橄欖油次生代謝產(chǎn)物oleocanthal的研究進(jìn)展

李文君, 王成章, 雷建都, 唐鳳霞, 裴 東, 宋曉波

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；林木生物質(zhì)低碳高效利用國家工程研究中心；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210042； 2.北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083； 3.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所,北京 110000)

特級初榨橄欖油(EVOO)中存在200多種不同的化合物,主要成分包括單不飽和脂肪酸、亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸等,次要成分主要有甾醇、類胡蘿卜素、萜類、生育酚和多酚等[1],其中微量的多酚化合物是其次生代謝產(chǎn)物,包括黃酮醇、木脂素和環(huán)烯醚萜,它們是香葉醇衍生的六原子雜環(huán)單萜,當(dāng)結(jié)構(gòu)被破壞時可形成二環(huán)環(huán)烯醚萜。Montedoro等[2-4]于1993年首次發(fā)現(xiàn)橄欖油類環(huán)烯醚萜,包括3,4-二羥基苯基乙醇-烯醇酸(3,4-DHPEA-EA)及其糖化形式即橄欖苦苷,其他類環(huán)烯醚萜包括橄欖苦苷的衍生物、糖化產(chǎn)物或苷元；特別是與羥基酪醇(3,4-二羥基苯基乙醇-亞麻酸二醛,3,4-DHPEA-EDA)或酪醇(對羥基苯基乙醇-亞麻酸,p-HPEA-EDA)結(jié)合的二醛形式的二醛化合物，其中p-HPEA-EDA系統(tǒng)命名為2-(4-羥基苯基)乙基(E)- 4-甲?；?3-(2-氧代乙基)己基- 4-烯酸酯。2003年,Andrewers等[5]確定oleocanthal(OC)是某些EVOO引起喉嚨刺激和辛辣的主要物質(zhì)；2005年,Smith等[6-7]報道了(+)-OC和(-)-OC對映體的全合成,其絕對立體化學(xué)也被確定。2006年,OC的(-)對映體的合成純化方法獲批專利(CA2607977 A1)。Beauchamp等[8]認(rèn)為p-HPEA-EDA是EVOO中導(dǎo)致刺激或刺痛感的唯一化合物,并將這種化合物命名為 oleocanthal(oleo代表橄欖,canth代表刺痛,al代表醛)。OC的刺痛感是口咽區(qū)域特有的,這意味著該區(qū)域存在特定的感覺受體[9],比如瞬時受體電位的陽離子通道亞家族A成員1(TRPA1)[10],而TRPA1已被證明與慢性炎癥有關(guān)[11-12],而后來的研究證實(shí)了OC具有比布洛芬更強(qiáng)的抗炎活性[8]。同時,OC能夠減少致癌的早期促進(jìn)因素即慢性炎癥的發(fā)生,食用EVOO可降低患癌的風(fēng)險,因此OC含量較高的EVOO被選為潛在的食品衍生化學(xué)預(yù)防劑[13-14]。炎癥的激活已被確定為阿爾茨海默癥發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素[15],這使OC成為對抗阿爾茨海默癥相關(guān)神經(jīng)炎癥的很有潛力的化合物。本綜述首先分析了當(dāng)前比較高效的OC提取分離方法,同時對影響OC含量的多種因素進(jìn)行了綜合討論,重點(diǎn)對其相關(guān)的生物活性進(jìn)行深入剖析,并進(jìn)一步探討了OC生物利用度方面的研究進(jìn)展,以期為OC在臨床研究中的應(yīng)用提供參考,從而促進(jìn)OC在人體健康領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。

1 OC的提取分離方法

1.1 液-液萃取分離法

Beauchamp等[8]設(shè)計(jì)了一種以EVOO為原料,提取、鑒定和定量檢測OC的具有選擇性的方法。該方法被Cicerale等[16]進(jìn)行了改進(jìn),通過OC在己烷和乙腈中液-液萃取,使含有OC的酚類組分能分配到乙腈相中,然后濃縮得粗提物。即將10 mL己烷加入含有10 g EVOO的離心管中,渦旋1 min；再加入50 mL乙腈(萃取溶劑),渦旋混合1 min；在4 000 r/min下離心5 min使溶劑從油相中分離,溶劑相在45 ℃和20 kPa條件下濃縮；取1 mL甲醇/水(HPLC級,體積比為1 ∶1)溶解該提取物后,將其轉(zhuǎn)移到離心管中,加入1 mL己烷以去除殘留的油；在4 000 r/min下離心2 min進(jìn)行相分離,收集甲醇/水相濃縮可得OC,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53.9 mg/kg,得率為5.39%。

