單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在鼻咽癌免疫微環(huán)境中的研究進展

應(yīng)敏，劉金坤

0 引言

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）好發(fā)于人咽隱窩及側(cè)壁。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計，約有13.3萬新發(fā)鼻咽癌病例，其中，超過75%的鼻咽癌病例分布在東亞和東南亞，尤其是在中國南部[1]，我國5年內(nèi)診斷為鼻咽癌的患者達13.85萬[2]。鼻咽癌的產(chǎn)生與環(huán)境因素、遺傳易感性和EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染密切相關(guān)[2]，其病理特征表現(xiàn)為腫瘤病灶周圍和內(nèi)部的免疫細胞大量浸潤，提示NPC中存在復(fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment,TIME）[3]。

單細胞測序技術(shù)在解析鼻咽癌免疫微環(huán)境方面具有重要作用。目前單細胞技術(shù)應(yīng)用于NPC的研究主要是使用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell RNA sequencing,scRNA-seq）技術(shù)分析NPC患者的外周血和腫瘤組織中的免疫微環(huán)境，而單細胞表觀組測序、單細胞DNA測序、單細胞蛋白組測序在鼻咽癌中的應(yīng)用尚未見相關(guān)報道。本文系統(tǒng)分析了鼻咽癌的單細胞轉(zhuǎn)錄組文獻，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌免疫微環(huán)境中的免疫細胞主要包括髓系細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷（NK）細胞和非免疫細胞的成纖維細胞。本文將介紹scRNA-seq技術(shù)在鼻咽癌中的應(yīng)用，并根據(jù)其在NPC免疫微環(huán)境中的應(yīng)用，按照細胞類型分別進行綜述。

1 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

scRNA-seq技術(shù)能夠?qū)δ[瘤組織的單個細胞mRNA水平進行分析[4]。scRNA-seq技術(shù)的迅速發(fā)展，為解析腫瘤浸潤性免疫細胞的異質(zhì)性及其與腫瘤中各種細胞類型的相互作用提供強有力的工具支撐。腫瘤浸潤性免疫細胞研究經(jīng)常使用兩種類型的scRNA-seq技術(shù)：一種基于微孔板，將單個細胞分選到板孔道中制備RNA文庫，如SMARTseq2、MATQ-seq、SUPeR-seq測序，檢測基因表達敏感度高，但是一次只能分析數(shù)十到數(shù)百個細胞；另一種是將單個細胞包裹在液滴中制備RNA文庫，如Drop-seq、STRT-seq、Seq-Well測序，檢測基因表達敏感度較低，但是一次實驗可獲得數(shù)千個細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)，可對組織中的細胞類型進行更全面的采樣，特別是對于稀有細胞類型更具優(yōu)勢。盡管這兩種技術(shù)各有優(yōu)缺點，但結(jié)合互補優(yōu)勢可更加全面地研究腫瘤免疫微環(huán)境。

針對NPC的scRNA-seq研究主要過程包括選取NPC患者和非NPC患者的鼻咽活檢組織樣本或外周血樣本，制備單細胞混懸液，構(gòu)建文庫，上機測序和數(shù)據(jù)分析。臨床樣本的病理特征、取樣部位、處理方法會影響組織中的細胞亞群構(gòu)成。對NPC患者標(biāo)本進行scRNA-seq檢測，可為剖析腫瘤免疫微環(huán)境的組成、異質(zhì)性、動態(tài)變化和調(diào)控帶來新的見解。如scRNA-seq技術(shù)可識別參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸細胞亞群和信號通路，鑒定細胞的功能、狀態(tài)、分化發(fā)育，分析單核苷酸變異、RNA水平的基因表達變化、細胞間的相互作用和放化療后細胞的改變[5]，有利于發(fā)現(xiàn)新的細胞亞群、免疫耐藥的靶點及分析藥物引起的信號通路和細胞反應(yīng)[6]。scRNA-seq技術(shù)被廣泛應(yīng)用于鼻咽癌免疫微環(huán)境的研究中，根據(jù)目前的研究結(jié)果對NPC免疫微環(huán)境中不同類型的細胞分類進行綜述。

