膠東地區(qū)不同家禽彎曲菌流行分布及耐藥特征分析

王 娟,黃秀梅,劉俊輝,李 彥,劉 娜,趙建梅,段笑笑,高玉斌,王 琳,趙 格,曲志娜,王君瑋

彎曲菌屬(Campylobacter)有15個種,其中的空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌是引起人類疾病的主要病原菌[1],可引起人急性胃腸炎和食物中毒,甚者發(fā)生瑞特氏病或吉蘭-巴雷綜合征等免疫性損傷性疾病;可引起動物的流產(chǎn)不孕、乳房炎及幼畜禽腹瀉以及家禽肝炎等[2]。空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌廣泛存在于家禽、家畜等動物體內(nèi),尤其是家禽及其產(chǎn)品成為彎曲菌向人類傳播的主要媒介,該菌也是國際公共衛(wèi)生關(guān)注的重點[3]。雖然彎曲菌在家禽致病方面的研究不多,但該菌在多數(shù)禽類腸道內(nèi)存在定殖,盡管不一定引起家禽發(fā)病,但據(jù)歐洲安全局研究證實人類80%彎曲菌感染是由禽類傳播導(dǎo)致的[4]。目前,隨著耐藥菌株的蔓延和多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn),人獸共患病原菌的流行特征和耐藥程度備受社會關(guān)注。

多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)是通過對細菌的7個管家基因測序獲得等位基因序列,經(jīng)比對分別獲得相應(yīng)的等位基因值,從而構(gòu)成每株菌的等位基因譜,從而得到相應(yīng)的序列型(Sequence type, ST)[5-6]。在MLST數(shù)據(jù)庫,每株菌株都有相對應(yīng)的唯一ST型別,以用語國際化分離菌株的信息比對與分析。

本研究對膠東地區(qū)不同家禽分離的131株禽源彎曲菌進行了MLST分型,同時測定了MIC值,初步分析了膠東地區(qū)不同禽源彎曲菌的流行分布特征,以及耐藥性差異。以期為掌握禽源彎曲菌在該地區(qū)的潛在風(fēng)險,預(yù)防該菌由家禽向人和產(chǎn)品傳播提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株空腸彎曲菌 標準菌株(ATCC33560)、結(jié)腸彎曲菌標準菌株(ATCC33559)均購自國家菌種保藏中心。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(Autofms 1000)、電熱恒溫水浴鍋、旋渦混合儀、PCR儀、電子天平、凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.4 樣品來源 2021年8月至10月期間,在膠東地區(qū)從37個家禽養(yǎng)殖場:蛋雞場14個、肉雞場13個、水禽場(肉鴨、鵝)10個,采集泄殖腔樣品共565份,用于本研究。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與鑒定

1.2.1.1 細菌分離與純化 將采集的拭子樣品放入分裝好含5%綿羊血的Bolton肉湯中,42 ℃微需氧條件下增殖24 h后,用接種環(huán)取增菌液劃線接種Skirrow血瓊脂培養(yǎng)基,42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h后;選擇透明、扁平、濕潤的菌落,接種于哥倫比血平板上進行純化培養(yǎng),同時涂片、染色、鏡檢。

1.2.1.2 細菌鑒定 挑取氧化酶試驗陽性、過氧化氫酶試驗陽性、馬尿酸鹽水解試驗陽性的新鮮單個菌落涂布于96孔靶板上,使用MS1000全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進行鑒定,同時接種ATCC33560、ATCC33559做陽性對照。

1.2.2 耐藥性檢測 根據(jù)養(yǎng)殖場菌株分離情況及每個養(yǎng)殖場不超過5株菌的原則,共選取67株空腸彎曲菌和64株結(jié)腸彎曲菌代表菌株,采用美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的的肉湯稀釋法測定,使用96孔藥敏板測定6類9種抗菌藥得最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration, MIC),并根據(jù)CLSI的判定標準獲得實驗菌株敏感(S)、中介(I)、和耐藥(R)的結(jié)果,同時質(zhì)控菌株ATCC33560同步進行實驗質(zhì)量控制,質(zhì)控菌株的MIC在質(zhì)控范圍內(nèi),且陽性對照和陰性對照都成立,則結(jié)果判讀有效。對3類及3類以上抗菌藥同時耐藥即為多重耐藥。

