富硒黃山貢菊多糖的提取及其抗氧化活性研究

杭 華，許丹丹，汪昌保，杜冬生，張金銘，戴翠紅，雷曉璐，盧留穎，胡瀚洋

（1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.安徽師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

菊花（Chrysanthemum morifoliumRamat.）是菊科植物菊的頭狀花序，味甘、性寒，具有清熱、健肝、明目、解毒、改善心血管健康、防止氧化損傷和抑制炎癥等功效［1］，其為2009年衛(wèi)生部首批批準(zhǔn)的藥食同源的植物。2015年版《中國藥典》將杭菊、亳菊、滁菊、貢菊、懷菊等歸為藥用菊花，菊花可用于藥用、保健和功能性食品等，因此受到青睞［2］。黃山貢菊亦稱“徽州貢菊”，產(chǎn)自著名的旅游勝地黃山地區(qū)，其既有觀賞價(jià)值，也是藥食兩用的保健品。菊花的主要成分有揮發(fā)性油、黃酮類化合物、綠原酸和多糖類等。植物多糖具有抗氧化、降血糖、抗衰老、調(diào)節(jié)脂代謝、提高免疫力和抗病能力等功能，使其成為研究的熱點(diǎn)［3］。菊花多糖作為菊花主要活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化（清除活性自由基）等作用，開展菊花多糖的研究具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值［4］。

微量硒元素對人體的健康至關(guān)重要，其具有抗病毒、抗癌與提高機(jī)體免疫等能力［5］。無機(jī)硒對人體是有毒的，需要轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒來被人體利用；有機(jī)硒主要以硒多糖、硒蛋白等形式存在。硒多糖來源有天然硒多糖、微生物硒多糖和合成硒多糖［6］，其中通過植物的生物富集作用來轉(zhuǎn)化有機(jī)硒，是目前最有效、最安全的方法［7］。硒多糖與普通多糖的不同之處在于其獨(dú)特的硒氧鍵，具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)［8］，且有利于人體吸收利用［9］。趙子華等［10］研究富硒菊花提取物的抗氧化活性，結(jié)果表明富硒菊花提取物的抗氧化活性優(yōu)于普通菊花。張斐然［11］開展了富硒菊花多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)表征等研究，獲得良好的結(jié)果。然而，富硒黃山貢菊多糖的提取與生理活性等方面的研究尚未見。本研究擬采用響應(yīng)面優(yōu)化富硒黃山貢菊多糖的超聲輔助提取工藝，探究富硒黃山貢菊多糖的體外抗氧化性活性，為富硒貢菊多糖進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

富硒黃山貢菊（安徽省黃山市休寧縣藍(lán)田鎮(zhèn)菊花合作社提供）；1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，純度≥97%，購于國藥集團(tuán)）；2.2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，純度≥98%，購于國藥集團(tuán)）；其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用試劑（分析純）。

1.2 試驗(yàn)儀器

KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-20M 臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀集團(tuán)）；AFS-993 原子熒光光度計(jì)（北京吉天儀器有限公司）；WSC-S 色差計(jì)（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）；FTIR-650 傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技股份有限公司）；JSM-6390LV 掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

2 方法

2.1 富硒黃山貢菊多糖的制備

將干燥的富硒黃山貢菊（含水量＜6%）粉碎過篩（孔徑0.28 mm），稱量富硒黃山貢菊粉末5 g，放入300 mL 三角瓶中，加入125 mL 蒸餾水，在不同條件下進(jìn)行超聲提取，離心（8000 rpm，10 min）過濾，收集上清液，濾渣再提取一次，收集合并上清液（體積V）。采用真空濃縮將上清液濃縮至約20%V，向濃縮液中加入3 倍體積的無水乙醇，放置于冰箱冷藏過夜，離心（8000 rpm，10 min）收集沉淀，將沉淀物真空冷凍干燥，得到富硒黃山貢菊多糖，低溫保存?zhèn)溆?。富硒黃山貢菊多糖的提取率：