2 scRNA-seq技術(shù)分析鼻咽癌免疫微環(huán)境中的髓系細胞

腫瘤浸潤髓系細胞由幾個主要的譜系組成，包括單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells,pDC）和常規(guī)樹突狀細胞（conventional dendritic cells,cDC）。cDC又可以分為CLEC9A+DC（cDC1）和CD1C+DC（cDC2）。cDC1與鼻咽癌的良好預(yù)后和EBV陰性相關(guān)[7]，構(gòu)成了負責(zé)交叉啟動抗腫瘤CD8+T細胞的關(guān)鍵亞型，并且對抗腫瘤免疫至關(guān)重要[8]。干擾素（IFN）反應(yīng)相關(guān)通路在cDC和巨噬細胞中均上調(diào)[9]。巨噬細胞對NPC的特殊適應(yīng)可能與EBV感染有關(guān)，這可能觸發(fā)并維持TIME中高水平的炎性反應(yīng)。人顆粒酶B（granzyme B,GZMB）和免疫球蛋白J鏈（joining chain of multimeric IgA and IgM,JCHAIN）在pDC中高度表達，表明該群體中的細胞可能表現(xiàn)出GZMB依賴性細胞毒性[7,9]。

多篇報道證實NPC中存在不同于cDC1、cDC2的細胞亞群，這類DC細胞亞群以溶酶體膜蛋白3（LAMP3）為標(biāo)志物，命名為LAMP3+DC細胞[7,9-11]。這類細胞也出現(xiàn)在肝癌[12]、乳腺癌[13]、肺癌[14]和結(jié)直腸癌[15]中。LAMP3+DC是成熟態(tài)的DC，且具有較高的遷移能力，它可能起源于cDC1和cDC2[9]。LAMP3+DC細胞發(fā)揮廣泛調(diào)節(jié)淋巴細胞的作用，與T細胞、NK細胞相互作用的配體-受體數(shù)量較多[7]。LAMP3+DC細胞通過配體CCL19、CCL22分別與T細胞、DC細胞上的受體CCR7、CCR4的相互作用，并通過配體CD86作用于Treg細胞上的受體CD28、CTLA4[12,16]。LAMP3+DC細胞和Treg細胞之間的聯(lián)系也在其他腫瘤中得到證實[17]，其中LAMP3+DC細胞增強外周血中Treg細胞的趨化募集并促進它們在腫瘤中的浸潤[18]。此外，LAMP3+DC細胞在NPC中高表達吲哚胺2,3-雙加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1），可以促進抑制性Treg細胞的增殖[19]。

DC細胞與毒性CD8+T細胞或Treg細胞之間的交互作用已在多種腫瘤中得到證實[12,20-21]。LAMP3+DC和Treg細胞之間的相互作用可以增強NPC中耗竭CD8+T細胞的免疫抑制作用[9]。這些研究表明，不同細胞類型之間的相互作用在維持TIME的穩(wěn)態(tài)中起重要作用，LAMP3+DC與Treg細胞和耗竭CD8+T細胞也可能是NPC的潛在免疫治療靶點[9]。多色免疫組織化學(xué)對高表達PD-1的耗竭T細胞與表達PD-L1的LAMP3+DC進行空間位置分析，發(fā)現(xiàn)二者出現(xiàn)在相鄰的位置，這為其相互作用提供了蛋白水平的證據(jù)[12]。然而，LAMP3+DC在NPC中的作用與功能仍需要進一步的研究。

通過轉(zhuǎn)錄因子分析構(gòu)建NPC患者外周血與腫瘤微環(huán)境之間樹突狀細胞的遷移、分化和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[22]，發(fā)現(xiàn)KDM2B、KLF6、NFKB1、TRAFD1、HMGN3和JUN等轉(zhuǎn)錄因子對促進LAMP3+DC細胞的成熟，降低抗原呈遞能力和增強免疫調(diào)節(jié)能力至關(guān)重要。靶向這些轉(zhuǎn)錄因子可能會使LAMP3+DC細胞重塑為正常的抗原呈遞表型，從而使LAMP3+DC細胞在NPC患者體內(nèi)重新發(fā)揮激活免疫的功能[23]。

