青花椒果殼渣生物發(fā)酵產(chǎn)物濾液抗衰老功效探究

束成杰，張鋒倫，趙孔發(fā)，李卓航，馮志營(yíng)，傅 雷，鄭 丹，張衛(wèi)明*

（1.南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 211111；2.江蘇省天然香料工程技術(shù)中心，江蘇 南京 211111；3.昭通市大成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司，云南 昭通 6571004；4.南京師范大學(xué)泰州學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.），蕓香科花椒屬植物，因其果實(shí)成熟后為青色而得名，主要分布于我國(guó)云南、貴州、四川等地［1］。青花椒作為調(diào)味料和中藥使用歷史悠久［2］。現(xiàn)代研究顯示，花椒屬植物的化學(xué)成分主要包括生物堿、酰胺、木質(zhì)素、揮發(fā)油、香豆素、黃酮類和脂肪酸等［3-4］，有鎮(zhèn)痛、麻醉、抑菌、抗腫瘤等藥理活性，對(duì)心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫機(jī)能都有重要的作用，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和日化行業(yè)中具有巨大的應(yīng)用潛力［5-6］。

現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)是在繼承中藥炮制學(xué)中發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，吸取微生態(tài)學(xué)研究成果，結(jié)合現(xiàn)代微生物工程而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)。通過微生物發(fā)酵工藝制備天然產(chǎn)物發(fā)酵物，可以酶解藥材細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，更充分的釋放天然產(chǎn)物的有效成分，提高其利用率［7-8］。

目前，青花椒利用成分以精油為主，在萃取精油后，青花椒果殼渣被作為廢棄物處理。然而對(duì)其研究和開發(fā)利用甚少，其功效尚也未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過生物發(fā)酵的工藝對(duì)青花椒果殼渣進(jìn)行生物發(fā)酵，得到青花椒果殼發(fā)酵產(chǎn)物濾液，基于模式動(dòng)物秀麗線蟲探究青花椒果殼渣發(fā)酵產(chǎn)物濾液的功效探究，為青花椒資源的綜合開發(fā)以及高值利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料原料

青花椒果殼渣，青花椒果實(shí)由昭通市大成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司提供，南京野生植物綜合利用研究所充分提取精油后，自然晾干即得；

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）購自安琪酵母股份有限公司，

野生型秀麗線蟲N2由秀麗線蟲遺傳中心提供。

1.2 儀器設(shè)備

MQT-60R 搖床（上海旻泉有限公司）；LDZX-50KBS 高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SPX-150B-Z 生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；JW-25017HR 高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；Olympus-BX41 奧林巴斯顯微鏡（南京艾朗儀器有限公司）；DS-1組織粉碎機(jī)（北京華欣科創(chuàng)科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒酵母種子液制備方法

麥芽汁培養(yǎng)基在121℃，0.1 MPa 條件下滅菌20 min 后，接種釀酒酵母菌，設(shè)置培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，培養(yǎng)24 h；使菌體濃度達(dá)到108CFU/mL。

1.3.2 青花椒果渣生物發(fā)酵工藝

精確稱取青花椒果殼渣，粉碎過120目篩，按料液比1：10（g/mL）加入無菌去離子水，并調(diào)節(jié)pH 為6.0～6.5；按照5‰投料比例接種釀酒酵母種子液，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?5℃發(fā)酵72h，8 000 r/min 離心15min，取上清液在1200 Bar 條件下完成破壁，冷卻后過0.45μm 微孔濾膜［9］，得青花椒果殼渣發(fā)酵產(chǎn)物濾液（Ferment filtrate ofZ.schinifolium，F(xiàn)FZ）。

1.3.3 秀麗線蟲同步化

秀麗線蟲體內(nèi)出現(xiàn)大量蟲卵時(shí)，緩沖液洗脫收集至離心管中，加入1mL 裂解液（10%次氯酸：1 mol/L 氫氧化鈉=1：1），4 000 r/min，離心1min；去除裂解液，用緩沖液洗滌3次，將底層的蟲卵用移液器吸出，涂在含有大腸桿菌OP50 的培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)48～60 h，得年輕成蟲［10-11］。

1.3.4 FFZ對(duì)秀麗線蟲壽命的影響

將FFZ 用緩沖液稀釋成1%、2%、4%三個(gè)濃度，分別暴露年輕成蟲6h（保證線蟲食物充足）。線蟲壽命檢測(cè)方法參照已有文獻(xiàn)的報(bào)道［12-13］。雌雄同體的線蟲每天換一次培養(yǎng)皿。每一處理取40 條線蟲進(jìn)行壽命測(cè)試。收取曲線代表三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