1.2.3 菌株MLST分型 參照MLST數(shù)據(jù)庫(http://www.mlst.net/databases/)推薦的方法,對131株獲得藥敏試驗結(jié)果菌株,分別選取空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌MLST分型相關(guān)的7個管家基因(空腸彎曲菌管家基因:aspA、glnA、glyA、gltA、tkt、pgm、uncA;結(jié)腸彎曲菌管家基因:asp、gln、hlt、hly、pgm、tkt、unc)擴增和測序引物進行MLST實驗[6]。25 μL反應(yīng)體系:12.5 μL Premix Ex Taq、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 1 μL、無菌去離子水10.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性2 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證,將片段大小與預(yù)期一致、條帶清晰明亮且單一的樣品送至上海生工生物工程有限公司測序。用BN軟件對測序返回數(shù)據(jù)進行處理,獲得各菌株所對應(yīng)的等位基因譜,確定其序列型,并構(gòu)建其最小生成樹,分析不同區(qū)域的流行菌株型。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理 使用SPSS 26.0軟件、卡方檢驗進行統(tǒng)計分析,P<0.01,則差異有統(tǒng)計學(xué)意義。利用BioNumerics7.6軟件構(gòu)建了基于MLST性別的最小生成樹。在最小生成樹種,一個圈代表一個MLST型,圈的大小代表菌株數(shù)量的多少,圓圈之間的距離代表禽源關(guān)系遠近。

2 結(jié) 果

2.1 分離鑒定結(jié)果 經(jīng)質(zhì)譜鑒定,565份泄殖腔樣品中共得到彎曲菌237株(詳見表1),總體分離率為41.95%,其中空腸彎曲菌127株,結(jié)腸彎曲菌110株,分離率分別為22.48%、19.47%。從不同家禽看,蛋雞源彎曲菌分離率最高(52.73%),其次是水禽(37.33%)、肉雞(33.33%);蛋雞源空腸彎曲菌分離率最高(33.18%),水禽源結(jié)腸彎曲菌分離率最高(21.33%)。且該地區(qū)3種不同來源菌株分離率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,詳見表2。

表1 膠東3種禽源采樣點樣品及菌株分布

表2 膠東地區(qū)不同家禽彎曲菌分離率(菌株數(shù)/樣品數(shù))

2.2 藥敏實驗結(jié)果

2.2.1 耐藥結(jié)果 根據(jù)CLSI的判定標準,67株空腸彎曲菌和64株結(jié)腸彎曲菌對9種藥物的耐藥情況見表2。膠東地區(qū)分離的空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌對9種藥物均有不同程度的耐藥。67株空腸彎曲菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素的耐藥十分嚴重,耐藥率均為92.54%以上,對慶大霉素、克林霉素、紅霉素、阿奇霉素、泰利霉素、氟苯尼考敏感,耐藥率均在15%以下;64株結(jié)腸彎曲菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸100%耐藥,對四環(huán)素耐藥率為96.88%,對慶大霉素耐藥率為85.94%,對克林霉素、紅霉素、阿奇霉素、泰利霉素為中等程度耐藥,耐藥率在51.56%～60.94%,對氟苯尼考最敏感,敏感率為71.87%。詳見圖1。

圖1 膠東地區(qū)禽源空腸彎曲菌與結(jié)腸彎曲菌耐藥率比較)

從不同家禽看,水禽源空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌對9種藥物大耐藥情況較肉雞和蛋雞源菌株都嚴重。蛋雞源空腸彎曲菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素耐藥率均在91%以上,對慶大霉素耐藥率為14.29%,對其余4種藥物均不耐藥;肉雞和水禽源結(jié)腸彎曲菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素3種藥物均耐藥。詳見表3。