鼻咽癌中的肥大細胞與更好的預(yù)后相關(guān)，表現(xiàn)出抗腫瘤表型。通過細胞間相互作用分析證實，NPC組織內(nèi)肥大細胞上的受體ADRB2可與巨噬細胞分泌的配體IL1B結(jié)合，從而激發(fā)抗腫瘤特性[11]，而其詳細機制有待進一步探索。

3 scRNA-seq技術(shù)分析鼻咽癌免疫微環(huán)境中的T細胞

T細胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要成分，不同類型的T細胞與其他免疫細胞合作起到抗腫瘤的作用。在NPC免疫微環(huán)境中存在CD4+CXCL13 Th細胞亞群[24-25]，通過分泌趨化因子CXCL13作為配體，與B細胞上的CXCR5受體結(jié)合，促進TIME中三級淋巴樣結(jié)構(gòu)的形成與成熟，這群細胞為TIME中CXCL13的來源之一，且不存在于正常組織中[24]。細胞活性調(diào)節(jié)因子TGF-β和轉(zhuǎn)錄因子SOX4被確定為調(diào)節(jié)CD4+Th細胞中CXCL13表達的兩個關(guān)鍵因素[26]。NFATC1在T細胞激活后調(diào)節(jié)PD-1表達，并提示NFATC1作為CD4+PD-1+T細胞的潛在調(diào)節(jié)因子，促使CD4+Th細胞在NPC中功能失調(diào)[7]。

NPC的研究發(fā)現(xiàn)TIME中存在三個耗竭CD8+T細胞亞群[7,9-10]，分別高表達耗竭標(biāo)志物L(fēng)AG3、HAVCR2和TOX。NPC腫瘤組織中的耗竭CD8+T細胞亞群表現(xiàn)出較高的趨化因子CXCL13表達水平[25]。在鼻咽癌患者中，高表達CXCL13與更好的無進展生存相關(guān)，提示CXCL13高的耗竭T細胞可能仍然有利于免疫調(diào)節(jié)[9]，同樣在三陰性乳腺癌和非小細胞肺癌中CXCL13+T細胞有利于PD-L1治療[27-28]。通過構(gòu)建CD8+T細胞的發(fā)育軌跡，表明初始CD8+T細胞向細胞毒性CD8+T細胞轉(zhuǎn)化，進而向耗竭CD8+T細胞轉(zhuǎn)化。通過TIME調(diào)節(jié)重新編程耗竭T細胞成為重新激活抗腫瘤免疫的可行療法[7,25,29]。W03-（EBV+）腫瘤細胞和新鮮NPC組織活檢中獲得的T細胞共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞具有“上皮-免疫”雙重特征，可以抑制腫瘤浸潤的T淋巴細胞分泌IFN-γ，這可能是造成CD8+T細胞耗竭的重要原因[29]。

Treg細胞根據(jù)其狀態(tài)主要分為抑制性與靜息性。抑制性Treg與靜息性Treg相比，IFN反應(yīng)增強，表明IFN相關(guān)途徑可能導(dǎo)致Treg相關(guān)的免疫抑制[25]。IFN-γ和IFN-α在NPC的T細胞亞群中上調(diào)，表明1型和2型干擾素過度產(chǎn)生，說明這種全局性干擾素反應(yīng)上調(diào)普遍存在于NPC免疫微環(huán)境的T細胞亞群中[25,29]，病毒感染與腫瘤細胞對TIME存在協(xié)同影響。scRNA-seq和TCR測序整合分析揭示效應(yīng)T細胞在腫瘤和腫瘤鄰近組織中的克隆型擴增，在外周血中也得到了相同的結(jié)果[22,25]。此外，已證實腫瘤內(nèi)T細胞來自外周血[22]。

