗組。圖6

表3 試驗組與對照組之間顯著性差異代謝物

圖6 正(a)、負(b)離子模式聚類熱圖

2.6 糞便差異代謝物KEGG通路對比

研究表明，試驗組與對照組兩組間差異顯著的代謝通路，主要包括在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(Glycine, serine and threonine metabolism)、酪氨酸代謝(Tyrosine metabolism)、ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ABC transporters)、苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)、百日咳(Pertussis)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、胰島素分泌(Insulin secretion)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)煙酸和煙酰胺代謝(Nicotinate and nicotinamide metabolism)等通路。圖7

圖7 試驗組與對照組糞便代謝通路

3 討 論

Escalona等[10]研究，將核磁共振代謝組學分析應(yīng)用于不同種類的馬生物樣本，并且生成了一份“代謝物圖譜”，其中包含了在普通馬體液中識別出的所有代謝物。糞便和尿液代謝譜有助于解釋宿主和微生物的相互作用，而血漿代謝組可以推斷宿主的生理機能。自Escalona等[10]將核磁共振代謝組學分析應(yīng)用于不同種類的體液樣本以來，NMR代謝組學被進一步應(yīng)用于馬的生物體液，包括滑液[11]、尿囊液[12]和氣管沖洗液[13]。

甜菜堿又稱三甲基甘氨酸，甜菜堿最初在甜菜中被分離出來，該物質(zhì)具有多種生理活性，目前已作為一種飼料添加劑，應(yīng)用于各種畜禽養(yǎng)殖中。甜菜堿的滲透作用能夠調(diào)節(jié)動物體內(nèi)滲透壓，提高血清中生長激素水平，促進動物生長；具有改善胴體成分、提高肉品質(zhì)等功效[14,15]。除了作為滲透性物質(zhì)的作用外，其代謝作用已被證明在保護肝臟和其他組織以及減輕心血管危險因素方面具有重要作用。甜菜堿被認為是預防慢性疾病的重要營養(yǎng)物質(zhì)[16]。甜菜堿是動物機體內(nèi)重要的甲基供體，促進脂肪分解，抑制脂肪合成[17]。賀紹君等[18]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激狀態(tài)下，在基礎(chǔ)飼糧中添加甜菜堿可改善AA肉雞生長性能，提高十二指腸消化酶的活性，維持盲腸內(nèi)微生物區(qū)系平衡，從而減輕熱應(yīng)激對肉雞的危害。研究通過添加5%的發(fā)酵豆粕顯著提高了伊犁馬駒糞便中的甜菜堿、甘露醇、果糖基甘氨酸等物質(zhì)的含量，并參與ABC轉(zhuǎn)運蛋白和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路，說明飼料中添加5%的發(fā)酵豆粕能夠調(diào)節(jié)伊犁馬駒滲透壓以及脂肪、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝，并具有改善飼料適口性、抗應(yīng)激和轉(zhuǎn)甲基等作用。

煙酸又稱尼克酸，是動物必須維生素之一，廣泛分布于動植物種[19]。煙酸作為輔酶Ⅰ(NAD)和輔酶Ⅱ(NADP)的前體，既在機體碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝中扮演著重要的角色，又能參與體內(nèi)能量代謝的調(diào)節(jié)[20,21]。具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[22]、緩解應(yīng)激等多種生物學功能。試驗中，試驗組煙酸含量顯著高于對照組，通過煙酸代謝通路調(diào)節(jié)維生素代謝，飼糧中添加5%的發(fā)酵豆粕能夠調(diào)節(jié)伊犁馬駒碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝，并且具有抗炎、抗氧化、緩解應(yīng)激等功能。

4 結(jié) 論

飼料中添加5%的發(fā)酵豆粕顯著提高了伊犁馬駒糞便中甜菜堿、果糖基甘氨酸、甘露醇和煙酸等物質(zhì)的含量，根據(jù)不同代謝產(chǎn)物在機體內(nèi)發(fā)揮的生理功能可知補喂發(fā)酵豆粕能夠調(diào)節(jié)伊犁馬駒碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和氨基酸代謝，并且具有抗氧化、抗炎、緩解應(yīng)激、調(diào)節(jié)滲透壓等多種生物學功能。

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