1.3.5 FFZ對(duì)秀麗線蟲運(yùn)動(dòng)行為的影響

運(yùn)動(dòng)行為測(cè)試中，取頭部擺動(dòng)和身體彎曲這兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試方法參考之前的文獻(xiàn)報(bào)道［14-15］。頭部擺動(dòng)定義為線蟲彎曲半個(gè)身體，從一側(cè)轉(zhuǎn)到另一側(cè)的改變。測(cè)試時(shí)間為1min。身體彎曲定義為假設(shè)線蟲運(yùn)動(dòng)方向?yàn)閄 軸方向，那么燈泡狀第二咽泵呈Y 軸方向，即一個(gè)身體彎曲。每一處理取20條線蟲進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.6 FFZ對(duì)秀麗線蟲吞咽頻率的影響

隨機(jī)挑取20 條暴露后的秀麗線蟲，在奧林巴斯高倍顯微鏡下，觀察并記錄1min 內(nèi)秀麗線蟲的吞咽次數(shù)，作為秀麗線蟲吞咽頻率的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次［16-17］。

1.3.7 FFZ對(duì)秀麗線蟲排泄周期的影響

單獨(dú)的線蟲被取出檢測(cè)。當(dāng)線蟲體壁肌肉伸縮排泄到下一次體壁伸縮排泄的周期時(shí)間極為排泄周期。這一實(shí)驗(yàn)需在高倍顯微鏡下觀察。30 條線蟲為一組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次［18］。

1.3.8 FFZ對(duì)秀麗線蟲熱激反應(yīng)的影響

將暴露后的秀麗線蟲放置35℃條件下培養(yǎng)6 h，然后隨機(jī)挑取30條秀麗線蟲，20℃培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)平行。根據(jù)秀麗線蟲生存的條數(shù)繪制曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次［19］。

1.3.9 FFZ對(duì)秀麗線蟲腸道活性氧水平的影響

秀麗線蟲腸道內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平分析參考文獻(xiàn)［20-21］方法采用熒光探針DCFH-DA（2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽）檢測(cè)秀麗線蟲體內(nèi)的氧自由基水平。每個(gè)濃度處理50 條線蟲，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 FFZ對(duì)秀麗線蟲壽命的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1%，2%和4%的FFZ 能夠延長(zhǎng)線蟲的壽命，其中2%和4% FFZ 的影響顯著，而濃度為8%時(shí)，F(xiàn)FZ 對(duì)線蟲的壽命影響不顯著，與對(duì)照相當(dāng)（圖1-A）。從線蟲平均壽命來看（圖1-B），2%FFZ可以將線蟲壽命從19.33 天延長(zhǎng)22.33 天，4%FFZ 可以將線蟲壽命從19.33 天延長(zhǎng)至24.67 天。然而8%FFZ 處理以后，線蟲的壽命與對(duì)照相當(dāng)。因此，一定濃度的FFZ 能夠促進(jìn)線蟲機(jī)體細(xì)胞健康活躍，維持良好的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，延緩衰老。

圖1 FFZ對(duì)線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of FFZ treatment on lifespan of nematodes

運(yùn)動(dòng)行為能力以頭部擺動(dòng)和身體彎曲為終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以為秀麗線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育狀況提供評(píng)價(jià)參考。本試驗(yàn)中，2%和4%的FFZ 能夠顯著性地提高頭部擺動(dòng)與身體彎曲能力（圖2A，B），線蟲活躍度提高。因此，2%和4%的FFZ 能顯著提高秀麗線蟲運(yùn)動(dòng)能力，減緩機(jī)體衰老。

圖2 FFZ對(duì)線蟲頭部擺動(dòng)（A）和身體彎曲（B）的影響Fig.2 Effects of FFZ treatment on head thrash（A）and body bend（B）of nematodes

咽泵運(yùn)動(dòng)能夠反映秀麗線蟲攝取食物能力，攝食能力強(qiáng)可反應(yīng)由反應(yīng)秀麗線蟲機(jī)體健康水平。如圖3所示，與對(duì)照組相比，1%，2%的FFZ對(duì)秀麗線蟲的咽泵運(yùn)動(dòng)未出現(xiàn)顯著影響，當(dāng)FFZ 濃度為4%時(shí)，咽泵運(yùn)動(dòng)頻率顯著增加，然而濃度為8%時(shí)，咽泵運(yùn)動(dòng)能力與對(duì)照相當(dāng)。由此可見，4%FFZ 能夠通過提高攝食能力，維持線蟲良好狀態(tài)。

