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    淡竹葉碳量子點(diǎn)的微波法制備及在細(xì)胞成像中的應(yīng)用探究

    2023-01-07 13:23:24胡妙言劉凱高詩(shī)雨孫天懿史繼晨徐長(zhǎng)妍徐麗
    發(fā)光學(xué)報(bào) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:量子產(chǎn)率淡竹葉水溶液

    胡妙言,劉凱,高詩(shī)雨,孫天懿,史繼晨,徐長(zhǎng)妍,2,3*,徐麗,2,3*

    (1.南京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 210000;2.南京林業(yè)大學(xué)江蘇省林產(chǎn)品高效加工利用聯(lián)合創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210000;3.南京林業(yè)大學(xué)綠色生物質(zhì)燃料與化學(xué)品江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210000;4.2019年江蘇省研究生工作站:靖江國(guó)林木業(yè)有限公司(工作站編號(hào):2019_099),江蘇 靖江 214500)

    1 引 言

    碳量子點(diǎn)(Carbon quantum dots,CQDs)是一種零維碳基納米材料,具有良好的生物相容性和優(yōu)異的光致發(fā)光性能[1],被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像[2]、藥物傳遞[3]、離子檢測(cè)[4]等領(lǐng)域。碳量子點(diǎn)的物理化學(xué)性質(zhì)受碳源和制備方法的直接影響,如雜原子的引入,可以改善CQDs的性質(zhì)[5]。生物質(zhì)材料一般具有豐富的雜原子,可實(shí)現(xiàn)CQDs合成過(guò)程中的雜原子自摻雜,無(wú)需引入新的摻雜劑或者經(jīng)過(guò)繁雜的鈍化過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)雜原子誘導(dǎo)而形成新的表面態(tài),從而提高CQDs的熒光量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度[6-7]。此外,生物質(zhì)碳源還具有環(huán)保、成本低、來(lái)源廣泛的優(yōu)點(diǎn),還可以一定程度上替代昂貴的化學(xué)試劑[8-9]。近年來(lái),一些生物質(zhì)碳源如葡萄籽[5]、西蘭花[6]和大蒜[10]等已被用于合成雜原子摻雜的CQDs,且憑借其生物相容性良好、細(xì)胞毒性較低、熒光穩(wěn)定性良好而在細(xì)胞成像等領(lǐng)域體現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。

    碳量子點(diǎn)的合成方法包括微波法[11]、水熱法[12]、激光銷(xiāo)蝕法[13]和電弧放電法[14]等。其中,微波法相對(duì)于其他CQDs制備方法,是一種應(yīng)用廣泛、綠色、快速、高效的碳量子點(diǎn)制備方法,通過(guò)高頻率電磁波作用,在短時(shí)間內(nèi)使碳量子點(diǎn)的碳源發(fā)生碳化、裂解從而達(dá)到快速制備碳量子點(diǎn)的目的[15]。但是,通過(guò)微波法制備的CQDs目前仍然存在粒徑分布不均勻、性能可控性較差等問(wèn)題[16],這主要是因?yàn)槠渲苽涔に噮?shù)的選取不合理所致?,F(xiàn)有有關(guān)微波法制備CQDs工藝參數(shù)優(yōu)化的研究多采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,雖然可以在一定程度上優(yōu)化CQDs制備工藝,但不能用于系統(tǒng)分析各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響主次順序、各因素兩兩組合的交互作用、對(duì)指定工藝下制備的碳點(diǎn)進(jìn)行性能預(yù)判[11,15-16]。因此,科學(xué)優(yōu)化CQDs的微波法制備工藝對(duì)于提高微波法制備CQDs的效率、改善CQDs的結(jié)構(gòu)和性能從而促進(jìn)其應(yīng)用具有重要意義。

    淡竹葉(Lophatherum gracile)是一種藥食同源的多年生草本植物,廣泛分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)等亞洲國(guó)家[17-19],已被中國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)批準(zhǔn)為功能性食品工業(yè)中的天然添加劑[20]。淡竹葉富含的類(lèi)黃酮、多糖、酚酸等生物活性物質(zhì)和礦質(zhì)元素賦予其良好的藥理作用,為建立具有良好生物相容性的CQDs的活性功能基團(tuán)提供了機(jī)會(huì)[21]。但現(xiàn)階段淡竹葉除部分莖葉得到入藥利用以外,均被丟棄浪費(fèi)[22]。如何提高淡竹葉的功能化、高附加值的轉(zhuǎn)換利用是該產(chǎn)業(yè)面臨的一個(gè)難題。

    響應(yīng)曲面法(Response surface methodology,RSM)是一種所需要的試驗(yàn)組數(shù)相對(duì)較少的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)方法,可以找出各因素水平的最佳組合,揭示試驗(yàn)指標(biāo)與各因子間的定量規(guī)律。此外,采用該方法還可以在多元線性回歸的基礎(chǔ)上主動(dòng)收集數(shù)據(jù),獲得具有較好擬合效果的回歸方程的同時(shí)建立復(fù)雜多維空間曲面,使得預(yù)測(cè)較接近實(shí)際情況[23]。

