基于刺突蛋白靶點(diǎn)的抗新型冠狀病毒藥物研究進(jìn)展

耿嘉懿，孫 浩，倪 強(qiáng)，李秋鈺

北京大學(xué)第三醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科，北京 100191

新型冠狀病毒肺炎(the coronavirus disease 2019，COVID-19)的大流行已經(jīng)在全球范圍內(nèi)造成了累計(jì)近4億人感染和超過(guò)500萬(wàn)人死亡，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了沉重負(fù)擔(dān)。重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是造成COVID-19的病原體，該病毒與2003年在我國(guó)引起傳染性非典型肺炎的病毒具有較高同源性，同屬于β冠狀病毒家族[1-3]。SARS-CoV-2的嚴(yán)重感染可引起急性呼吸窘迫綜合征，并發(fā)心肌、肝臟、腎臟等多臟器損害及敗血癥等癥狀，最終導(dǎo)致患者死亡。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究顯示，SARS-CoV-2衣殼上的刺突(spike，S)蛋白是介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合、進(jìn)而介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵表面蛋白；S蛋白含有S1和S2兩個(gè)亞基，S1亞基含有受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain，RBD)，是S蛋白與宿主細(xì)胞受體直接結(jié)合的結(jié)構(gòu)域；S2亞基則含有融合肽(fusion peptide，F(xiàn)P)、七肽重復(fù)區(qū)(heptad repeat region，HR)1和2等，是膜融合過(guò)程所需的基本元件。感染過(guò)程中，S蛋白在經(jīng)宿主細(xì)胞蛋白酶水解后，暴露RBD，進(jìn)而與宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)2受體結(jié)合，通過(guò)胞吞作用進(jìn)入宿主體內(nèi)[4-6]。因此，S蛋白在病毒與宿主細(xì)胞接觸、受體結(jié)合以及病毒-宿主細(xì)胞膜融合過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，而針對(duì)S蛋白的抑制劑可以阻斷病毒與受體結(jié)合的過(guò)程，緩解病情，為治療爭(zhēng)取時(shí)間。本文基于S蛋白靶點(diǎn)，對(duì)抗新型冠狀病毒藥物的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

蛋白及多肽類

以S1亞基為靶點(diǎn)的抑制劑基于ACE2設(shè)計(jì)的抑制劑是該類抑制劑中的重要部分。有案例報(bào)道重組人源ACE2有效降低了COVID-19患者血漿中的病毒載量和炎癥因子水平，并且對(duì)肺等器官起到了保護(hù)作用[7]；但在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，重組人源ACE2似乎僅在保護(hù)心、肝器官方面發(fā)揮了微弱的作用[8]?；贏CE2序列設(shè)計(jì)出的短肽，如基于ACE2設(shè)計(jì)的變體1(AHB1)、基于ACE2設(shè)計(jì)的變體2(AHB2)、ACE 2 衍生七肽(GK-7)等[9-10]，能夠以微摩爾的親和力與RBD結(jié)合。ACE2的胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)重組成ACE2-IgG融合蛋白，在生物體內(nèi)更為穩(wěn)定，多種ACE2-IgG1-可結(jié)晶段(fragment crystallizable，F(xiàn)c)融合蛋白已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的效果[11-15]，由復(fù)宏漢霖公司生產(chǎn)的ACE2-IgG1-Fc融合蛋白已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[16]。Svilenov等[17]發(fā)現(xiàn)，將重組蛋白的IgG1-Fc替換為IgG4κ-Fc并引入S228P突變，能夠進(jìn)一步降低補(bǔ)體激活和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)并延長(zhǎng)融合蛋白的半衰期，為融合蛋白的優(yōu)化提供了新思路。另外，利用HEK-293T-hACE2細(xì)胞獲得的含hACE2的囊泡也已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出對(duì)SARS-CoV-2強(qiáng)大的中和能力[18-19]。

