表達(dá)木質(zhì)素降解酶的基因工程產(chǎn)朊假絲酵母菌部分生物學(xué)特性研究

高 娃， 其布日， 薩初拉， 蘇少鋒， 吳青海， 呼 和*， 郁 彭

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

內(nèi)蒙古有著豐富的秸稈資源，全區(qū)年產(chǎn)各類農(nóng)作物秸稈達(dá)35億千克，相當(dāng)于全區(qū)天然草原打草量的2倍（高雪峰等，2015）。但目前秸稈營(yíng)養(yǎng)成分利用率低、適口性差、應(yīng)用價(jià)值不高，因此只有小部分作為飼料，其余大部分直接還田或焚燒，導(dǎo)致資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。秸稈用作飼草利用率低的原因：一是隨著農(nóng)作物的成熟，木質(zhì)化程度越高，秸稈細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量增加。木質(zhì)素因其與半纖維素分子之間形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而增加了細(xì)胞壁對(duì)微生物 的 抵 抗 能 力 （Nat han Mosier等，2005；SahaBadal，2003）。由于防止了反芻動(dòng)物瘤胃微生物水解酶與細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素的接觸，這一結(jié)構(gòu)特性也達(dá)到降低纖維多糖的降解效率（Ding等，2012）。玉米秸稈中木質(zhì)素含量為19%～23%，是限制秸稈有效利用的最主要物質(zhì)（Michelin等，2011；楊世關(guān)等，2006；馬靚等，2005；楊淑慧，2001）。二是目前已開發(fā)應(yīng)用的微波預(yù)處理、熱水處理、氨纖維爆炸、蒸汽爆破、酸處理、堿處理等，這些預(yù)處理方法能提高秸稈利用率，但實(shí)際應(yīng)用中無(wú)法滿足高價(jià)的設(shè)備條件（Ahmed等，2016）。

自然界中能夠降解木質(zhì)素的只有少數(shù)微生物，其中絕大部分是真菌（Lun等，2010），少數(shù)是細(xì)菌（Yang等，2007），但細(xì)菌的木質(zhì)素降解能力很弱（陳躍輝，2013）。本研究中對(duì)前期構(gòu)建的表達(dá)木質(zhì)素降解酶的2株重組產(chǎn)朊假絲酵母菌-ZHMX4和ZHQX1的菌株部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究，包括木質(zhì)素降解酶適宜反應(yīng)條件、木質(zhì)素降解酶基因拷貝數(shù)和重組產(chǎn)朊假絲酵母菌降解天然木質(zhì)素能力的測(cè)定以及重組產(chǎn)朊假絲酵母菌營(yíng)養(yǎng)需要分析等，全面了解重組產(chǎn)朊假絲酵母菌特性的同時(shí)為后續(xù)研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、試劑及培養(yǎng)基

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及載體 黃孢原毛平革菌，Phanerochaete chrysosporium（BNCC 190652），云芝栓孔菌，Trametes versicolor（BNCC 145690）：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)朊假絲酵母（31395）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；ZHMX4和ZHQX1：本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.1.2 試驗(yàn)材料Sapphire芯片：法國(guó)Stilla Technologies公司；纖維素酶：和氏璧生物科技公司；半纖維素酶：浙江一諾生物科技公司，Biolog YT微孔板，無(wú)菌水接種液：BIOLOG公司；

1.1.3 培養(yǎng)基及溶液 酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）液體培養(yǎng)基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，加蒸餾水定容，121℃、15 min高壓滅菌，備用。YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中添加2 %的瓊脂粉（Agar），滅菌備用。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：9.76 g PDA，加水定容至200 mL，高壓滅菌，備用。甘油培養(yǎng)基：2%甘油，2%蛋白胨，1%酵母浸粉，2%瓊脂。產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酒石酸銨0.1 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO40.035 g，CuSO4·5H2O 0.007 g，加水至1 L，121℃滅菌20 min。50 mmol/L的琥珀酸緩沖液（pH 4.5）：0.81 g琥珀酸鈉定容至100 mL水中。稱0.59 g琥珀酸，用配好的琥珀酸鈉將pH調(diào)到4.5。0.4 mmol/L的愈創(chuàng)木酚：0.04 mmol（4.5 μL）愈創(chuàng)木酚，用1 mL 95%的乙醇溶解。20 mmol/L H2O2：230 μL H2O2用水定容至100 mL。10 mmol/L藜蘆醇：71 μL藜蘆醇用水定容至50 mL。50 mmol/L的酒石酸緩沖液（pH 3）：0.75 g酒石酸，用水定容至100 mL；0.97 g酒石酸鈉定容至100 mL水中，向酒石酸溶液中添加酒石酸鈉至pH 3.0。