    經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淡竹葉的C、O、Si、N元素含量較高,是合成氮硅自摻雜碳量子點(diǎn)(N/Si-CQDs)的理想材料,而利用淡竹葉制備CQDs的相關(guān)研究還未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道[24]。值得注意的是,生物相容性和地球豐富度俱佳的氮(N)和硅(Si)元素,近年來(lái)由于適宜的原子大小、化學(xué)價(jià)態(tài)以及化學(xué)惰性和低毒性的優(yōu)點(diǎn),在CQDs摻雜過(guò)程中,易于引入多種官能團(tuán),提供更多的活性位點(diǎn),產(chǎn)生更多的表面缺陷,可以獲得較高的量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度,因而在CQDs摻雜領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[4,7,12]。但現(xiàn)階段隨著雜原子的加入,引起了CQDs的粒徑增大,且由于摻雜CQDs的粒徑大小在細(xì)胞毒性與熒光特性方面起著重要的影響作用,CQDs的粒徑控制與尺寸均勻性不佳,在一定程度上限制了CQDs的實(shí)際使用。而近年來(lái)發(fā)展的極小CQDs(指粒徑小于3 nm的CQDs)由于平均粒徑較小、粒徑分布均勻,在生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)出更好的效果[9]。因此,本研究將淡竹葉作為唯一原料,以響應(yīng)曲面法優(yōu)化極小N/Si-CQDs的微波法制備工藝,并采用步驟簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛的CCK-8實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估N/Si-CQDs對(duì)轉(zhuǎn)染效率高、增長(zhǎng)速度快、對(duì)外界微環(huán)境較為敏感的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞毒性[25],探索其在細(xì)胞成像中的應(yīng)用潛力。

    2 實(shí) 驗(yàn)

    2.1 實(shí)驗(yàn)材料

    實(shí)驗(yàn)材料見(jiàn)表S1,所有試劑均為分析純,無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。

    2.2 N/Si-CQDs的微波法制備

    2.2.1 實(shí)驗(yàn)方案

    采用微波法制備淡竹葉氮硅自摻雜碳量子點(diǎn)(N/Si-CQDs)的工藝參數(shù)優(yōu)化包括兩步。首先,以N/Si-CQDs的熒光量子產(chǎn)率(QY)為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)合已有研究[1,16],采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),初步確定微波作用時(shí)間(T,min)、微波功率(W,W)和淡竹葉與去離子水的料液比(R,mg/mL)的取值范圍,見(jiàn)表S2。其中,單因素實(shí)驗(yàn)T的范圍為5~25 min,步長(zhǎng)為5;W的范圍為200~1 000 W,步長(zhǎng)為200;R的范圍為5~25 mg/mL,步長(zhǎng)為5。然后,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以T、W和R為自變量,以QY為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,綜合考慮T、W和R對(duì)QY的協(xié)同作用,得到三個(gè)自變量的最優(yōu)取值,并建立QY的預(yù)測(cè)模型。其中T的范圍為10~20 min,步長(zhǎng)為5;W的范圍為400~800 W,步長(zhǎng)為200;R的范圍為15~25 mg/mL,步長(zhǎng)為5,見(jiàn)表1。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Tab.1 Response surface test factor level coding table

    2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

    按照表S2中微波作用時(shí)間(T)、微波功率(W)和淡竹葉與去離子水的料液比(R)的取值,采用以下步驟制備N(xiāo)/Si-CQDs:第一步,使用250 mL的燒杯盛裝,選擇指定料液比的淡竹葉粉末與分散劑(去離子水10 mL);第二步,利用磁力攪拌器(MYP11-2,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司,中國(guó))攪拌10 min,轉(zhuǎn)速為500 r/min,使淡竹葉粉充分分散在水中,并將燒杯放入微波爐(G90F23CN3LV-C2(S5),Galanz,China)中進(jìn)行微波處理;第三步,取出燒杯,加入30 mL去離子水?dāng)嚢?,得到反?yīng)液,使用0.22μm濾微孔濾膜純化,以去除殘留物和大顆粒,并將過(guò)濾的反應(yīng)液利用離心機(jī)(H-1650,Cence,China)以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,得到的上清液即為N/Si-CQDs水溶液;第四步,將上述N/Si-CQDs水溶液冷凍1 d后(-20℃),采用真空冷凍干燥機(jī)(Alpha 1-2 LDplus,BMH,China)在-60℃下干燥處理3 d,得到固體N/Si-CQDs,用于配制指定濃度的N/Si-CQDs水溶液及后續(xù)表征。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

    2.3 N/Si-CQDs的性能表征

    2.3.1 N/Si-CQDs的物理形貌表征

    采用高倍率透射電子顯微鏡(JEM-2100 UHR,JEOL,Japan)表 征N/Si-CQDs的物理形貌。采用滴管將配制的N/Si-CQDs分散液(0.5 mg/mL)滴于超薄碳支撐膜上,自然晾干后,使用高倍率透射電子顯微鏡觀察N/Si-CQDs的形貌。