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

選擇液料比（15、20、25、30、35 mL/g），超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min），超聲功率（40、50、60、70、80W），超聲溫度（40、50、60、70、80℃）為參考因素，以富硒黃山貢菊多糖提取率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取富硒黃山貢菊多糖的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比（25 mL/g）為固定值，以富硒黃山貢菊多糖的提取率為響應(yīng)值，選擇超聲時(shí)間、提取溫度和超聲功率等三個(gè)因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)（表1）。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface trials

2.4 富硒黃山貢菊多糖的初步純化

依據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝條件來提取富硒黃山貢菊多糖，將提取液與大孔樹脂D101按照體積比2：1，室溫處理8 h，過濾收集濾液；用去離子水洗滌樹脂2 次，收集洗滌液，與濾液合并，將合并液真空濃縮至原體積的20%。濃縮液經(jīng)Sevag 法脫蛋白處理后，加入3 倍體積的無水乙醇，離心收集沉淀，經(jīng)真空冷凍干燥，獲得初步純化的富硒黃山貢菊多糖。

2.5 富硒黃山貢菊多糖抗氧化活性的檢測

2.5.1 DPPH·自由基清除能力

依據(jù)Zheng 等［12］實(shí)驗(yàn)方法，以Vc 為陽性對照，檢測不同濃度富硒黃山貢菊多糖溶液對DPPH·清除能力（IDPPH·），其計(jì)算公式如下：

式中：A0-空白對照的吸光值，Ai-試驗(yàn)樣品的吸光值，Aj-無水乙醇代替DPPH吸光值。

2.5.2 羥基自由基清除能力

依據(jù)Wang等［13］實(shí)驗(yàn)方法，以Vc為陽性對照，檢測不同濃度富硒黃山貢菊多糖溶液對羥基自由基清除能力（I·OH），其計(jì)算公式如下：

式中：A0-空白對照的吸光值，Ai-試驗(yàn)樣品的吸光值，Aj-蒸餾水代替雙氧水的吸光值。

2.5.3 ABTS+?自由基清除能力

依據(jù)Thaipong 等［14］實(shí)驗(yàn)方法，以Vc 為陽性對照，檢測不同濃度富硒黃山貢菊多糖溶液對ABTS+自由基清除能力（IABTS+），其計(jì)算公式如下：

式中：A0-空白對照的吸光值，Ai-試驗(yàn)樣品的吸光值，Aj-蒸餾水代替ABTS的吸光值。

2.5.4 總還原能力

依據(jù)kozarshi 等［15］實(shí)驗(yàn)方法，檢測不同濃度富硒黃山貢菊多糖溶液的還原能力（RFe3+），其計(jì)算公式如下：

式中：Ai-試驗(yàn)樣品的吸光值，A0-空白對照的吸光值，Aj-蒸餾水代替Fe3+的吸光值。

2.6 富硒黃山貢菊多糖的檢測

2.6.1 色度測定

利用色差計(jì)進(jìn)行檢測。L*值為亮度，a*值為紅綠度，b*值為黃藍(lán)度；較高a*值傾向于紅色，較高b*值傾向于黃色。測得數(shù)值使L*×a*×b*系統(tǒng)中的色差公式：ΔΕ=

2.6.2 掃描電鏡

掃描電子顯微鏡觀察超聲提取法和水提法獲得富硒黃山貢菊多糖，取適量的多糖粉末固定在樣品臺上，進(jìn)行噴金，放大至1 000倍進(jìn)行觀察。

2.6.3 紅外光譜掃描

采用溴化鉀（KBr）壓片法進(jìn)行富硒黃山貢菊多糖的傅里葉紅外光譜分析。稱取2 mg 富硒黃山貢菊多糖樣品，置于研缽內(nèi)，加入干燥的KBr，充分混勻研磨，壓制成片。放入傅里葉紅外光譜儀內(nèi)進(jìn)行檢測，在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描獲得圖譜。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)分析

3.1.1 料液比的試驗(yàn)結(jié)果

在超聲功率60 W、超聲時(shí)間30 min、提取溫度70℃的條件下，結(jié)果如圖1A所示，富硒黃山貢菊多糖提取率先增大后傾向于平緩；當(dāng)料液比≥25 mL/g時(shí)，多糖提取率變化不大。因此，最適料液比為25 mL/g。