1.2 工程菌木質(zhì)素降解酶基因拷貝數(shù)測(cè)定dPCR技術(shù)是將指數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)的一種新的核酸定量方法（Vogelstein等，1999）。將總模板PCR反應(yīng)體系分液，分許多單獨(dú)的PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)有無(wú)熒光信號(hào)來(lái)計(jì)算拷貝數(shù)。后經(jīng)泊松統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，最后得出樣品DNA/RNA的濃度（Pinheiro等，2012；Sanders等，2011；Hindson等，2011）。相比qPCR技術(shù)，該技術(shù)無(wú)需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接定量核酸拷貝數(shù)，對(duì)低濃度的樣品定量更準(zhǔn)確。具體的操作按NaicaTMCrystal Digital PCR System的快速操作指南進(jìn)行。反應(yīng)體系（25 μL）：樣本2 μL，PCR mastermix 5 μL，Alexa FluorTM 647（25×）1 μL，上下引物各1 μL，EvaGreen（20×）2 μL，Nuclease-free water 13 μL。擴(kuò)增條件：95℃5 min，95℃15 s，55℃15 s，共45個(gè)循環(huán)，72℃30 s。

1.3 工程菌木質(zhì)素降解酶適宜反應(yīng)條件的測(cè)定

1.3.1 最適pH用不同pH的緩沖液，在30℃下反應(yīng)，測(cè)得工程菌經(jīng)甘油誘導(dǎo)后的粗酶液最高活力pH。

1.3.2 最適反應(yīng)溫度 用最適pH的緩沖液，分別在20、30、40、50、60、70℃測(cè)定酶活力，測(cè)得最適反應(yīng)溫度。

1.3.3 酶活測(cè)定 過氧化物酶的酶活測(cè)定：采用以黎蘆醇（VA）為底物的測(cè)定方法。1 mL 50 mmol/L的酒石酸緩沖液（pH 3），500 μL 10 mmol/L藜蘆醇，1 mL粗酶液，30℃溫浴10 min后，加入20 μL 20 mmol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，測(cè)反應(yīng)最初3 min內(nèi)310 nm處吸光值的變化。以不加H2O2的酶液為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。漆酶的酶活測(cè)定：采用愈創(chuàng)木酚法。緩沖溶液常用琥珀酸鈉溶液，終濃度為50 mmol/L。緩沖溶液的pH為4.5。底物愈創(chuàng)木酚的終濃度為0.4 mmol/L。反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min。測(cè)定465 nm處OD值變化。以沸水中煮2～5 min的酶液為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。酶活計(jì)算公式如下：

式中：V為反應(yīng)體積，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min；Va為酶液體積，mL；ε為消光系數(shù)，過氧化物酶ε：3.6×104（mol/L）-1cm-1，漆酶ε：9.3×103（mol/L）-1cm-1。

1.4 工程菌木質(zhì)素降解酶降解秸稈木質(zhì)素能力的測(cè)定 （1）取100 g玉米秸稈裝入真空袋內(nèi)，待用。（2）取適量濃度的微生物過夜培養(yǎng)物（OD600±1.8）至上述含有玉米秸稈的袋內(nèi)，迅速混勻。曬干的秸稈+菌液+無(wú)菌水的比例，按表1所示添加，無(wú)菌水添加以72%的比例充分混合于袋中，添加量為109cfu/g。（3）利用真空封口機(jī)抽真空，封口。（4）室溫放置11 d，測(cè)量木質(zhì)素降解率。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。（5）檢測(cè)方法：按GB/T 20805-2006操作。