    2.3.2 N/Si-CQDs的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

    采用拉曼光譜儀(HORIBA LabRAM.,HR Evolution,Fr)、傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS10,Thermo Electron Corp.,Madison,WI,USA)和X射線光電子能譜儀(AXIS Ultra ADLD,Shimadzu,Japan)表征N/Si-CQDs的化學(xué)結(jié)構(gòu)。取N/Si-CQDs粉末(2 mg)與純KBr(200 mg)研細(xì)均勻,壓片(厚度1 mm,直徑13 nm),即可用于測(cè)定紅外光譜。取N/Si-CQDs粉末(0.1 g),壓片(厚度1 mm,直徑5 nm),即可用于測(cè)定XPS,結(jié)合能根據(jù)284.6 eV的C 1s峰校準(zhǔn)。

    2.3.3 N/Si-CQDs的光致發(fā)光特性表征

    分別通過(guò)熒光分光光度計(jì)(LS55,Perkin-Elmer,USA)和紫外分光光度計(jì)(LAMBDA950,Perkin-Elmer,USA)在掃描速度均為300 nm/min的條件下,獲得配制的N/Si-CQDs水溶液(0.5 mg/mL)的熒光光譜和紫外-可見(jiàn)吸收光譜。本研究將獲得的熒光光譜峰值數(shù)據(jù)最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)定義為N/Si-CQDs的最佳激發(fā)波長(zhǎng)。

    根據(jù)公式(1)計(jì)算N/Si-CQDs的熒光量子產(chǎn)率QY(ηQY)[26]。選擇溶解在0.1 mol/L硫酸中的硫酸奎寧作為參比物(ηQY=54%),在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm處分別測(cè)定參比物和N/Si-CQDs水溶液樣品的熒光光譜和吸光度曲線。

    其中,ηQY為N/Si-CQDs的熒光量子產(chǎn)率;I為測(cè)得的熒光光譜的積分面積,下標(biāo)R代表參比物,X代表N/Si-CQDs樣品;A為360 nm激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度;η為折射率,在本研究中,ηX/ηR=1。熒光量子產(chǎn)率是研究弛豫過(guò)程和光化學(xué)歷程的重要參數(shù),它表示物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熒光的性能。熒光量子產(chǎn)率也與物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān),在定量的光化學(xué)中,熒光量子產(chǎn)率是一個(gè)十分有用的參量[26]。

    碳量子點(diǎn)的熒光穩(wěn)定性直接關(guān)系到在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用效果,因此,本研究還探討了N/Si-CQDs的熒光穩(wěn)定性,主要考察了紫外光(365 nm)照射與氯化鈉濃度以及不同pH對(duì)N/Si-CQDs熒光強(qiáng)度的影響,即N/Si-CQDs的抗光漂白性試驗(yàn)、抗鹽性試驗(yàn)和N/Si-CQDs在不同pH條件下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)[27-28]。在N/Si-CQDs的抗光漂白性試驗(yàn)中,先將配制的N/Si-CQDs水溶液(0.5 mg/mL)密封于透明離心管并放置在暗室中,使用紫外燈持續(xù)照射不同時(shí)間(0,1,2,3,4,5,6 h)后,再利用熒光分光光度計(jì)記錄N/Si-CQDs溶液在最佳激發(fā)波長(zhǎng)處的熒光光譜數(shù)據(jù);在N/Si-CQDs的抗鹽性實(shí)驗(yàn)中,為考察N/Si-CQDs受共存分子和離子的干擾情況,在pH=7的條件下分別在配制的N/Si-CQDs水溶液(0.5 mg/mL)中加入不同克重的Na-Cl,使NaCl的濃度達(dá)到指定值(0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1 mol/mL),再記錄N/Si-CQDs在不同NaCl濃度下在最佳激發(fā)波長(zhǎng)處的熒光光譜數(shù)據(jù);在N/Si-CQDs在不同pH條件下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,為考察N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度受不同pH條件的干擾情況,本研究將熒光光譜數(shù)據(jù)中的峰值定義為N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度(FL)。

    2.4 N/Si-CQDs的細(xì)胞毒性試驗(yàn)與細(xì)胞成像試驗(yàn)

    培養(yǎng)基配制:先將胎牛血清在56℃下滅活0.5 h,然后配制10%胎牛血清血清和1%雙抗的培養(yǎng)基;胰蛋白酶配制:精確稱定0.25 g胰蛋白酶到100 mL容量瓶中,加磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解定容;細(xì)胞懸液配制:細(xì)胞株中加入上述配制培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃,5% CO2),每隔24 h換液,待細(xì)胞密度達(dá)到70%~90%。用胰蛋白酶將細(xì)胞消化為細(xì)胞懸液。