1.2 高效逆流色譜提取法

由于OC暴露于氧氣和光照的條件下易分解,Adhami等[17]利用高效逆流色譜(HPCCC)開發(fā)了一種非常溫和的分離方法，即利用橄欖油在己烷和甲醇之間分配比的不同,制備富含酚類物質(zhì)的提取物,并分別在正相和反相模式下使用庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑(體積比為1 ∶2 ∶1 ∶2)通過HPCCC法兩步分離。在該過程中,酪醇、羥基酪醇以及不同構(gòu)型(3S/4E和3S/4Z)的OC的混合物在大約6 h內(nèi)完成分離,并通過核磁共振和液質(zhì)表征,首次明確證明了此類橄欖油提取物中3S/4E和3S/4Z構(gòu)型OC的平衡。

1.3 高真空輔助提取法

Taticchi等[18]在橄欖油提取的破碎階段和提取階段，結(jié)合最大使用壓力高達(dá)-90.66 kPa的高真空泵的真空抽取系統(tǒng),研究了不同溫度(20、 25、 30 ℃)條件對3個意大利品種佩蘭扎納(Peranzana)、莫拉約(Moraiolo)、科拉蒂(Coratina)初榨橄欖油品質(zhì)特性的影響,發(fā)現(xiàn)真空系統(tǒng)改變了油橄欖細(xì)胞的機(jī)械和結(jié)構(gòu)特性,改善了油滴的聚結(jié)性能,使酚類物質(zhì)從25.2%顯著提高到48.6%,其中，Coratina初榨橄欖油中OC從128.6 mg/kg提高到142.7 mg/kg，Moraiolo初榨橄欖油中OC從75.2 mg/kg提高到91.5 mg/kg，Peranzana初榨橄欖油中OC含量增長不明顯。而與風(fēng)味有關(guān)的揮發(fā)性化合物含量隨溫度的升高而降低,與初榨橄欖油異味相關(guān)的揮發(fā)性分子(乙醇、乙酸乙酯和乙酸)也有所減少。

1.4 離心分配色譜法

Angelis等[19]結(jié)合液-液萃取和色譜技術(shù),提出了一種從EVOO中直接回收高附加值化合物的綜合萃取和純化工藝。在實(shí)驗(yàn)室的離心分離萃取器(CPE)上開發(fā)了2種不同的萃取方法：以多個“萃取-回收”為順序的循環(huán)洗脫和基于固定相并流洗脫的連續(xù)提取方法,其中,EVOO與食品級正己烷混合進(jìn)行稀釋后作為進(jìn)料的流動相,并通過添加乙醇和水作為極性溶劑來獲得所需的雙相系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)：利用循環(huán)洗脫方法以提取含有有機(jī)相的17.5 L的EVOO可得到9.5 g總酚粗提物；利用并流連續(xù)洗脫方法以100 mL/min的速率處理2 L的EVOO可得到1.03 g的總酚提取物；然后使用逐步梯度洗脫離心分配色譜(CPC)法分離總酚類餾分。雙相溶劑系統(tǒng)由正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水按體積比2 ∶3 ∶2 ∶3組成,在容量為1 L的色譜柱上運(yùn)行4 h,從5 g總酚提取物中成功回收了910 mg OC、 882 mg oleacein(OLEA)和104 mg羥基酪醇,純度分別為85%、 92%和90%,并通過對CPC餾分的進(jìn)一步分離得到更多的單體化合物,如圖1所示。