除ACE2外，人體內(nèi)一些其他蛋白也能夠與S1亞基結(jié)合，進(jìn)而阻斷S-ACE2相互作用。人肺表面活性蛋白D是凝集素家族中的一種糖蛋白，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要功能[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，重組人源肺表面活性蛋白D片段可以通過(guò)其糖類識(shí)別結(jié)構(gòu)域與SARS-CoV-2的RBD結(jié)合[22-23]。LL-37是人體中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽cathelicidin家族中的唯一成員，也是人體內(nèi)唯一的雙親性α螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽，在機(jī)體免疫中扮演著重要角色[24]。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，LL-37能夠同時(shí)與S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域和ACE2結(jié)合，從而雙向阻斷S-ACE2的相互作用。ATN-161是一種由纖連蛋白衍生出的五氨基酸短肽，研究發(fā)現(xiàn)，ATN-161可以通過(guò)兩種方式抑制SARS-CoV-2：一是直接與S1亞基結(jié)合干擾其構(gòu)象，掩蓋S1亞基與ACE2的結(jié)合位點(diǎn)[26]；二是通過(guò)結(jié)合整合素，干擾S蛋白與整合素或ACE2/整合素復(fù)合物的結(jié)合[27]。

這些結(jié)果提示我們從人體自身固有的蛋白出發(fā)，尋找SARS-CoV-2抑制劑是新冠藥物開(kāi)發(fā)的重要方向。也有研究通過(guò)模擬計(jì)算的方式，從頭設(shè)計(jì)出具有S蛋白結(jié)合潛力的短肽或蛋白，但其實(shí)際效果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證[9]。

以S2亞基為靶點(diǎn)的抑制劑復(fù)旦大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出一種針對(duì)人冠狀病毒刺突HR1結(jié)構(gòu)域的泛冠狀病毒融合抑制劑——基于人冠狀病毒OC43的HR2設(shè)計(jì)的優(yōu)化變體1(EK1)，EK1能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HR1、阻斷6-HB的形成而抑制S蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞融合，從而阻斷多種冠狀病毒[28]。由于冠狀病毒的S2亞基高度保守，EK1同樣能夠有效抑制SARS-CoV-2[29]。對(duì)EK1進(jìn)行酯化修飾后得到的EK1C4顯示出了更強(qiáng)的抑制能力[29]，而將EK1C4的四聚乙二醇基團(tuán)替換后得到的脂肽EKL1C，雖然對(duì)SARS-CoV-2的抑制能力略有降低，但具有更高的穩(wěn)定性[30]。該團(tuán)隊(duì)還曾根據(jù)SARS-CoV-2的HR2序列設(shè)計(jì)出一種衍生肽HR2P，能夠以相似原理阻斷S蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞融合[31]。也有其他研究者基于SARS-CoV-2的HR2序列設(shè)計(jì)并優(yōu)化得到了脂肽，如SARS-CoV-2 HRC脂肽[32]和IPB02等，這些研究中經(jīng)酯化修飾后的脂肽均顯示出對(duì)SARS-CoV-2更強(qiáng)的抑制能力，這些結(jié)果提示基于SARS-CoV-2的HR2序列設(shè)計(jì)短肽并進(jìn)行酯化修飾是開(kāi)發(fā)SARS-CoV-2抑制劑的可行方案，但這些脂肽的實(shí)際效果和安全性仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證[33]。

糖基化酶抑制劑糖基化是一種非常普遍但也十分重要的蛋白修飾方式，主要包括N-連接、O-連接、C-連接和糖基磷脂酰肌醇錨定4種方式，以N-連接為主[34]。糖基化修飾對(duì)病毒的蛋白質(zhì)折疊、受體識(shí)別、傳染性和免疫逃避起著重要作用[35]。SARS-CoV-2的S蛋白是一種高度糖基化的糖蛋白，具有22個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)[36]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制宿主細(xì)胞的糖基化過(guò)程雖然不能直接抑制S-ACE2相互作用，但能夠明顯降低SARS-CoV-2對(duì)細(xì)胞的感染速率，并使大量病毒顆粒失去感染能力[37-38]。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制劑(包括NGI-1、麥格司他、西戈斯韋等)能夠有效降低SARS-CoV-2侵染細(xì)胞的速率，并且對(duì)多種變異毒株都有很好的效果[38-39]。但α-葡萄糖苷酶抑制劑發(fā)揮作用較慢，無(wú)法在第一時(shí)間阻斷病毒入侵，因此可能更適合作為已感染患者聯(lián)合用藥的選擇；此外，α-葡萄糖苷酶抑制劑可能會(huì)引起胃腸道反應(yīng)，需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)來(lái)證實(shí)其療效和患者的耐受性。