    細(xì)胞毒性試驗(yàn):采用CCK-8試劑盒測(cè)定N/Si-CQDs對(duì)人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)的毒性。先將預(yù)先制備好的HEK293細(xì)胞懸液按每孔100μL加入到96孔培養(yǎng)板,每孔細(xì)胞密度為1×105個(gè);然后將培養(yǎng)板在細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)(37℃,5% CO2)24 h,再?gòu)呐囵B(yǎng)箱里取出。每孔加入10μL不同質(zhì)量濃度(12.5,20,50,100,200μg/mL)的N/Si-CQDs溶液(以無(wú)菌去離子水配制)后,放回培養(yǎng)箱(37℃,5% CO2)持續(xù)孵育24 h。從培養(yǎng)箱里取出培養(yǎng)板,再向每孔加入10μL的CCK-8溶液,再次放回培養(yǎng)箱(37℃,5% CO2)孵育2 h。拿出培養(yǎng)板,用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。按照公式(2)計(jì)算細(xì)胞存活率(Cell viability):

    其中,As為實(shí)驗(yàn)孔吸光度(含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液、N/Si-CQDs溶液),Ac為對(duì)照孔吸光度(含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液、不含N/Si-CQDs溶液),Ab為空白孔吸光度(含培養(yǎng)基、CCK-8溶液、不含細(xì)胞、N/Si-CQDs溶液)。

    細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn):先將預(yù)先制備好的細(xì)胞懸液接種到含有培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中,再將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37℃,5% CO2),然后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)緩沖液(pH=7.4)洗滌細(xì)胞。將濃度為200μg/mL的N/Si-CQDs溶液加入孔中,并進(jìn)一步孵育24 h。然后,用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH=7.4)洗滌三次,去除多余的沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞的N/Si-CQDs,并使用共聚焦激光掃描顯微鏡(NIKON Eclipse Ti,NIKON,Japan)系統(tǒng)在405 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光成像情況。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 N/Si-CQDs的微波法制備工藝優(yōu)化

    3.1.1 單因素試驗(yàn)

    如圖1(a)~(c)所示,本研究通過(guò)控制單一變量分別得到了三因素(T、W、R)對(duì)熒光量子產(chǎn)率(QY)的影響。隨著微波時(shí)間自5 min增加至25 min,QY數(shù)值呈現(xiàn)出明顯的先增大后減小的變化趨勢(shì),且在T=15 min時(shí)QY達(dá)到最高值1.34%(圖1(a))。當(dāng)W由200 W增加至600 W時(shí),QY由1.10%增至1.37%;但當(dāng)W繼續(xù)從600 W增 至1 000 W時(shí),QY反而由1.37%緩慢降低至1.36%(圖1(b))。此外,隨著R由5 mg/mL增至25 mg/mL,QY也呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì),且在R=20 mg/mL時(shí)QY達(dá)到最高值1.54%(圖1(c))。綜上所述,在微波法合成N/Si-CQDs的過(guò)程中,需要經(jīng)過(guò)“氧化分解-交聯(lián)-碳化”過(guò)程。為了使氧化分解發(fā)生,需要一定的溫度和反應(yīng)時(shí)間閾值,這與微波功率及微波作用時(shí)間密切相關(guān)[15]。在單因素實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn),相對(duì)較低的功率和較短的反應(yīng)時(shí)間可以觸發(fā)前驅(qū)體碳材料初步形成N/Si-CQDs碳核結(jié)構(gòu),具有相對(duì)較低的熒光;而功率的提升和反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),往往使得前驅(qū)體進(jìn)一步碳化,這造成了碳量子點(diǎn)材料表面官能團(tuán)破壞與粒子聚集等,從而降低其熒光。綜合考慮三因素T、W、R對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)QY的影響,后續(xù)響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)選擇T的范圍為10~20 min,步長(zhǎng)為5;W的范圍為400~800 W,步長(zhǎng)為200;R的 范圍為15~25 mg/mL,步長(zhǎng)為5。

    圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析:(a)T,(b)W,(c)R。Fig.1 Analysis of single factor test results:(a)T,(b)W,(c)R.

    3.1.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

    響應(yīng)曲面法詳細(xì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表S3,方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。應(yīng)用Design-expert統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合得到:ηQY=1.61-0.1432*T+0.0348*W-0.0566*R+0.0125*TW-0.0270*TR+0.0187*WR-0.3018*T2-0.1281*W2-0.1336*R2。

    由表2可知,本研究回歸模型(P<0.001)顯著,失擬項(xiàng)(P=0.112 2>0.05)[30]表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著。因此,該模型對(duì)試驗(yàn)的擬合程度良好,能較好地反映各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系,可以利用該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行分析。由F與P值的大小可以推斷,在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi),3個(gè)因素對(duì)QY影響的順序?yàn)椋篢>R>W(wǎng)。二次項(xiàng)T2、W2和R2的影響極顯著,一次項(xiàng)T、R也達(dá)到極顯著水平,表明各提取工藝參數(shù)對(duì)量子產(chǎn)率的影響不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系[31]。根據(jù)回歸方程得到模擬的響應(yīng)曲面圖及相應(yīng)的等高線圖,如圖2(a)~(f)所示,響應(yīng)面的坡度越大,等高線的形狀越接近橢圓形,說(shuō)明響應(yīng)面對(duì)該影響因素有較高的敏感度[32],即對(duì)QY影響較大。