1.2-(4-羥基苯基)乙基(E)- 4-甲?；?3-(2-氧代乙基)己基- 4-烯酸酯oleocanthal； 2.2-(3,4-二羥基苯基)乙基(Z)- 4-甲?；?3-(2-氧代乙基)己基- 4-烯酸酯oleacein； 3.羥基酪醇hydroxytyrosol； 4.酪醇tyrosol； 5.β-谷甾醇β-sitosterol； 6.齊墩果酸oleanolic acid； 7.山楂酸maslinic acid； 8.皂苷苷元(5S,8R,9S)和(5S,8S,9S)的單醛形式monoaldehydic form of ligstroside aglycon(MFLA),MFLA(5S,8R,9S) and (5S,8S,9S)； 9.橄欖苦苷苷元(5S,8R,9S)和(5S,8S,9S)的單醛形式monoaldehydic form of oleuropein aglycon(MFDA), MFOA(5S,8R,9S) and (5S,8S,9S)； 10.1-乙酰氧基松脂醇1-acetoxypinoresinol； 11.烯醇酸(5S,8R,9S)和(5S,8S,9S)elenolic acid(5S,8R,9S) and (5S,8S,9S)； 12.烯醇酸甲酯(5S,8R,9S)和(5S,8S,9S)elenolic acid methylester(5S,8R,9S) and (5S,8S,9S)； 13.烯醇酸乙酯(5S,8R,9S)和(5S,8S,9S) elenolic acid ethylester(5S,8R,9S) and (5S,8S,9S)； 14.脫羧甲基烯醇酸的二醛形式dialdehydic form of decarboximethyl elenolic acid(EDA)圖1 橄欖油總多酚提取物中分離的化合物[19]Fig.1 Chemical structures of the isolated compounds obtained from total polyphenols extracted in olive oil[19]

目前,利用離心分配色譜法并結(jié)合離心分離萃取裝置進(jìn)行純化分離的方法更加高效和系統(tǒng)化。Angelis等[20]已經(jīng)完成了實(shí)驗(yàn)室中試,將240 L的EVOO分成3份分別提取,2 h內(nèi)共可以得到285 g的橄欖油總多酚提取物(TPF),然后取10 g TPF純化后得到2 020.6 mg純度98%的OC。因此,該方法為未來OC的大量制備提供了極大的可能,可對未來OC在體內(nèi)和臨床方面的研究提供更多的物質(zhì)支持。

2 OC含量的主要影響因素

OC含量的影響因素主要有酚類提取方法、油橄欖生長的地理位置、油橄欖樹栽培品種、油橄欖種植技術(shù)、油橄欖成熟度、橄欖油的加工過程、橄欖油的儲存及其加熱效應(yīng)。

Smith等[6]開發(fā)了一種特定的油橄欖提取和定量方法,發(fā)現(xiàn)OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)在(8.3±4.0) mg/kg至(189.9±2.7) mg/kg區(qū)間波動。而其他非針對OC的方法也被用于量化此類環(huán)烯醚萜類化合物,這可能會引起OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大的變化((5.0±0.3)～(498.0±47.0) mg/kg)[21]。不同地理位置生產(chǎn)的EVOO中OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同,研究發(fā)現(xiàn)意大利的一些EVOO中OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高((191.8±2.7) mg/kg),而來自美國的EVOO中OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低((22.6±0.6) mg/kg)[21]。EVOO中OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)也會因油橄欖品種不同而有所差異,比如Coratina、伯羅奔尼撒(Seggianese)、佛奧(Frantoio)、奧尼(Oliarola)和塔加斯卡(Taggiasca)的EVOO中OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(78.2±0.5)、(53.0±12.0)、(43.8±3.1)、(21.0±0.8)和(8.3±4.0) mg/kg[21],最大差別將近有10倍。

油橄欖種植過程中使用的農(nóng)業(yè)技術(shù)也會影響EVOO中酚類化合物OC的質(zhì)量分?jǐn)?shù),比如被較多灌溉的橄欖樹比最少灌溉的橄欖樹的OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少了37%～38%[21]。收獲時橄欖果實(shí)的成熟度也是EVOO中酚類成分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的重要預(yù)測指標(biāo),研究發(fā)現(xiàn)隨著采摘日期的延長和橄欖果實(shí)成熟度的增加,EVOO中OC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在短短兩個月內(nèi)下降了43%(由148.0 mg/kg降低至84.0 mg/kg)[22]。Gomez-Rico等[23]通過觀察兩個不同品種的油橄欖果,發(fā)現(xiàn)隨著成熟度指數(shù)的增加,OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別減少了20%和54%。影響EVOO中OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的另一個因素是橄欖果加工成油的過程,傳統(tǒng)加工方法中,包括核在內(nèi)的整個橄欖果實(shí)都被壓碎(OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(43.8±3.1) mg/kg),而在壓碎前去除橄欖核OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)會更高((54.8±3.1) mg/kg)[21]。此外,與兩相離心處理方法相比,在三相離心方法中加入水,將會導(dǎo)致EVOO中的OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)從(78.2±0.5) mg/kg降低到(67.3±2.6) mg/kg[21]。從橄欖果中提取油后立即在無氧避光的條件下儲存EVOO,對OC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響最小。盡管大多數(shù)橄欖油酚類化合物在烹飪過程中會因?yàn)榧訜岫到?但當(dāng)EVOO中存在大量的OC時,OC在加熱過程中反而由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗氧化活性只有少部分降解,能夠保持相對穩(wěn)定的存在[21]。