表3 67株空腸彎曲菌與64株結(jié)腸彎曲菌對9種藥物的耐藥結(jié)果

2.2.2 多重耐藥結(jié)果 131株彎曲菌多重耐藥率為49.62%(65/131)。按大類分,11株空腸彎曲菌多重耐藥,占比為16.42%(11/67),3耐最多,未發(fā)現(xiàn)全耐空腸彎曲菌;54株結(jié)腸彎曲菌為多重耐藥,占比為84.38%(54/64),且5耐、6耐最多,占多耐菌株的72.22%(39/54)。多重耐藥結(jié)果見圖2、耐藥譜見表4。

圖2 膠東地區(qū)三種家禽源空腸彎曲菌與結(jié)腸彎曲菌多重耐藥結(jié)果)

從不同家禽看,空腸彎曲菌中,蛋雞無3耐以上菌株,肉雞、蛋雞、水禽3種禽源菌株多重耐藥率分別為10.53%(2/19)、11.43%(4/35)、38.46%(5/13);結(jié)腸彎曲菌中,3種禽源菌株均無0耐、1耐和4耐菌株,肉雞除1株2耐菌株外,其余菌株均為多重耐藥,且6耐菌株最多,占菌株數(shù)的47.62%(10/21),肉雞、蛋雞、水禽3種禽源菌株多重耐藥率分別為95.24%(20/21)、76%(19/25)、83.33%(15/18)。

2.3 彎曲菌MLST分型結(jié)果 67株空腸彎曲菌和64株結(jié)腸彎曲菌各自的7個管家基因擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與MLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中的菌株序列(www.mlst.net)BLAST比對分析可知(詳見表4):67株空腸彎曲菌共得到72個等位基因,包括3個新的等位基因,得到35個序列型。包括6個新的序列型,分布較分散,不同禽源菌株均無優(yōu)勢ST型,其中ST-8880、ST-1811、ST-8260、ST-760相對較多,各占菌株5.97%(4/67),說明該菌不同禽源間有較高的遺傳多樣性;64株結(jié)腸彎曲菌共得到27個等位基因,同源復(fù)合體CC-828最多,占59.38%(38/64),其中ST-1586序列型最多,占總數(shù)的23.44 %(15/64),其次是ST-825,占總數(shù)的17.19%。從菌株不同來源看,肉雞源結(jié)腸彎曲菌主要以ST-1586、ST-9944、ST-3735為主,約占菌株數(shù)的80.95%(17/21);水禽以ST-825、ST-1586居多,占72.22%(13/18)。對不同禽源分離菌株建立了基于MLST型別的最小生成樹,展示了不同禽源菌株的種群結(jié)構(gòu)及菌株間親緣關(guān)系,詳見圖3和圖4。

圖3 空腸彎曲菌基于不同禽源MLST最小生成樹)

(注:EC:蛋雞;BC:肉雞; WF:水禽)