    表2 回歸方程方差分析Tab.2 Variance analysis of regression equation

    如圖2(a)~(f)所示,QY隨著三因素(T、W、R)的變化趨勢(shì)均呈現(xiàn)出一定弧度,但隨T因素變化,響應(yīng)曲面變化更大,R因素次之,隨W因素響應(yīng)曲面變化最小,說(shuō)明T比R與W對(duì)量子產(chǎn)率具有更顯著的影響[23,32],與方差分析結(jié)果一致。響應(yīng)面分析得到最優(yōu)工藝 為:T為14.056 min、W為618.52 W、R為19.8 mg/mL(10 mL去離子水),此時(shí)QY達(dá)到1.632%??紤]到試驗(yàn)的可行性與設(shè)備實(shí)際調(diào)節(jié)范圍,我們選擇T為14 min、W為600 W、R為19.8 mg/mL(10 mL去離子水),進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),其平均QY值為1.625%,與理論QY值(1.632%)相對(duì)偏差僅為0.215%,表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)響應(yīng)值的擬合性良好,證明該模型真實(shí)可信。因此,在后續(xù)的碳量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)和性能表征中,只選擇在上述最優(yōu)工藝條件下制得的N/Si-CQDs為研究對(duì)象。

    圖2 T與W((a)~(b))、T與R((c)~(d))、W與R((e)~(f))對(duì)QY的影響。Fig.2(a),(b)Influence of T and W on QY.(c),(d)Influence of T and R on QY.(e),(f)Influence of W and R on QY.

    3.2 N/Si-CQDs的結(jié)構(gòu)與性能

    3.2.1 N/Si-CQDs的物理形貌和化學(xué)結(jié)構(gòu)

    本研究采用高分辨率透射電子顯微鏡(TEM)研究了N/Si-CQDs的尺寸和形貌。如圖3所示,N/Si-CQDs均勻分布在水中,其顆粒多為球形,具有典型的非晶態(tài)碳質(zhì)結(jié)構(gòu),無(wú)明顯晶格[33]。使用Nano measurer軟件隨機(jī)選取100個(gè)顆粒測(cè)量粒徑,得到N/Si-CQDs的平均粒徑為1.35 nm。與現(xiàn)有報(bào)道中采用微波法制備的生物質(zhì)碳量子點(diǎn)相比,本研究制備的N/Si-CQDs粒徑更小、粒徑分布更窄,這更有利于其在細(xì)胞成像等領(lǐng)域的應(yīng)用[34]。為進(jìn)一步了解N/Si-CQDs分子結(jié)構(gòu)研究,采用拉曼光譜法分析,如圖S1所示,在1 342 cm-1和1 588 cm-1處存在兩個(gè)主要峰值,分別是D-峰和G-峰[27]。D-峰和G-峰的強(qiáng)度比(I(D)/I(G))約為1.31,表明合成的N/Si-CQDs結(jié)構(gòu)中存在大量的無(wú)定形碳,與上述TEM結(jié)果相互印證。

    圖3 N/Si-CQDs的透射電鏡圖,插圖:N/Si-CQDs的粒徑分布圖。Fig.3 TEM image.Inset:particle size distribution of N/Si-CQDs

    本研究借助紅外光譜和XPS光譜兩種表征手段,分析了前驅(qū)體淡竹葉與N/Si-CQDs所含元素、官能團(tuán)和化學(xué)鍵,如圖S2、圖S3、圖4和圖5所示。在圖4中,3 270.39 cm-1處的寬峰對(duì)應(yīng)于N—H鍵的拉伸振動(dòng)或O—H伸縮振動(dòng),較寬峰的原因是:N、O的較強(qiáng)電負(fù)性導(dǎo)致其所對(duì)應(yīng)的—NH2與—OH官能團(tuán)可與溶H2O形成氫鍵[35]。在2 933.55 cm-1附近的峰表明N/Si-CQDs結(jié)構(gòu)中存在C—H伸縮振動(dòng)[36];2 130.86 cm-1附近區(qū)域的峰表明N/Si-CQDs結(jié)構(gòu)中存在炔烴的伸縮振動(dòng)[37];在1 574.09 cm-1的峰對(duì)應(yīng)C=C鍵或N—H鍵的拉伸振動(dòng)[35];在1 361.12 cm-1處的吸收峰歸因于C—H鍵的彎曲振動(dòng)[38];在1 107.70 cm-1和1 041.83 cm-1處 的峰則應(yīng)屬于Si—O和Si—N鍵伸縮振動(dòng)[7]。與前驅(qū)體淡竹葉的的紅外光譜、XPS圖譜對(duì)比可知,經(jīng)水相微波反應(yīng)后,N/Si-CQDs相較于前驅(qū)體,親水性官能團(tuán)含量提升,Si—O、Si—N等化學(xué)鍵大量生成,由此形成了N/Si-CQDs復(fù)雜表面態(tài)。

    圖4 N/Si-CQDs的FT-IR光譜Fig.4 FT-IR spectrum of N/Si-CQDs

    圖5 (a)N/Si-CQDs的XPS譜;(b)N/Si-CQDs的元素含量;(c)C 1s的高分辨率XPS譜;(d)N 1s的高分辨率XPS譜;(e)O 1s的高分辨率XPS譜;(f)Si 2p的高分辨率XPS譜。Fig.5 XPS of the N/Si-CQDs(a),element content(b),C 1s(c),N 1s(d),O 1s(e)and Si 2p(f)spectra of the N/Si-CQDs.

