王建文,丁玉澤,李璐伶,姚新奎,曾亞琦,閆 睛,任萬(wàn)路,王川坤,孟 軍
(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.新疆馬繁育與運(yùn)動(dòng)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)馬產(chǎn)業(yè)研究院,烏魯木齊 830052)
【研究意義】馬肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[1],肉馬養(yǎng)殖效益良好,馬匹繁育時(shí)代間隔長(zhǎng),選種準(zhǔn)確性關(guān)系到馬匹培育質(zhì)量,篩選LPL基因中與伊犁馬肉質(zhì)性狀相關(guān)的突變位點(diǎn),將研究結(jié)果與傳統(tǒng)選育方法相結(jié)合,有利于加快專門化肉用馬培育進(jìn)程,對(duì)加快肉馬發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase,LPL)屬于脂肪酶基因家族成員,主要由脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞合成與分泌,在甘油三酯及脂蛋白代謝和運(yùn)輸中具有重要的作用[2],廣泛分布于機(jī)體的肌肉和脂肪組織中[3]。LPL基因通過(guò)對(duì)甘油脂代謝、類固醇生物合成等信號(hào)通路調(diào)控,影響到脂肪的代謝與合成、沉積[4]。LPL基因在肉質(zhì)及其胴體性狀選擇應(yīng)用廣泛[5]。LPL基因表達(dá)較高的部位肌內(nèi)脂肪含量將會(huì)有所上升[6],對(duì)羊的研究結(jié)果也與此基本一致[7],肉品的剪切力較小[8],肉品的嫩度將得到改善[9]。LPL基因突變有利于肌內(nèi)脂肪的沉積、肉品的嫩度及色澤的改善[10],豬LPL基因的G117IC位點(diǎn)突變將使得其pH值顯著降低[11],對(duì)于肌肉的成熟及其肉食用品質(zhì)的提升有益。LPL基因的表達(dá)與其年齡及飼養(yǎng)條件有一定的關(guān)聯(lián)[12],LPL基因的表達(dá)會(huì)對(duì)LPL酶活性產(chǎn)生影響,對(duì)肌內(nèi)脂肪的水解代謝起到重要的調(diào)節(jié)作用[13],通過(guò)對(duì)酶活性的調(diào)節(jié),影響到肌內(nèi)脂肪的沉積與代謝,使得肉的品質(zhì)得到改善[14-15]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】分子生物學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于其它家畜選種方面,但在專門化用途馬培育方面的研究相對(duì)較少。需研究伊犁馬脂蛋白脂酶基因多態(tài)性及其對(duì)肉質(zhì)性狀的影響。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究以伊犁馬為主要研究對(duì)象,測(cè)定LPL基因序列及其肉質(zhì)性狀,研究伊犁馬LPL基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀之間的關(guān)系,篩選與伊犁馬肉質(zhì)性狀相關(guān)的LPL基因多態(tài)位點(diǎn),為專門化肉用馬分子選育提供數(shù)據(jù)參考。
1.1.1 馬 匹
選取41匹健康成年、伊犁馬為研究對(duì)象,馬匹膘情中等、無(wú)顯著親緣關(guān)系。馬匹由伊犁哈薩克自治州昭蘇馬場(chǎng)提供。采用枸櫞酸鈉抗凝管采集頸靜脈血液樣本5 mL,混勻后置于-18℃冰箱待用。對(duì)所選馬匹禁食24 h、禁水12 h后屠宰,立即采集三角肌、背闊肌、臂三頭肌、腹外斜肌和臀中肌5個(gè)部位肌肉樣本,成熟24 h后置于-18℃保存待用。
1.1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增
參照GenBank中公布的純血馬LPL基因序列(登錄號(hào):NC_009145.3)中第1外顯子、第3外顯子、第4外顯子和第10外顯子序列為目標(biāo)片段,采用Primer軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),所設(shè)計(jì)引物由上海生工根據(jù)設(shè)計(jì)引物序列進(jìn)行引物合成。表1
1.2.1 PCR擴(kuò)增與基因多態(tài)性檢測(cè)
本試驗(yàn)采用降落PCR法進(jìn)行擴(kuò)增,具體程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min,94℃變性30s,63℃退火45s,每個(gè)循環(huán)降低0.5℃,72℃延伸1 min,共計(jì)10個(gè)循環(huán);而后94℃變性30s,退火45s,72℃延伸1 min,共計(jì)30個(gè)循環(huán),72℃修復(fù)延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% TAE瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)。表2
表1 LPL基因引物基本信息
1.2.2 肉質(zhì)性狀檢測(cè)
對(duì)所采集的肉樣在4℃環(huán)境中排酸24 h后測(cè)定肉質(zhì)性狀。在4 000 r/min條件下離心20 min,測(cè)定肉樣系水力;在水浴鍋中將肉樣隔袋水煮30 min測(cè)定肉樣熟肉率;將煮熟的肉樣沿肌纖維方向修整為橫截面積為1 cm2的長(zhǎng)條,采用物性儀測(cè)定肉樣剪切力,每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定10次,取最接近3次測(cè)定樣本平均值為該肉樣的剪切力。