表1 各組組合和添加量

1.5 工程菌營(yíng)養(yǎng)需求分析 本試驗(yàn)采用Biolog微生物細(xì)胞表型芯片（PM）技術(shù)分析ZHMX4和ZHQX1菌株細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝特點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，從而對(duì)工程菌的培養(yǎng)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

Biolog YT微孔板通過微生物對(duì)微孔板中的不同碳源的利用及氧化情況進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試使得有特征代謝的孔變成紫色，從而使微生物在測(cè)試板上顯示出“代謝指紋圖譜”。所有必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及生化試劑都被預(yù)先填充、干化在96個(gè)孔中。在一部分孔中（A~C行），四唑類氧化還原染料通過色度的變化來(lái)指示碳源的氧化情況。而剩下的孔（D~H行）則通過濁度的變化來(lái)顯示微生物對(duì)碳源的利用情況。試驗(yàn)操作按照Biolog YT MicroPlateTM的說(shuō)明書進(jìn)行。在YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)ZHMH4和ZHQX1，制成47%T細(xì)胞濃度的菌懸液，YT板內(nèi)每孔添加100 μL菌懸液后孵育。在孵育后的24、48、72 h，用Biolog系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和比對(duì)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 工程菌木質(zhì)素降解酶基因拷貝數(shù)測(cè)定 用dPCR技術(shù)定量ZHMX4和ZHQX1 2株工程菌的拷貝數(shù)，拷貝數(shù)分別為4.84和24.3，結(jié)果見圖1和表2所示。

圖1 工程菌ZHMX4和ZHQX1微滴式dPCR的一維散點(diǎn)圖

表2 dPCR試驗(yàn)結(jié)果

2.2 工程菌木質(zhì)素降解酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.2.1 ZHMX4最適pH由表3可知，ZHMX4最適反應(yīng)pH為3.0，將ZHMX4置于不同pH緩沖溶液中于30℃保溫2 h，結(jié)果表明該酶在pH 3.0～5.0穩(wěn)定性較好，在pH高于6.5的條件下，ZHMX4基本失活。

表3 ZHMX4最適pH測(cè)定結(jié)果U/L

2.2.2 ZHMX4最適溫度 由表4可知，將ZHMX4置于不同溫度保溫2 h，當(dāng)溫度低于30℃和高于70℃時(shí)，酶活力基本喪失。ZHMX4的最適反應(yīng)溫度為30℃。2.2.3 ZHQX1最適pH由表5可知，ZHQX1最適反應(yīng)pH為4.5，將ZHQX1置于不同pH緩沖溶液中于30℃保溫2 h，結(jié)果表明該酶在pH 4.0～5.0穩(wěn)定性較好，在pH高于6.0的條件下，ZHQX1的酶活逐漸降低。

表4 ZHMX4最適溫度測(cè)定結(jié)果U/L

表5 ZHQX1最適pH測(cè)定結(jié)果U/L

2.2.4 ZHQX1最適溫度 由表6可知，將ZHQX1置于不同溫度保溫2 h，當(dāng)溫度低于30℃和高于70℃時(shí)，酶活力基本喪失。ZHQX1的最適反應(yīng)溫度為30℃。

表6 ZHQX1最適溫度測(cè)定結(jié)果U/L

2.3 工程菌木質(zhì)素降解酶降解秸稈木質(zhì)素能力的測(cè)定 對(duì)照組為未加任何菌株和試劑的秸稈樣品；A組為ZHMX4和ZHQX1菌液各2 mL混合發(fā)酵的秸稈樣品；B組為ZHMX4和ZHQX1菌液各5 mL混合發(fā)酵的秸稈樣品；C組為把兩株工程菌各2 mL混合，再加入適當(dāng)劑量的纖維素酶和半纖維素酶發(fā)酵的秸稈樣品；D組為把兩株工程菌各5 mL混合，再加入適當(dāng)劑量的纖維素酶和半纖維素酶發(fā)酵的秸稈樣品。試驗(yàn)中兩株菌的菌液濃度為（OD600～1.8）。結(jié)果見表7。