3.1.2 超聲時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果

超聲時(shí)間對富硒黃山貢菊多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1B所示。隨著超聲時(shí)間的提升，富硒黃山貢菊多糖提取率呈現(xiàn)先升后降，可能是超聲時(shí)間的增加，促進(jìn)多糖的降解［16］。當(dāng)超聲時(shí)間超過30 min時(shí)，富硒黃山貢菊多糖提取率下降明顯。因此，最適超聲時(shí)間為30 min。

3.1.3 提取溫度的試驗(yàn)結(jié)果

提取溫度對富硒黃山貢菊多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1C 所示。隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，多糖溶出率增大，多糖提取率先快速上升；當(dāng)提取溫度≥70℃時(shí)，多糖提取率增速趨于平緩。因此，最適提取溫度為70℃。

3.1.4 超聲功率的試驗(yàn)結(jié)果

超聲功率對富硒黃山貢菊多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1D 所示。在超聲功率40～80 W 范圍內(nèi)，富硒黃山貢菊多糖提取率呈現(xiàn)先提高后降低；當(dāng)超聲功率為60 W 時(shí)，多糖提取率最高。因?yàn)樵龃蟪暪β誓艽龠M(jìn)細(xì)胞破碎，提高多糖溶出率；然而，當(dāng)超聲功率＞60 W 時(shí)，可能引起多糖分解。因此，最適超聲功率為60 W。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Experimental results of single factor

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇料液比25 mL/g，以富硒黃山貢菊多糖提取率為響應(yīng)值，選擇3因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表2，方差分析結(jié)果如表3，響應(yīng)面曲面圖見圖2。

圖2 各因素響應(yīng)面分析Fig.2 Response surface analysis of each factor

表2 富硒黃山貢菊多糖提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface trials for selenium-rich Huangshan Gongju polysaccharides extraction

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis of variance of regression model

富硒黃山貢菊多糖提取率（Y）對超聲時(shí)間（A）、超聲溫度（B）和超聲功率（C）的二次項(xiàng)回歸模：Y=15.7+0.375A+0.39B-0.315C+0.15AB-0.3AC-0.23BC-1.69A2-1.31B2-1.51C2。

回歸模型的F值（36.72）和較低的P值（P＜0.001），表明該模型是高度顯著的。本模型的R2為0.979 3，R2Adj為0.952 6，說明回歸模型與試驗(yàn)結(jié)果具有良好的擬合度，可用于預(yù)測和分析富硒黃山貢菊多糖提取率。線性系數(shù)（A、B、C）是顯著的（P＜0.05），二次項(xiàng)系數(shù)（A2、B2、C2）是極其顯著的（P＜0.001），其他系數(shù)是不顯著的（P＞0.05）。通過觀察線性和二次系數(shù)，單因素對富硒黃山貢菊多糖提取率的響應(yīng)程度為提取溫度＞超聲時(shí)間＞超聲功率。

響應(yīng)曲面圖和等高線圖常用來表示變量間的交互作用和變量與響應(yīng)值關(guān)系的變化。如圖4（A）所示，隨著超聲時(shí)間和超聲溫度的增加，富硒黃山貢菊多糖的提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢；可能的原因是開始超聲能使細(xì)胞破壁，促進(jìn)多糖釋放到溶劑中，提高多糖的提取率；然而，隨著超聲功率升高和時(shí)間延長，多糖易發(fā)生降解，導(dǎo)致提取率降低。同樣，超聲功率和超聲時(shí)間也可以從圖4（B，C）中看到。在該實(shí)驗(yàn)提取溫度范圍內(nèi)，其對富硒黃山貢菊多糖提取率呈現(xiàn)正相關(guān)作用。

3.2.2 模型驗(yàn)證

通過響應(yīng)面優(yōu)化富硒黃山貢菊多糖超聲提取條件分析，最佳提取工藝條件為：超聲時(shí)間31.3 min，超聲溫度71.8℃，超聲功率58.7 W，預(yù)測富硒黃山貢菊多糖最佳提取率為15.8%?？紤]實(shí)際操作，將最佳提取條件調(diào)整為超聲時(shí)間30 min，超聲溫度70℃，超聲功率60 W，在此條件下重復(fù)三次提取，獲得富硒黃山貢菊多糖的提取率為15.83±0.10%，與預(yù)測值基本一致，因此采用響應(yīng)面得到二次回歸模型可用于富硒黃山貢菊多糖的最佳提取工藝。