    在圖5中,N/Si-CQDs的XPS全光譜顯示出4個(gè)主要的特征峰,分別對(duì)應(yīng)于C 1s(284.8 eV)、N 1s(400.0 eV)、O 1s(532.2 eV)和Si 2p(102.2 eV)的結(jié)合能,這表明N/Si-CQDs含有C(72.1%)、N(1.1%)、O(23.7%)和Si(3.1%)4種元素。通過(guò)分峰擬合操作,得到C 1s、N 1s、O 1s和Si 2p的高分辨率XPS光譜(圖5(c)~(f))。其中,C 1s譜顯示出284.9,286.4,288.3 eV的3個(gè)峰,分別歸屬 于C—C[39]、C—O[40]和C=O鍵[41]。N 1s圖 中399.4 eV和400.2 eV處的峰分別歸因于N—Si[42]和N—H鍵[41]。在O 1s圖中,532.3 eV處有1個(gè)擬合峰歸屬于C—O鍵[39];101.9 eV和102.7 eV的峰分 別 歸 屬 于Si—N[42]和Si—O鍵[43]。總 之,N/Si-CQDs的XPS譜圖分析表明,其結(jié)構(gòu)中含有C—C、C—O、C=O、N—H、Si—N和Si—O鍵等,證實(shí)了N/Si-CQDs表面存在親水基團(tuán)以及N/Si雜原子的成功摻雜,該結(jié)果與N/Si-CQDs的紅外光譜分析結(jié)果相互印證。

    3.2.2 N/Si-CQDs的熒光性能及熒光穩(wěn)定性

    N/Si-CQDs的熒光發(fā)射呈現(xiàn)出激發(fā)波長(zhǎng)依賴性,如圖6(a)。在370~430 nm激發(fā)波長(zhǎng)條件下,N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì),且當(dāng)最佳激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm時(shí),在400 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下,如圖6(b)所示,N/Si-CQDs在492 nm處出現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰,該發(fā)射波長(zhǎng)位于綠光波段區(qū)域[44]。如上所述,最佳工藝制備的N/Si-CQDs表面富含多種官能團(tuán),這些官能團(tuán)可以形成缺陷位點(diǎn)的捕獲中心[12]。一般來(lái)說(shuō),碳量子點(diǎn)的熒光機(jī)制與碳量子點(diǎn)表面態(tài)中電子和空穴之間的輻射復(fù)合有關(guān)[11]。即在一定激發(fā)波長(zhǎng)條件下,本研究制備的N/Si-CQDs表面發(fā)生了電子與空穴的輻射復(fù)合,并被光捕獲。因此,制備的N/Si-CQDs的熒光行為受N/Si-CQDs表面狀態(tài)的支配。由目前對(duì)CQDs材料激發(fā)依賴性熒光機(jī)理探討的報(bào)道可知,表面多種官能團(tuán)的存在會(huì)在其能隙之間形成多重能級(jí)及相應(yīng)的多重電子躍遷,引起CQDs材料的激發(fā)依賴行為[12,15]。因此,本研究認(rèn)為制備的N/Si-CQDs復(fù)雜的表面態(tài)導(dǎo)致了激發(fā)態(tài)的多樣性,即不同表面官能團(tuán)的存在導(dǎo)致不同躍遷模式或引起多種不同能級(jí),進(jìn)而導(dǎo)致N/Si-CQDs的激發(fā)依賴現(xiàn)象。

    為了進(jìn)一步闡明N/Si-CQDs的光學(xué)性質(zhì),如圖6(b)所示,本研究對(duì)配制的N/Si-CQDs水溶液(0.5 mg/mL)進(jìn)行了紫外-可見(jiàn)吸收光譜與熒光光譜分析,N/Si-CQDs樣品在260~350 nm的紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)表現(xiàn)出吸收,這通常歸屬于C=C鍵的π-π*躍遷,表明了N/Si-CQDs中共軛結(jié)構(gòu)的形成[45]。此外,由圖6(b)中的插圖可見(jiàn),N/Si-CQDs水溶液在可見(jiàn)光下呈淺黃色,在365 nm紫外光下表現(xiàn)藍(lán)色熒光。N/Si-CQDs具有的良好光致發(fā)光特性可能是由于芳香族sp2結(jié)構(gòu)域的帶隙躍遷、N/Si-CQDs的量子尺寸效應(yīng)和表面缺陷所致[46]。

    圖6 (a)不同激發(fā)波長(zhǎng)下N/Si-CQDs的發(fā)射光譜;(b)N/Si-CQDs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜,插圖:N/Si-CQDs水溶液分別在可見(jiàn)光(左)和紫外光365 nm(右)下的照片。Fig.6(a)Emission spectra of N/Si-CQDs at different excitation wavelengths.(b)UV-Vis absorption spectra and fluorescence spectra of N/Si-CQDs.Inset:photograph of N/Si-CQDs aqueous solution under visible light(left)and ultraviolet light(365 nm,right).