小分子抑制劑

小分子抑制劑是一類分子量較小的化合物，相較于抗體和大分子藥物，小分子抑制劑被認(rèn)為具有更好的抗病毒逃逸能力和更低的免疫原性[40]，也成為新冠藥物的研究熱點(diǎn)之一。

S-ACE2的結(jié)合需要硫酸乙酰肝素的輔助[41]。而肝素可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RBD，進(jìn)而抑制病毒入侵細(xì)胞；另外，肝素還可以與S2亞基水解切割位點(diǎn)相互作用，進(jìn)一步抑制S蛋白的膜融合步驟[41-43]。因此，肝素除可用于預(yù)防COVID-19患者血栓形成外，還具有直接阻斷病毒感染的潛力[44]。但由于應(yīng)用肝素具有出血風(fēng)險(xiǎn)，因此其臨床應(yīng)用需要進(jìn)一步評(píng)估?；诟嗡亻_(kāi)發(fā)出血風(fēng)險(xiǎn)更小、結(jié)合病毒能力更強(qiáng)的化合物，是藥物開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)方向之一[45]。

Shi等[46]研究發(fā)現(xiàn)，兩種巰基化合物P2119和P2165能夠?qū)蛋白的二硫鍵還原，影響S蛋白的構(gòu)象，從而阻斷其與ACE2的結(jié)合。兩種化合物的半最大效應(yīng)濃度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)分別達(dá)到了22 ng/ml和37 ng/ml。這項(xiàng)研究立足于全新的S蛋白靶點(diǎn)，為藥物開(kāi)發(fā)提供了新的方向。

許多研究者通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬(分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬)，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的小分子化合物進(jìn)行篩選，以尋求潛在的SARS-CoV-2抑制劑。Power等[47]針對(duì)S蛋白的Lys31和Lys353氨基酸殘基附近區(qū)域進(jìn)行篩選，得到了數(shù)種具有潛在抗病毒能力的化合物，其中ZINC02111387活性最強(qiáng)，EC50為1.12 μg/ml?；赗BD-ACE2結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)，篩選出的MU-UNMC-1、MU-UNMC-2、Q34[48-49]，其半抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration，IC50)分別為0.67、1.72、14.40 μmol/L。計(jì)算機(jī)輔助的應(yīng)用，大大縮短了藥物篩選和開(kāi)發(fā)時(shí)間，為應(yīng)對(duì)病毒的快速變異提供了有力工具，如Khan等[50]通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬，篩選出能夠與Omicron毒株的S蛋白形成穩(wěn)定化學(xué)鍵的C1～4 4種化合物；Bharathi等[51]從藻類中篩選出具有抑制Omicron毒株潛能的咖啡酸己糖苷和根皮素，為應(yīng)對(duì)快速傳播的Omicron毒株提供了參考。

中草藥及其活性成分

中藥在COVID-19的治療中發(fā)揮了重要作用。Kang等[52]對(duì)中藥治療COVID-19的臨床研究進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，結(jié)果表明中藥能夠有效降低患者由輕癥進(jìn)展至重癥的比例，降低重癥患者的死亡率，并能有效改善患者癥狀，縮短患者住院時(shí)間和核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間。目前應(yīng)用較為普遍的中藥有“三藥三方”(清肺排毒方劑、宣肺敗毒方劑、化濕敗毒方劑、連花清瘟膠囊、金花清感顆粒、血必凈注射液)、疏風(fēng)解毒方劑、雙黃連口服液等[52-54]。而中藥及其活性成分的作用機(jī)制也已成為研究熱點(diǎn)。