將符合條件的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工采用雙向測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序,檢測(cè)結(jié)果采用DNAStar軟件校正,并與純血馬LPL基因序列(登錄號(hào):NC_009145.3)比對(duì),采用BLAST確定突變位點(diǎn)及基因型。
采用HaploView 4.2軟件對(duì)基因數(shù)據(jù)分析群體遺傳學(xué),運(yùn)用Excel軟件整理肉質(zhì)性狀,根據(jù)基因型進(jìn)行分組,采用SPSS 18.0軟件對(duì)肉質(zhì)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
研究表明,各電泳條帶清晰明亮,且無(wú)拖尾與雜帶現(xiàn)象發(fā)生。第1泳道為第3外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約785 bp,第2泳道為第1外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約664 bp,第3泳道為第10外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約515 bp,第4泳道為第4外顯子擴(kuò)增片段,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約621 bp,各擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均與目的片段長(zhǎng)度相一致。圖1
注:第1泳道為第3外顯子,第2泳道為第1外顯子,第3泳道為第10外顯子,第4泳道為第4外顯子
研究表明,共計(jì)檢測(cè)出2個(gè)SNP位點(diǎn),其中第1個(gè)SNP位點(diǎn)位于第1外顯子和第2外顯子中間的內(nèi)含子區(qū)域:g.715T>C,共檢測(cè)出2種基因型(TT基因型和TC基因想);另一個(gè)SNP位點(diǎn)位于第4外顯子和第5外顯子中間的內(nèi)含子區(qū)域:g.12074C>A,共檢測(cè)出2種基因型(CC基因型和AC基因型)。圖2
圖2 LPL基因測(cè)序圖譜
研究表明,g.715T>C突變位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為TT基因型,優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門;g.12074C>A突變位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為CC基因型,優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃;χ2所檢測(cè)出的兩個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。所檢測(cè)出的2個(gè)突變位點(diǎn)均為低度多態(tài)位點(diǎn)(PIC<0.25)。表3,表4
表3 LPL基因不同突變位點(diǎn)基因型及基因頻率
表4 LPL基因不同突變位點(diǎn)遺傳學(xué)特性
研究表明,g.715T>C突變位點(diǎn)而言,在三角肌中TT基因型剪切力顯著高于TC基因型(P<0.05);在背闊肌中TT基因型失水率顯著高于TC基因型(P<0.05),剪切力極顯著高于TC基因型(P<0.01);在臂三頭肌中TT基因型失水率極顯著低于TC基因型(P<0.01);在腹外斜肌中TT基因型剪切力極顯著低于TC基因型(P<0.01);在臀中肌中TT基因型失水率和剪切力顯著高于TC基因型(P<0.05)。g.12074C>A突變位點(diǎn),在三角肌中CC基因型熟肉率顯著高于CA基因型(P<0.05);在背闊肌中CC基因型失水率顯著低于CA基因型(P<0.05);在臂三頭肌中CC基因型失水率極顯著低于CA基因型(P<0.01),熟肉率和剪切力極顯著高于CA基因型(P<0.01);在腹外斜肌中基因型剪切力極顯著高于CA基因型(P<0.01),失水率和熟肉率顯著低于CA基因型(P<0.05);在臀中肌中失水率CC基因型極顯著低于CA基因型(P<0.01)。表5
表5 伊犁馬LPL基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)
LPL基因在機(jī)體內(nèi)各主要器官、組織中均有表達(dá),在各種脂類代謝中起著重要作用[16],LPL基因突變將導(dǎo)致其編碼的蛋白活性發(fā)生變化,從而影響到其結(jié)構(gòu)與功能,對(duì)動(dòng)物肉品質(zhì)產(chǎn)生影響[17]。馬LPL基因位于2號(hào)染色體,編碼471個(gè)氨基酸,共有10個(gè)外顯子[18],試驗(yàn)對(duì)伊犁馬的4個(gè)外顯子及其附近內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè),共檢測(cè)出2個(gè)內(nèi)含子突變。大約每644~891 bp就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)突變位點(diǎn)[19],所檢測(cè)出突變的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與此基本一致,通過(guò)比對(duì)序列顯示,2個(gè)突變均為該基因突變位點(diǎn)。