表7 發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

未加任何菌株和試劑的秸稈（對(duì)照組）的酸性洗滌木質(zhì)素含量為8.3%，A組樣品的酸性洗滌木質(zhì)素含量為4.16%。B組樣品的酸性洗滌木質(zhì)素含量為4.2%。與對(duì)照組相比較，A組和B組均顯著降低（P<0.05）。A組與B組無(wú)差異顯著性（P>0.05），說(shuō)明，隨著添加量的增大，其降解木質(zhì)素的能力基本無(wú)變化。C組樣品酸性洗滌木質(zhì)素含量為5.1%。D組樣品的酸性洗滌木質(zhì)素含量為4.73%。酸性洗滌木質(zhì)素含量均比未添加纖維素酶和半纖維素酶的A組和B組的含量高，差異顯著（P<0.05）。說(shuō)明添加纖維素酶和半纖維素酶對(duì)工程菌降解秸稈木質(zhì)素有阻抗作用。這可能是因?yàn)楣こ叹?纖維素酶+半纖維素酶同時(shí)進(jìn)行酶解和發(fā)酵時(shí)，木質(zhì)素降解產(chǎn)生的酚類物質(zhì)（Duarte等，2012；Du等，2010；朱均均等，2009）抑制了纖維素酶的水解（Zakaria等，2015；Kim等，2011；Ximenes等，2011）。

2.4 工程菌營(yíng)養(yǎng)需求分析

2.4.1 ZHMX4的營(yíng)養(yǎng)需求分析 如圖2所示，A12、B1、B3、B4、C1、C2孔內(nèi)的底物被ZHMX4氧化，變成紫色?？紤]工程菌ZHMX4的培養(yǎng)基優(yōu)化中可添加菊粉、D-纖維二糖、麥芽糖、麥芽三糖、N-乙?；?D葡萄糖胺、a-D-葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將會(huì)對(duì)該工程菌ZHMX4的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

圖2 ZHMX4的YT板數(shù)據(jù)

2.4.2 ZHQX1的營(yíng)養(yǎng)需求分析 如圖3所示，A12、B3、B10、C2孔內(nèi)的底物被工程菌ZHQX1氧化，變成紫色?？紤]工程菌ZHQX1的培養(yǎng)基優(yōu)化中可添加菊粉、麥芽糖、蔗糖、a-D-葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將會(huì)促進(jìn)該工程菌ZHQX1的生長(zhǎng)。

圖3 ZHQX1的YT板數(shù)據(jù)

3 討論

當(dāng)前絕大多數(shù)秸稈還是以簡(jiǎn)單的粉碎、壓成顆粒及青貯制作方式飼喂家畜。奶牛對(duì)簡(jiǎn)單加工玉米秸稈中的干物質(zhì)（DM）表觀消化率為63.38%，中性洗滌纖維（NDF）表觀消化率為62.06%，酸性洗滌纖維（ADF）表觀消化率為50.36%（徐學(xué)博等，2015）。肉牛對(duì)簡(jiǎn)單粉碎小麥秸稈中的中性洗滌纖維表觀消化率為56.87%，酸性洗滌纖維表觀消化率為49.04%（李振，2013）。即秸稈飼料飼喂當(dāng)中，至少有近37%的干物質(zhì)、38%～46%的中性洗滌纖維、49%～51%酸性洗滌纖維經(jīng)糞便流失掉。在中國(guó)玉米種植面積較大、產(chǎn)量多，會(huì)產(chǎn)生大批玉米秸稈，而其中只有20%的玉米秸稈被有效加工（劉東等，2018）。所以，攻克秸稈飼料消化利用率的關(guān)鍵技術(shù)是解決我區(qū)畜牧業(yè)生產(chǎn)中粗飼料資源不足和利用率低，降低養(yǎng)殖成本，提高牛、羊飼養(yǎng)數(shù)量和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的有效途徑。

白腐真菌能高效并選擇性降解木質(zhì)素。已知白腐真菌分泌幾種與木質(zhì)素降解相關(guān)的酶，即木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）、漆酶（Lac）、錳過氧化物酶（MnP）、多功能過氧化物酶（Heinfling等，1998）和多種輔助酶。多數(shù)分泌1～2種降解木質(zhì)素的酶（Trap等，2013；Zyani等，2009），也有少部分白腐菌可分泌3種降解木質(zhì)素的酶，說(shuō)明降解木質(zhì)素并非4種酶都參與（Wei Wang等，2015）。研究表明，這幾種木質(zhì)素降解酶的降解機(jī)制是均能與低分子質(zhì)量中介體共同作用，產(chǎn)生具有攻擊木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物，引起木質(zhì)素氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致木質(zhì)素的降解（池玉杰等，2007）。