3.3 富硒黃山貢菊多糖的測定

依據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取的工藝條件，以水提法為對照。利用苯酚-硫酸法［17］測定富硒黃山貢菊多糖提取率。超聲輔助提取富硒黃山貢菊多糖提取率為15.83%，水提富硒黃山貢菊多糖提取率為13.46%。應(yīng)用凱氏定氮法測富硒黃山貢菊多糖中蛋白質(zhì)含量［18］。超聲輔助提取多糖中蛋白質(zhì)含量為3.23%，水提法多糖中蛋白質(zhì)含量為2.83%。采用Chen 等［19］方法，測定富硒黃山貢菊多糖的硒含量。超聲輔助提取法獲得硒含量為1.276 mg/kg，水提法獲得硒含量為0.408 mg/kg。結(jié)果表明：超聲輔助提取富硒黃山貢菊多糖優(yōu)于水提法，原因可能是超聲能促進(jìn)細(xì)胞破裂，有利于（硒）多糖和（硒）蛋白分泌出來。

3.4 體外抗氧化活性

以VC抗氧化活性為對照，結(jié)果如圖3所示，富硒黃山貢菊多糖的抗氧化活性（DPPH·自由基的清除作用、羥基自由基的清除作用與ABTS+清除作用）明顯低于VC的抗氧化活性。因此，超聲輔助提取與水提富硒黃山貢菊多糖的抗氧化活性將做如下分析。

3.4.1 DPPH·自由基的清除作用

DPPH·自由基清除試驗(yàn)作為常規(guī)的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)之一。富硒黃山貢菊多糖顯示出較好的DPPH·清除活性，與其濃度呈正相關(guān)，如圖3A所示。隨著濃度的升高，富硒黃山貢菊多糖對DPPH·自由基的清除能力也隨之提高；當(dāng)濃度為0.6 mg/mL 時(shí)，富硒黃山貢菊多糖對DPPH·的清除能力達(dá)到最大值，且超聲輔助法為78.14%，水提法為74.62%。超聲輔助提取多糖對DPPH·自由基的清除能力高于水提法，可能原因是超聲輔助能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)抗氧化內(nèi)容物分泌出來。

3.4.2 羥基自由基的清除作用

富硒黃山貢菊多糖對·OH清除能力，如圖3B所示。富硒黃山貢菊多糖濃度在2～10 mg/mL 范圍內(nèi)，隨著濃度增加，其對·OH 清除能力呈上升趨勢，且超聲提取多糖對·OH 清除率比水提多糖高。當(dāng)多糖濃度為0.8 mg/mL 時(shí)，超聲提取多糖對·OH 清除率達(dá)到93.26%，水提多糖對·OH 清除率達(dá)到91.38%。

3.4.3 ABTS+清除作用

富硒黃山貢菊多糖對ABTS+清除能力，如圖3C所示。富硒黃山貢菊多糖濃度在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，其對ABTS+清除能力呈逐步升高趨勢，且超聲提取多糖對·OH 清除率比水提多糖高。當(dāng)多糖濃度為0.6 mg/mL 時(shí)，超聲提取多糖對ABTS+清除率達(dá)到82.43%，水提多糖對·OH 清除率達(dá)到80.26%。

3.4.4 Fe3+還原能力

Fe3+還原能力是測定多糖的抗氧化能力，其數(shù)值反映多糖的總抗氧化活性。富硒黃山貢菊多糖的Fe3+還原能力，如圖3D 所示。富硒黃山貢菊多糖濃度在2～12 mg/mL 范圍內(nèi)，隨著多糖濃度增加，吸光值升高，F(xiàn)e3+還原能力越強(qiáng)，富硒黃山貢菊多糖濃度與鐵還原力呈線性關(guān)系，且超聲提取多糖的Fe3+還原能力比水提多糖略高。

圖3 富硒黃山貢菊多糖的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant ability of selenium-enriched Huangshan Gongju polysaccharide