通過以上研究，我們可以得出在NPC免疫微環(huán)境中，CXCL13主要由CD4+Th細胞和耗竭CD8+T細胞產(chǎn)生。在接受PD-1阻斷的非小細胞肺癌患者的PD-1+T細胞中也發(fā)現(xiàn)CXCL13的產(chǎn)生增加，且細胞毒性受損[30]。CXCL13被確定為B細胞化學(xué)引誘物，在三級淋巴結(jié)構(gòu)形成中發(fā)揮重要作用，并廣泛參與自身免疫性疾病和淋巴組織增生性疾病的發(fā)生[24]。根據(jù)中位基因表達將NPC患者分為CXCL13高表達和CXCL13低表達組，并觀察到CXCL13高表達患者中CXCR5+B細胞的比例更高[9]，說明CXCL13-CXCR5協(xié)調(diào)T細胞-B細胞相互作用，調(diào)節(jié)TIME中的淋巴細胞浸潤。

4 scRNA-seq技術(shù)分析鼻咽癌免疫微環(huán)境中的B細胞

單細胞分析表明，浸潤的B細胞已成為NPC重要的預(yù)后因素和治療靶點[7,9]。T細胞中CXCL13的研究提示，B細胞的浸潤可能是通過CXCL13-CXCR5從周圍淋巴結(jié)和外周血進入TIME[24]?？紤]到腫瘤浸潤性B細胞的預(yù)后價值，增加腫瘤內(nèi)B細胞可能是一種有效的輔助治療。

IFN+B細胞和雙陰性B細胞（IGHD-/CD27-）富集在TIME中。而初始B細胞、未活化B細胞和先天樣B細胞，優(yōu)先富集在非惡性微環(huán)境中。NPC和癌旁來源的B細胞之間的差異基因較少，這表明B細胞的功能可能在很大程度上取決于豐度，而不是遺傳調(diào)控或細胞因子分泌的差異。雙陰性B細胞在NPC微環(huán)境中擴增，占總B細胞12.6%，并與較差的預(yù)后相關(guān)[9]。擬時序分析表明，NPC中雙陰性B細胞是成熟效應(yīng)B細胞的前體，可進一步分化為漿B細胞和記憶B細胞。然而，在NPC腫瘤微環(huán)境中，雙陰性B細胞的分化被腫瘤或TIME阻止，被迫維持在中間分化且無效的表型[7,9]。因此，抑制NPC微環(huán)境中雙陰性B細胞的擴增或誘導(dǎo)分化可能會增強炎性反應(yīng)激活。此外，量化NPC患者腫瘤內(nèi)或外周雙陰性B細胞的豐度可能對患者分層和預(yù)后是可行的，并可作為治療的生物標(biāo)志物[7,9]。

NPC中的B細胞差異表達基因主要是干擾素誘導(dǎo)和免疫球蛋白編碼基因，包括IFITM1、IFI44L、IGHA1、IGKC和IGHG3[9]。與T細胞亞群中顯示的結(jié)果一致，B細胞的通路分析顯示，NPC中的B細胞也很大程度上受到IFN-γ和IFN-α過度釋放的影響，而癌旁組織的B細胞主要受炎性反應(yīng)通路的影響[9]。研究報道IFN影響B(tài)細胞的成熟、分化和免疫激活[31-32]，推測IFN可能觸發(fā)免疫抑制機制[33]，但IFN誘導(dǎo)的B細胞的浸潤是否對NPC患者具有預(yù)后意義仍不清楚。

在研究中發(fā)現(xiàn)TIEM中含F(xiàn)CRL4+記憶B細胞和生發(fā)中心（germinal centers,GC）B細胞亞群，這在以往的報道中很少見。FCRL4+記憶B細胞中CCR1高表達促使這類細胞歸巢到發(fā)炎的組織，具有較高親和力的GC B細胞可以被誘導(dǎo)成為漿細胞[7,9]。GC B細胞表現(xiàn)出丙酮酸代謝和MYC通路的激活，而糖酵解途徑在漿細胞中上調(diào)[6]。此外，還在漿細胞中檢測到巨噬細胞趨化途徑的高活性，表明這些途徑在促進巨噬細胞募集到TIME的潛在作用[7,9]。受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的基因如BCL6和ATF4的表達分別在GC B細胞和漿細胞中特異性上調(diào)。BCL6對GC B細胞發(fā)育至關(guān)重要，它重新激活B細胞轉(zhuǎn)錄程序以增強對外部刺激的反應(yīng)，而ATF4在免疫球蛋白產(chǎn)生中起作用[7]。生存分析顯示，F(xiàn)CRL4+記憶B細胞特征和漿細胞特征基因（CD79A、MS4A1、FCRL4和IGHD）與NPC患者更好的無進展生存顯著相關(guān)，表明FCRL4+記憶B細胞在抗NPC免疫中發(fā)揮積極作用[9]。