白腐真菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、酶活低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。為了提高過氧化物酶的產(chǎn)量，很多研究（寧娜等，2017；劉曉慶等，2016；李阿敏等，2015）利用基因工程技術(shù)對(duì)白腐真菌的多個(gè)過氧化物酶基因進(jìn)行克隆和異源表達(dá)。高效的異源表達(dá)更適合工業(yè)化生產(chǎn)的需求。陳建軍等（2018）以黃孢原毛平革菌為模板，利用同源重組技術(shù)擴(kuò)增漆酶基因，將其表達(dá)在大腸桿菌中，漆酶酶活提高了近39%。孫亞范（2004）將木質(zhì)素過氧化物酶基因在畢赤酵母中表達(dá)，木質(zhì)素過氧化物酶酶活提高了122.1%。王嬌（2014）將錳過氧化物酶基因在畢赤酵母中表達(dá)，木質(zhì)素降解率提高了31.38%。因畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究較成熟，木質(zhì)素過氧化物酶基因在畢赤酵母中表達(dá)的研究較多（裴佐帝等，2014；Gu等，2014；范芳芳，2013；包文華，2012；Wang等，2004）。但是，畢赤酵母不是食品級(jí)微生物，它的應(yīng)用受到限制。

產(chǎn)朊假絲酵母被FDA認(rèn)證為食品級(jí)酵母，可運(yùn)用于食品、飼料及制藥業(yè)中（Kondo，等，1995）。若將木質(zhì)素降解酶基因轉(zhuǎn)化到產(chǎn)朊假絲酵母中，并應(yīng)用于發(fā)酵秸稈，可破壞木質(zhì)素的包裹作用，使纖維素和半纖維素暴露出來(lái)，利于瘤胃微生物降解和利用秸稈飼料；可以作為安全的單細(xì)胞蛋白，改善秸稈飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分含量；其發(fā)酵產(chǎn)品不必經(jīng)過分離純化，省時(shí)且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。通過產(chǎn)朊假絲酵母異源表達(dá)木質(zhì)素降解酶，也是為提高其產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

工程菌ZHMX4和ZHQX1是分別從黃孢原毛平革菌和云芝栓孔菌中擴(kuò)增出Lip基因和Lac基因，利用同源整合重組技術(shù)構(gòu)建所得的工程菌。本研究對(duì)前期構(gòu)建的2株工程菌進(jìn)行了一系列菌株特性研究，包括木質(zhì)素降解酶適宜反應(yīng)條件、木質(zhì)素降解酶基因拷貝數(shù)和工程菌降解天然木質(zhì)素能力的測(cè)定及工程菌營(yíng)養(yǎng)需要分析，全面了解2株重組產(chǎn)朊假絲酵母菌特性的同時(shí)為后續(xù)研究工作奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，2株工程菌ZHMX4和ZHQX1的拷貝數(shù)分別為4.84和24.3；工程菌ZHMX4產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶最適反應(yīng)溫度為30℃，最適反應(yīng)pH為3.0。當(dāng)pH高于6.5、溫度低于30℃或高于70℃時(shí)，木質(zhì)素過氧化物酶基本失活；工程菌ZHQX1產(chǎn)漆酶最適反應(yīng)溫度為30℃，最適反應(yīng)pH為4.5。當(dāng)pH高于6.0、溫度低于30℃或高于70℃時(shí)，逐漸喪失漆酶酶活；菌株一定比例（各2 mL）混合發(fā)酵時(shí)，秸稈木質(zhì)素含量降低了4.14 %，木質(zhì)素降解率達(dá)到50.12%，再增加添加量時(shí)降解能力基本無(wú)變化；Biolog YT微孔板試驗(yàn)結(jié)果顯示，在工程菌的培養(yǎng)基中添加一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)工程菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。