    圖7為N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度(FL)IFL穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。圖7(a)的橫坐標(biāo)表示波長(zhǎng)為365 nm的紫外光照射時(shí)長(zhǎng)(0,1,2,3,4,5,6 h),本研究將“紫外燈照射時(shí)長(zhǎng)0 h”的熒光強(qiáng)度定義為I1FL0。圖7(a)的縱坐標(biāo)表示紫外燈照射不同時(shí)長(zhǎng)下N/Si-CQDs對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度I1FL與I1FL0的比值,即為N/Si-CQDs經(jīng)紫外燈照射不同時(shí)長(zhǎng)后的熒光強(qiáng)度保留率(I1FL/I1FL0)。

    圖7(b)的橫坐標(biāo)表示NaCl水溶液濃度(0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1 mol/mL),本 研究 將“NaCl水溶液濃度為0 mol/mL”的熒光強(qiáng)度定義為I2FL0。圖7(a)的縱坐標(biāo)表示N/Si-CQDs在不同濃度的NaCl水溶液中對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度I2FL與I2FL0的比值,即為N/Si-CQDs在不同濃度的NaCl水溶液中的熒光強(qiáng)度保留率(I2FL/I2FL0)。本研究發(fā)現(xiàn)制備的N/Si-CQDs在6 h紫外燈照射后,熒光強(qiáng)度保留率為92.25%。此外,即使氯化鈉濃度高達(dá)0.1 mol/L,N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度保留率仍可達(dá)到98.90%。

    圖7 (a)365 nm紫外燈照射時(shí)間對(duì)N/Si-CQDs熒光強(qiáng)度的影響;(b)不同濃度的NaCl對(duì)N/Si-CQDs熒光強(qiáng)度的影響;(c)不同pH對(duì)N/Si-CQDs熒光強(qiáng)度的影響。Fig.7(a)Effect of illumination time under 365 nm UV light on the fluorescence intensity.(b)Effect of NaCl concentrations on the fluorescence intensity.(c)Effect of pH on the fluorescence intensity.

    本研究將“pH=4”的熒光強(qiáng)度定義為I3FL0,圖7(c)的縱坐標(biāo)表示N/Si-CQDs在不同pH水溶液中對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度I3FL與I3FL0的比值,即為N/Si-CQDs在不同pH的水溶液中的熒光強(qiáng)度保留率(I3FL/I3FL0)。如圖7(c)所示,隨著pH從4增加到10,N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度保留率為94.24%,F(xiàn)L在酸性和中性環(huán)境下幾乎保持不變。由于大多數(shù)的生物活性反應(yīng)發(fā)生在這個(gè)pH范圍內(nèi),所以N/Si-CQDs在pH=4~10范圍內(nèi)的高穩(wěn)定性使其在生物應(yīng)用中潛力巨大[27]。

    由于N/Si-CQDs溶液的熒光強(qiáng)度FL與N/Si-CQDs在水介質(zhì)形成的膠體和其形態(tài)穩(wěn)定性高度相關(guān)。因此,本研究也進(jìn)行了N/Si-CQDs 7 d內(nèi)的吸光度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn),N/Si-CQDs水溶液在避光低溫(4℃)條件下儲(chǔ)存7 d后,吸光度基本維持不變(吸光度保持率大于98.7%),見(jiàn)圖S4。結(jié)合上述對(duì)N/Si-CQDs物理形貌和化學(xué)結(jié)構(gòu)的表征分析,本研究推測(cè)N/Si-CQDs具有較高熒光穩(wěn)定性的原因是N、Si雜原子的成功摻雜誘導(dǎo)形成了大量的表面官能團(tuán)與表面缺陷。這其中N/Si-CQDs表面親水官能團(tuán)的存在使N/Si-CQDs具有良好的水溶性;同時(shí),N/Si-CQDs表面具有相同或近似的表面官能團(tuán)與表面缺陷,容易造成N/Si-CQDs納米粒子具有相同的表面電荷進(jìn)而造成N/Si-CQDs納米粒子間互斥,即在水中呈現(xiàn)出均勻單分散狀態(tài),在水介質(zhì)中形成膠體并具有一定的形態(tài)穩(wěn)定性。不僅提高了N/Si-CQDs的熒光量子產(chǎn)率與熒光強(qiáng)度,同時(shí)也提高了N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性[5-6]。