3 討 論

彎曲菌中的空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌是重要的食源性致病菌。近年來,抗生素的不規(guī)范使用導(dǎo)致動物源彎曲菌的耐藥性日趨嚴重,耐藥菌株在“同一健康”下“動物-環(huán)境-人”之間傳播的對人類健康帶來影響。本研究通過監(jiān)測膠東地區(qū)分離的131株禽源彎曲菌對9種常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果發(fā)現(xiàn),彎曲菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素顯示出高水平耐藥,耐藥率在94%以上;尤其是結(jié)腸彎曲菌,除2株菌外,其余分離菌株均對這3種藥物耐藥;結(jié)腸彎曲菌對測試的9種藥物耐藥率均顯著高于空腸彎曲菌。不同家禽分離菌株耐藥程度差異較大,水禽源菌株對除四環(huán)素外的其余藥物敏感率均低于蛋雞和肉雞源菌株;蛋雞源空腸彎曲菌對克林霉素、紅霉素、阿奇霉素、泰利霉素、氟苯尼考無耐藥菌株。所以,在臨床藥物選擇上,對不同家禽應(yīng)注意規(guī)避對應(yīng)高耐藥物的使用。有報道顯示,雞源空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌對環(huán)丙沙星耐藥程度較高,耐藥率80%以上[7],甚至達到100%[8]。本研究中結(jié)腸彎曲菌對克林霉素、紅霉素、泰利霉素耐藥程度與于輝等[9]報道的50%～70%一致。膠東地區(qū)禽源結(jié)腸彎曲菌對慶大霉素的耐藥率與聶和敏等[10]報道的69.70%、張小燕等[7]報道的71.25%和唐夢君等[11]報道的71.00%相差不大,但較于輝等[8]報道的28.57%高54.76%。結(jié)腸彎曲菌多重耐藥情況嚴重,稍低于胡欣潔等[12]報道的94.5%,且出現(xiàn)對9種藥物全部耐藥菌株,說明存在常規(guī)藥物對人感染禽源結(jié)腸彎曲菌治療無效的風(fēng)險,這與王新等[13]人的研究結(jié)果一致。根據(jù)監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)的問題,有必要對喹諾酮類、四環(huán)素、氨基糖苷類抗生素在家禽養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用進行評價,從而指導(dǎo)家禽養(yǎng)殖企業(yè)對抗生素的合理使用,以避免抗生素的過度和重復(fù)使用,有效遏制耐藥菌株的產(chǎn)生和流行,從而保障人類健康。

MLST作為一種常用的分子分型方法,具有分辨率高、重復(fù)性強、數(shù)據(jù)可靠性、結(jié)果便于不同實驗室進行比較等優(yōu)點,被用于多種細菌的分型和溯源[14-15]。本研究針對膠東地區(qū)不同家禽分離的67株空腸彎曲菌和64株結(jié)腸彎曲菌進行了MLST分型,分別獲得了35種和19種不同的序列型,其中,8株分離菌株屬于6種新序列型,新序列型占比為10.91%,發(fā)現(xiàn)的新序列型數(shù)量占比與王新[13]從禽肉分離的菌株,及薛峰[16]、姚學(xué)萍[17]從家禽盲腸和腸道內(nèi)容物分離的菌株新序列型所占比例均有差異,這可能與不同地區(qū)分離菌株的遺傳進化有關(guān)[16-18]。本研究結(jié)果顯示,空腸彎曲菌ST型散在分布于各個同源復(fù)合體,該地區(qū)及不同禽源間均無優(yōu)勢ST型,與秦祥等[19]的研究一致,說明禽源空腸彎曲菌不是以單一克隆株的形式在該地區(qū)家禽養(yǎng)殖場水平傳播,并呈豐富多樣的遺傳進化;而一半以上的結(jié)腸彎曲菌ST型為同源復(fù)合體CC-828,ST-1586序列型為流行菌型,在肉雞場和水禽場內(nèi)的水平傳播及遺傳進化分別以ST-1586和ST-825型為主。但是,本研究得到1株肉雞源空腸彎曲菌為ST-51(CC-443),該ST型的空腸彎曲菌與人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病(GBS)有關(guān)[19],意味著攜帶該菌的動物群對人類來說會是一個巨大的潛在隱患。

彎曲菌在膠東地區(qū)家禽中分布廣泛,且不同家禽中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的攜帶情況略有差異;不同禽源彎曲菌耐藥程度有一定差異,結(jié)腸彎曲較空腸彎曲菌耐藥程度嚴重,且均為多重耐藥菌株;該地區(qū)空腸彎曲菌ST型散在分布且豐富多樣,結(jié)腸彎曲菌ST型相對集中,且菌株耐藥程度與ST型相關(guān)性不大。綜上所述,結(jié)腸彎曲菌對藥物更容易產(chǎn)生耐受,空腸彎曲菌在環(huán)境中容易發(fā)生變異,且存在導(dǎo)致人類嚴重疾病的空腸彎曲菌型,應(yīng)加強家禽養(yǎng)殖過程中彎曲菌的動態(tài)監(jiān)測,以便提高家禽產(chǎn)品質(zhì)量安全,降低從業(yè)人員感染風(fēng)險,保護人類健康安全。

利益沖突：無