圖3 FFZ對(duì)咽泵運(yùn)動(dòng)的影響Fig.3 Effects of FFZ treatment on pumping rates of nematodes

排泄周期是評(píng)價(jià)秀麗線蟲抗氧化的重要指標(biāo)，秀麗線蟲生長(zhǎng)及生命狀態(tài)越好，其細(xì)胞代謝能力越強(qiáng)，排泄周期越短。如圖4所示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)FZ 處理秀麗線蟲，代謝能力1%～8%的FFZ 能夠提高秀麗線蟲代謝能力，提高秀麗線蟲有機(jī)體抗氧化水平，其中2%，4%FFZ 處理秀麗線蟲，排泄周期顯著縮短，代謝加快，機(jī)體抗氧化水平提高。

圖4 FFZ對(duì)排泄周期的影響Fig.4 Effects of FFZ treatment on defecation of nematodes

內(nèi)源性ROS 是含氧的化學(xué)物質(zhì)，是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要的作用。然而，當(dāng)其水平超過了細(xì)胞抗氧化能力時(shí)，就會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞反應(yīng)，造成細(xì)胞嚴(yán)重且廣泛的氧化。ROS 水平急劇增加，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p害，這就被稱為氧化應(yīng)激。熒光探針DCFH-DA 能夠與腸道內(nèi)ROS 結(jié)合，在激發(fā)光下呈現(xiàn)綠色熒光。通過軟件換算成表達(dá)量，如圖5所示，4%FFZ 處理秀麗線蟲后，腸道ROS 的綠色熒光表達(dá)顯著性下降，表明腸道內(nèi)ROS 顯著減少，機(jī)體抗氧化水平顯著提高。

圖5 FFZ對(duì)線蟲腸道ROS表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of FFZ treatment on intestinal ROS production of nematodes

熱應(yīng)激效應(yīng)能引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物增加，氧自由基、過氧化物含量增高，抗氧化酶分解氧化物速度很難跟上氧化代謝反應(yīng)的速度，嚴(yán)重影響了機(jī)體正常的生理代謝，發(fā)生組織損傷［22］。熱激以后，秀麗線蟲的壽命出現(xiàn)顯著性的縮短，從正常壽命20±1 天縮短至14.33 天，而1%～8%FFZ 均能夠延長(zhǎng)秀麗線蟲熱激后的壽命，2%，4%，8%的FFZ 效果顯著，8%的FFZ由于濃度高，可能引起機(jī)體在物理滲透等方面存在壓力，效果劣于其他濃度。由此說明，合適濃度的FFZ 能夠減少熱激導(dǎo)致的機(jī)體損傷，提高抗氧化能力。

圖6 FFZ對(duì)線蟲熱激后的壽命的影響Fig.6 Effects of FFZ treatment on lifespan after heating stress of nematodes

4 結(jié)論與展望

青花椒作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥，已被應(yīng)用多年。青花椒精油具有除螨抑菌功效，花椒生物堿已被證明具有多種藥理作用，包括抗菌作用、抗炎作用以及血脂調(diào)節(jié)作用。本研究從生物發(fā)酵的角度綜合開發(fā)利用青花椒果殼渣，探究了發(fā)酵產(chǎn)物的功能。借助模式動(dòng)物秀麗線蟲探究了發(fā)酵產(chǎn)物的體內(nèi)功效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青花椒果殼渣在釀酒酵母的作用下產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物濾液具有良好的抗氧化功效。可為青花椒資源的充分開發(fā)利用提供理論參考。

生物發(fā)酵產(chǎn)品因其顯著的產(chǎn)品功效、良好的膚感、安全無毒、低刺激，并且成分更加簡(jiǎn)單和天然，在美白、保濕、抗衰老等日化應(yīng)用方面都有很好的應(yīng)用潛力。目前，生物發(fā)酵過程中植物或者中藥材間相互作用機(jī)理的研究還比較欠缺，并且能夠應(yīng)用到中藥微生物發(fā)酵制品中的中藥單方、復(fù)方也較少，還需將中醫(yī)理論進(jìn)一步地與現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行結(jié)合。目前對(duì)發(fā)酵過程中微生物與植物或者中藥材之間的作用較多地停留在體外功效和活性物質(zhì)的研究上，隨著皮膚微生態(tài)研究領(lǐng)域的發(fā)展，還需要進(jìn)一步考慮發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)人體皮膚微生態(tài)的影響。盡管植物發(fā)酵技術(shù)在應(yīng)用中也存在著各種問題，但隨著相關(guān)理論和技術(shù)的不斷深入和完善，植物生物發(fā)酵技術(shù)會(huì)在化妝品中有更光明的應(yīng)用前景。