    3.3 N/Si-CQDs的細(xì)胞毒性與細(xì)胞成像分析

    圖8為HEK293細(xì)胞與不同濃度N/Si-CQDs孵育24 h后的相對(duì)細(xì)胞活性。即使在較高的N/Si-CQDs濃度(200μg/mL)下,HEK293細(xì)胞的存活率(92.95%)仍然超過(guò)90%,這說(shuō)明淡竹葉衍生的N/Si-CQDs具有優(yōu)越的生物相容性[36]。

    圖8 HEK293細(xì)胞與不同濃度N/Si-CQDs孵育24 h后的相對(duì)細(xì)胞活性Fig.8 Cell viability of HEK293 cells in the presence of diffferent concentrations of N/Si-CQDs for 24 h

    綜上所述,N/Si-CQDs展現(xiàn)出的良好的水分散性、高熒光穩(wěn)定性以及低細(xì)胞毒性,均證明其在細(xì)胞成像領(lǐng)域的應(yīng)用潛力[3,38]。為此,本研究進(jìn)行了體外細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步測(cè)試了N/Si-CQDs作為細(xì)胞成像劑的可行性。圖9為N/Si-CQDs的熒光共聚焦細(xì)胞成像圖片。在含有N/Si-CQDs(200μg/mL)的培養(yǎng)基中孵育24 h后,在405 nm激發(fā)下,HEK293細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)出綠色熒光,細(xì)胞形態(tài)正常。由此推測(cè),N/Si-CQDs很容易通過(guò)內(nèi)吞作用被細(xì)胞吸收,具有良好的細(xì)胞通透性,并明確區(qū)分細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[43]。體外活細(xì)胞成像是研究活細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重要手段,可進(jìn)一步加深對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性質(zhì)的理解。本研究制備得到的N/Si-CQDs由于其亮度、光穩(wěn)定性、可調(diào)諧的熒光發(fā)射、低毒性、廉價(jià)的制備等特性,是傳統(tǒng)的熒光探針在細(xì)胞成像領(lǐng)域內(nèi)的有力替代品[1,15]。豐富的親水表面官能團(tuán)與極小的粒徑使這種納米顆粒很容易與細(xì)胞膜相互作用,并通過(guò)內(nèi)吞過(guò)程進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中[27],在細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)出綠色熒光,表明N/Si-CQDs可能具有標(biāo)記特定的細(xì)胞器的能力,其光譜行為的變化與細(xì)胞和細(xì)胞器內(nèi)的化學(xué)變化相對(duì)應(yīng)的標(biāo)記有望為生物醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域研究提供助力[1,4]。N/Si-CQDs的低毒性使它們能夠在細(xì)胞中無(wú)害地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成像,這一結(jié)果與前人報(bào)道的生物質(zhì)CQDs具有低細(xì)胞毒性、并可運(yùn)用在細(xì)胞成像領(lǐng)域的研究結(jié)果一致[2]。因此,本研究制備得到的N/Si-CQDs有望作為熒光探針用于活細(xì)胞成像和其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

    圖9 HEK293細(xì) 胞與N/Si-CQDs(200μg/mL)孵育24 h,在激發(fā)波長(zhǎng)405 nm條件下的熒光圖像。Fig.9 Fluorescence image of HEK293 cells incubated with N/Si-CQDs(200μg/mL)for 24 h under excitation wavelength of 405 nm

    4 結(jié) 論

    本研究以熒光量子產(chǎn)率為指標(biāo),采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化淡竹葉自摻雜碳量子點(diǎn)N/Si-CQDs的微波制備工藝,確定了微波作用時(shí)間(T)、微波功率(W)、淡竹葉與去離子水的料液比(R)對(duì)熒光量子產(chǎn)率這一指標(biāo)的顯著性影響及其交互作用,確定了最佳工藝參數(shù),并進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在實(shí)際最佳工藝條件下得到的N/Si-CQDs的水分散性良好、粒徑較小且分布均勻;具有激發(fā)依賴的熒光發(fā)射;N、Si雜原子成功自摻雜使N/Si-CQDs表現(xiàn)出良好的熒光穩(wěn)定性,在長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射后與NaCl濃度范圍較廣的水溶液中熒光強(qiáng)度保留率較高;由于沒(méi)有化學(xué)試劑參與合成,該N/Si-CQDs即使在高濃度下也對(duì)HEK293細(xì)胞表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。此外,N/Si-CQDs能被HEK293細(xì)胞有效吸收,這表明該碳量子點(diǎn)在細(xì)胞成像等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。綜上所述,以淡竹葉為碳源,通過(guò)引入響應(yīng)曲面法優(yōu)化淡竹葉N/Si-CQDs的微波制備工藝,探究N/Si-CQDs在細(xì)胞成像中的應(yīng)用價(jià)值,不僅為緊迫的廢棄生物質(zhì)資源的高值化轉(zhuǎn)化利用提供了一條新思路,而且對(duì)于提高生物質(zhì)碳量子點(diǎn)的微波法制備效率、促進(jìn)其在細(xì)胞成像等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有參考價(jià)值。

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