3 OC的主要生物活性

3.1 抗炎活性

布洛芬作為一種普通的結(jié)構(gòu)性非甾體抗炎藥(NSAID),具有刺痛喉嚨的感官特性。而OC由于具有與布洛芬相似的感官特性,促使人們對OC的抗炎特性進(jìn)行了廣泛研究。Beauchamp等[8]研究發(fā)現(xiàn)：OC對促炎介質(zhì)前列腺素合成的限速酶如環(huán)加氧酶-1(COX1)和環(huán)加氧酶-2(COX2)的活性具有抑制作用,并且表現(xiàn)為劑量依賴性；同時,OC也被認(rèn)為是一種天然存在的NSAID。Iacono等[24-26]研究表明：OC能夠抑制與癌癥起始和發(fā)展相關(guān)的COX1和COX2的活性,減少致癌的早期促進(jìn)因素慢性炎癥的發(fā)生,食用EVOO可降低患各種癌癥的風(fēng)險。因此,OC含量較高的EVOO被選為潛在的食品衍生化癌癥預(yù)防劑[13-14]。

風(fēng)濕性疾病,如骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,是肌肉骨骼系統(tǒng)的多因素退行性疾病。越來越多的證據(jù)表明,關(guān)節(jié)組織內(nèi)的炎癥過程是這些復(fù)雜病理的起源、發(fā)展和加重的關(guān)鍵因素。由于對人體生理機(jī)械性能和應(yīng)力的響應(yīng),軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨的獨(dú)特常駐細(xì)胞,過度表達(dá)促炎介質(zhì)(一氧化氮、細(xì)胞因子、趨化因子和脂肪因子)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá),導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞和功能喪失。在非細(xì)胞毒性劑量(1～10 μmol/L)下,OC及其衍生物抑制了脂多糖(LPS)處理的軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5中一氧化氮的產(chǎn)生和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)的表達(dá)[24]。在LPS刺激的軟骨細(xì)胞中,OC可降低炎性細(xì)胞因子,即IL- 6和MIP-1α的表達(dá)和分泌[27]。

Scotece等[26]在評估OC對來自骨關(guān)節(jié)炎患者的人類原代軟骨細(xì)胞的影響時發(fā)現(xiàn),OC可抑制一氧化氮的產(chǎn)生并減少LPS誘導(dǎo)的幾種促炎因子,包括NOS2、COX2、IL- 6、IL-8、CCL3、LCN2和TNF-α；此外,OC還能抑制人基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)和聚蛋白多糖降解酶-5(ADAMTS-5)的表達(dá),表明OC可能是治療滑膜關(guān)節(jié)炎癥和軟骨退化的潛在藥物,信號通路MAPK/p38/NF-κB似乎也與OC活性有關(guān)。除了軟骨細(xì)胞,骨關(guān)節(jié)炎滑膜中浸潤的巨噬細(xì)胞也有助于骨關(guān)節(jié)炎的炎癥和基質(zhì)的降解。OC減少了兩者一氧化氮的產(chǎn)生和相關(guān)促炎細(xì)胞因子的分泌,包括IL- 6、MIP-1α、IL-1β以及巨噬細(xì)胞系J774A.1中的TNF-α和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)[28]。因此,OC能夠通過減少與關(guān)節(jié)疾病相關(guān)的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)來抑制軟骨中的局部炎癥并防止滑膜環(huán)境中的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