多數(shù)研究認(rèn)為，中藥的治療作用主要來(lái)源于其活性成分對(duì)炎癥的抑制作用[53]。但隨著研究的深入，許多研究也發(fā)現(xiàn)中藥及其活性成分能夠通過(guò)靶向S蛋白而抑制病毒侵入。甘草、麻黃是上述提及的中藥方劑中最為常見(jiàn)的組分。甘草中含有的甘草酸、甘草三萜皂苷(A3)、甘草次酸能夠與S蛋白的RBD結(jié)合，IC50分別為22、8.3、10.9 μmol/L；在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，甘草次酸的50%有效濃度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)為3.17 μmol/L，而A3由于還可以抑制病毒核酸復(fù)制所需的nsp7蛋白，其EC50達(dá)到了驚人的75 nmol/L[55-56]。麻黃提取物中分離出的3種活性成分4，6-二羥基喹啉-2-羧酸、4-羥基喹啉-2-羧酸和4-羥基-6-甲氧基喹啉-2-羧酸能夠與RBD結(jié)構(gòu)域中的受體結(jié)合基序結(jié)合，體外試驗(yàn)測(cè)得3種化合物的IC50分別為1.09、0.44、0.75 μmol/L[57]。

此外，還有許多中草藥及其活性成分也被發(fā)現(xiàn)靶向S蛋白，這為開(kāi)發(fā)新的中藥方劑及根據(jù)成分設(shè)計(jì)新藥提供了參考。如從何首烏中提取的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯能夠結(jié)合S蛋白的RBD，其IC50測(cè)得為30 μmol/L[58]。從葉下珠中提取的有機(jī)成分柯里拉京能夠結(jié)合到S蛋白Cys336-Phe374殘基形成的口袋結(jié)構(gòu)，其IC50為24.9 μmol/L[57]；許多中草藥中都含有的1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖能夠結(jié)合到S蛋白Glu340-Lys356殘基形成的口袋結(jié)構(gòu)中，阻斷S-ACE2相互作用，其IC50測(cè)得為46.9 μmol/L[59]；千金藤堿、草果精油、石榴皮提取物、蒲公英提取物也被發(fā)現(xiàn)能夠與S蛋白結(jié)合[60-63]。不過(guò)，這些中藥及植物提取成分的結(jié)合能力相對(duì)較弱，多在微摩爾級(jí)，而且其效果需要進(jìn)一步的動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)的證實(shí)。

老藥新用

部分已經(jīng)上市的“老藥”被發(fā)現(xiàn)能夠抑制SARS-CoV-2。如Hu等[64]發(fā)現(xiàn)，抗丙型肝炎病毒藥物氯環(huán)利嗪能夠結(jié)合到S2亞基FP結(jié)構(gòu)域的疏水口袋中，又進(jìn)一步針對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選，發(fā)現(xiàn)抗組胺藥物氯苯托品和促甲狀腺素受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑D3-βArr兩種化合物及其類似物能夠抑制SARS-CoV-2；抗真菌藥物伊曲康唑、雌激素類藥物苯甲酸雌二醇和抗人類免疫缺陷病毒藥物奈菲那韋也被發(fā)現(xiàn)能與S2亞基結(jié)合[65-66]。抗哮喘藥物孟魯斯特、扎魯斯特，抗真菌藥物聯(lián)苯芐唑能夠與RBD穩(wěn)定結(jié)合，阻斷RBD-ACE2相互作用[67-69]。這些“老藥”，不僅對(duì)新藥的設(shè)計(jì)研發(fā)具有啟示意義，更有著作為COVID-19治療輔助用藥的潛力。而且，“老藥”多已經(jīng)過(guò)了臨床應(yīng)用，其安全性、不良反應(yīng)、藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)等較為明確，能夠更便捷地應(yīng)用于臨床。

此外，還有一些很新穎的藥物研究方向，如含金屬化合物[70]等。

結(jié) 語(yǔ)

綜上，S蛋白是SARS-CoV-2感染的關(guān)鍵組分，因此靶向S蛋白的藥物具有很高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。許多人體內(nèi)固有的蛋白能夠與S蛋白結(jié)合，基于這些固有蛋白進(jìn)行藥物的設(shè)計(jì)研發(fā)能夠大大節(jié)省時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。此外，小分子復(fù)合物、中藥及植物提取成分以及老藥新用都是開(kāi)發(fā)藥物的潛力方向。