3.5 富硒黃山貢菊多糖的特性

3.5.1 色差分析

采用色差計(jì)檢測結(jié)果：超聲輔助提取多糖（L*1=67.64、a*1=-0.24、b*1=2.73），水提多糖（L*2=68.5、=-2.48、b*2=3.57），經(jīng)計(jì)算ΔE 為2.542 2。結(jié)果

表明：兩種方法提取的多糖粉末，顏色差異肉眼可見；超聲多糖測得的L*小于水提多糖，說明兩者之間的成分含量存在差異。孔維楠等［20］研究表明糖度增加，L*數(shù)值減小。采用超聲提取多糖含量高于水提法，與孔維楠等研究結(jié)果一致。

3.5.2 掃描電鏡分析

采用掃描電鏡觀察水提法和超聲輔助法提取富硒黃山貢菊多糖粉末的微觀結(jié)構(gòu)，如圖4所示?？梢钥闯鏊岱ǎˋ）和超聲輔助提取法（B）的多糖表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜，水提多糖呈纖維狀，而超聲多糖表面呈顆粒狀，凝結(jié)成塊；可能是超聲輔助提取過程中空穴效應(yīng)產(chǎn)生剪切力造成的［21］，引起多糖鍵斷裂產(chǎn)生較多小分子多糖，小分子多糖聚集。同樣，超聲對富硒黃山貢菊細(xì)胞的破壞力更強(qiáng)，促進(jìn)多糖從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，從而導(dǎo)致兩種提取方式糖含量的差距。

圖4 掃描電鏡圖（A.水提多糖；B.超聲輔助提取多糖）Fig.4 Scanning electron microscope（A.Water extraction of polysaccharide；B.Ultrasonic assisted extraction of polysaccharide）

3.5.3 紅外光譜分析

富硒黃山貢菊多糖經(jīng)脫色脫蛋白后，多糖進(jìn)行紅外光譜分析（蛋白影響可以忽略）。從圖5可以看出，兩種方法提取的多糖具有相似的多糖特征吸收峰。依據(jù)崔杰等［22］對榮保靈芝1號多糖的紅外光譜分析結(jié)果，水提多糖（A）和超聲輔助提取多糖（B）在1 000 cm-1左右都有強(qiáng)而寬的C-H（-CH2）伸縮震動(dòng)峰，在2 921.6 cm-1（A），2 927.4 cm-1（B）處也有C-H伸縮震動(dòng)峰，說明富硒黃山貢菊多糖不含糖醛酸。根據(jù)金志民等［23］研究東北紅松蘑多糖的結(jié)果，在1 746.27 cm-1處都有C=O 的伸縮振動(dòng)峰，說明富硒黃山貢菊多糖為吡喃糖。依據(jù)葛含靜［24］對光皮木瓜多糖的研究結(jié)果，水提多糖和超聲輔助提取多糖在1 614.1 cm-1處有C=C 的共軛伸縮振動(dòng)峰，800～1 200 cm-1吸收峰，說明富硒黃山貢菊多糖主要是α-吡喃糖。

圖5 紅外光譜圖（A.水提多糖；B.超聲輔助提取多糖）Fig.5 Infrared spectrum（A.Water extraction of polysaccharide；B.Ultrasonic assisted extraction of polysaccharide）

4 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取富硒黃山貢菊多糖的工藝，獲得最佳條件：超聲時(shí)間30 min，提取溫度70℃和超聲功率60 W；提取率為15.83%。富硒黃山貢菊多糖經(jīng)初步純化后，以水提多糖為對照，超聲輔助提取多糖在多糖提取率、蛋白含量、硒含量及抗氧化活性均高于水提多糖。利用色差分析、掃描電鏡與紅外光譜等分析，探討富硒黃山貢菊多糖的色差、顆粒表面和化學(xué)鍵等特性。由于多糖的性質(zhì)功能與其組成、結(jié)構(gòu)及分子量等密切相關(guān)［25］，后續(xù)將開展富硒黃山貢菊多糖的純化、化學(xué)結(jié)構(gòu)及其生物功能等方面的研究工作，為富硒黃山貢菊多糖的研發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。