5 scRNA-seq技術(shù)分析鼻咽癌免疫微環(huán)境中的NK細胞

NK細胞中與毒性CD8+T細胞的部分轉(zhuǎn)錄因子（EOMES,RUNX3和XBP1）均顯著上調(diào)[7]，說明這些轉(zhuǎn)錄因子在NPC中增強CD8+T和NK細胞在鼻咽癌中的細胞毒性。DC1細胞表達相對較高水平的受體XCR1，NK細胞過表達XCR1的配體XCL1和XCL2[7]，說明NK細胞可能會募集DC1細胞到TIME中[34]。

6 scRNA-seq技術(shù)分析鼻咽癌免疫微環(huán)境中的成纖維細胞

成纖維細胞雖然不屬于免疫細胞，已有研究證實在NPC患者的腫瘤組織中有成纖維細胞浸潤，成纖維細胞表達更多數(shù)量的有效配體，其受體由腫瘤細胞表達[9-10]。細胞配體-受體相互作用，如COL1A1-ITGB1和COL6A1-ITGB1，可能促進腫瘤進展。COL1A2、COL6A1、COL6A3、COL14A1和CD248在成纖維細胞中高表達，并與TIME中的內(nèi)皮細胞豐度呈正相關(guān)，說明它們在內(nèi)皮細胞募集和血管生成中的潛在作用[9-10]。補體基因（C2、C3和SERPING1）由成纖維細胞表達，與T細胞豐度高度相關(guān)；另外，腫瘤來源的成纖維細胞中上調(diào)的基因在IFN反應(yīng)相關(guān)途徑中富集[10]。

7 總結(jié)與展望

鼻咽癌中的IFN在TIME中的T細胞、DC、巨噬細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞中顯著上調(diào)[10]。盡管IFN應(yīng)答在戰(zhàn)勝病毒感染中的作用已得到充分確立，但IFN在NPC免疫功能失調(diào)發(fā)揮著重要作用。既往研究提示NPC患者的不良預(yù)后部分是由于IFN賦予腫瘤細胞的免疫抑制能力，由此推測IFN反應(yīng)在NPC中起到“雙刃劍”的作用[10]。雖然其最初的功能是對抗病毒感染，但惡性轉(zhuǎn)化后的IFN反應(yīng)有助于腫瘤細胞在TIME中存活[10]。

LAMP3+DC在NPC中誘導(dǎo)腫瘤浸潤抑制Treg細胞的增殖，可以增強NPC中耗竭CD8+T細胞的免疫抑制作用。CXCL13在NPC中CD4+Th和耗竭CD8+T細胞中促使高度免疫抑制狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細胞浸潤增加，并且通過CXCR5+B細胞募集參與三級淋巴結(jié)構(gòu)的形成[24]。細胞毒性CD8+T細胞廣泛表達免疫檢查點因子（PDCD1和LAG3），可以考慮免疫檢查點阻斷。

在這篇綜述中，我們基于scRNA-seq在NPC中的應(yīng)用，分析和探討NPC免疫微環(huán)境，見圖1，可以利用免疫細胞的浸潤，減少LAMP3+DC細胞、耗竭CD8+T細胞的生成，激活T細胞殺傷作用以助于鼻咽癌的治療。目前的NPC單細胞研究主要集中于免疫細胞，對于腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞之間的相互作用研究較少，全面了解不同細胞之間的相互關(guān)系有助于設(shè)計新型靶向免疫調(diào)節(jié)療法，從而找到治療鼻咽癌新策略。

圖1 鼻咽癌免疫微環(huán)境中細胞募集和細胞間相互作用的示意圖Figure 1 Schematic illustration of cell recruitment and cell–cell interactions in the nasopharyngeal carcinoma immune microenvironment