所檢測(cè)出的2個(gè)突變位點(diǎn)均為內(nèi)含子突變,且為新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn),可能是由于該基因在馬匹方面的研究較少,暫時(shí)未能發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn);可能是由于品種因素的影響[20],伊犁馬為我國(guó)自主培育品種,在其培育過(guò)程中曾引入部分品種對(duì)其進(jìn)行改良,也可能是其出現(xiàn)新突變位點(diǎn)的因素之一[21]。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示,這兩個(gè)突變位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),該群體基因型頻率和基因頻率具有較好的穩(wěn)定性,遺傳變異度相對(duì)較小,在后期人工定向選擇時(shí)具有較大的潛力[22]。
研究將檢測(cè)出的2個(gè)突變位點(diǎn)與伊犁馬肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,研究結(jié)果顯示g.715T>C和g.12074C>A突變位點(diǎn)在臂三頭肌、背闊肌和臀中肌中兩種基因型之間失水率均呈現(xiàn)出顯著差異性,相關(guān)研究結(jié)果顯示,失水率越低則肉質(zhì)越好[23,24],這2個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)伊犁馬肉品質(zhì)產(chǎn)生一定影響,在選育的過(guò)程中可以加以利用;但在三角肌中差異不顯著,可能是由于試驗(yàn)中所選擇的樣本量相對(duì)較小所致,還需要加大樣本量進(jìn)行證實(shí)。熟肉率是肉品加工過(guò)程中的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一,熟肉率高則表明在加工過(guò)程中其失水較少,肉品的多汁性較好[2],g.12074C>A突變位點(diǎn)三角肌和臂三頭肌中CC基因型熟肉率較高,顯示出該突變位點(diǎn)CC基因型肉品加工效率較好,在選育的過(guò)程中可以考慮以該基因型為主。g.715T>C位點(diǎn)背闊肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異,三角肌、臀中肌中剪切力呈顯著差異;g.12074C>A臂三頭肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異,造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于這兩個(gè)突變位點(diǎn)雖然位于內(nèi)含子區(qū)域,不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)中氨基酸產(chǎn)生影響,但可能參與到該基因的表達(dá)調(diào)控或與其相關(guān)的功能基因一起產(chǎn)生影響,影響到該基因的表達(dá),影響到該蛋白質(zhì)的生理活性,導(dǎo)致其剪切力產(chǎn)生了一定的差異,但具體的原因還有待于進(jìn)一步的機(jī)理性研究加以證實(shí)。對(duì)牛的研究結(jié)果顯示,LPL基因表達(dá)量較高的部位其肌內(nèi)脂肪含量會(huì)有所上升[25],此時(shí)該部位肉品的剪切力會(huì)有所下降[26],使得肉品的嫩度得到改善[27],對(duì)羊的研究結(jié)果也可得到與此類似的結(jié)論[28]。g.12074C>A突變位點(diǎn)臂三頭肌和腹外斜肌中CC基因型極顯著高于CA基因型,該突變位點(diǎn)對(duì)伊犁馬肉的嫩度會(huì)產(chǎn)生較大的影響,在對(duì)肉用馬的選育過(guò)程中。研究中所檢測(cè)出突變位點(diǎn)未能在部分部位中對(duì)所檢測(cè)指標(biāo)產(chǎn)生影響,可能是由于部位因素的影響,也可能是因?yàn)樗鶛z測(cè)樣本量較少所致,在今后的研究中可加大樣本量進(jìn)一步加以驗(yàn)證。
在伊犁馬LPL基因中共檢測(cè)出g.715T>C和g.12074C>A兩個(gè)突變位點(diǎn),均為低度多態(tài)位點(diǎn)且為Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。g.715T>C位點(diǎn)兩種基因型臂三頭肌失水率呈極顯著差異,背闊肌、臀中肌失水率呈顯著差異;背闊肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異,三角肌、臀中肌中剪切力呈顯著差異。g.12074C>A位點(diǎn)兩種基因型臂三頭肌、臀中肌中失水率呈極顯著差異,背闊肌、腹外斜肌中失水率呈顯著差異;臂三頭肌中熟肉率呈極顯著差異,三角肌、腹外斜肌中熟肉率呈顯著差異;臂三頭肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異。2個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)伊犁馬肉質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定影響,是影響伊犁馬肉質(zhì)性狀的可能候選功能基因位點(diǎn)。
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