3.2 抗癌活性

3.2.1概述 通過長期攝入富含OC的EVOO可能會減少炎癥的發(fā)生,有助于減緩癌癥的發(fā)展,這種藥理學(xué)上與布洛芬的相似性增加了OC作為天然抗癌劑的可能。此外,與布洛芬相比，在等摩爾濃度下OC對COX1和COX2酶表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。OC對來自肝細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤的幾種癌細(xì)胞系具有較強(qiáng)的抗癌活性[27],可以抑制黑色素瘤以及前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[29-30]。同時,OC對原代或非癌細(xì)胞系表現(xiàn)出較低或無細(xì)胞毒性。近年來,多項(xiàng)研究已經(jīng)確定了多種癌細(xì)胞中OC的分子靶點(diǎn)。熱休克蛋白-90(Hsp-90)是參與穩(wěn)定幾種腫瘤生長的一種關(guān)鍵蛋白,也被確定為人類白血病單核細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系U937中OC的抑制靶點(diǎn)[31]。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,是PI3K相關(guān)激酶家族的成員,在代謝應(yīng)激條件下在支持癌細(xì)胞的存活和增殖方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,研究表明OC可能是有效的雙重PI3K/mTOR抑制劑,可抑制mTOR的酶活性(IC50值為708 nmol/L)[32]。OC還能夠抑制細(xì)胞間質(zhì)上皮置換因子(c-Met)的磷酸化,IC50值為4.8 μmol/L，該激酶在多種腫瘤中起著重要的致癌作用,研究表明OC可作為控制c-Met依賴性惡性腫瘤的治療化合物[30]。此外,OC被認(rèn)為是PC3(前列腺)、MDA-MB-231(乳腺)和 BxPC3(胰腺)癌細(xì)胞系的快速選擇性誘導(dǎo)劑,通過進(jìn)入溶酶體并抑制酸性鞘磷脂酶(ASM)活性,從而誘導(dǎo)溶酶體膜透化[33]。

3.2.2黑色素瘤 黑色素瘤是一種來源于惡變黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤,主要存在于皮膚,其中在有色人種和亞洲人種中,皮膚黑色素瘤約占黑色素瘤的50%～70%,具有預(yù)后差、易轉(zhuǎn)移、耐藥性強(qiáng)、發(fā)病率高及死亡率高的特點(diǎn)。Fogli等[34]對OC的抗黑色素瘤活性研究發(fā)現(xiàn),OC通過抑制磷酸化和抑制B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)蛋白表達(dá)的方式,表現(xiàn)出對人類惡性黑色素瘤細(xì)胞的抗增殖作用。OC還能夠抑制皮下異種移植模型中的腫瘤生長,并通過抑制轉(zhuǎn)錄-3激活因子(STAT3)信號通路下調(diào)STAT3靶基因,如Mcl-1、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9和VEGF來抑制肺轉(zhuǎn)移模型中黑色素瘤的轉(zhuǎn)移,而這些基因均參與了黑色素瘤的凋亡、侵襲和血管生成[35]。

最近,OC也被證明通過抑制ERK和AKT信號通路，以及通過抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶(B-Raf)表達(dá)來降低非黑色素瘤皮膚癌細(xì)胞系的活力[36]。OC已被證明對包括A375、 501Mel和G361細(xì)胞在內(nèi)的幾種人類黑色素瘤細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性[34-35]。同時,OC在20～40 μmol/L的濃度下具有抑制A375細(xì)胞集落形成的能力[35]；在10 μmol/L濃度下可抑制人體皮膚惡性黑色素瘤A375和A2058細(xì)胞的遷移入侵[37]；還可通過抑制人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、侵襲和血管的形成發(fā)揮抗血管生成的活性[37]。OC還可以減少Bcl-2的mRNA,抑制蛋白AKT和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK 1/2)磷酸化,從而誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡[38]。

此外,OC通過阻斷ERK 1/2信號通路,抑制12-O-十四烷酰醇-13-乙酸酯(TPA)誘導(dǎo)正常小鼠表皮JB6 CI41細(xì)胞的增殖和腫瘤轉(zhuǎn)化[39-40]。Gu等[35]研究發(fā)現(xiàn)：OC能夠抑制STAT3在A375細(xì)胞上的信號轉(zhuǎn)換；抑制STAT3磷酸化、核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性來干擾STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；減少STAT3下游信號蛋白,包括髓系白血病-1、B細(xì)胞淋巴瘤-XL、MMP-2/9和VEGF,從而導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞凋亡；抑制了STAT3上游激活因子、Janus激酶-2(JAK2)和Src激酶信號在黑色素瘤細(xì)胞凋亡中的作用。該研究還發(fā)現(xiàn)在雌性BALB/c裸鼠中,OC(10 mg/(kg·d))通過激活凋亡因子caspase-3/9和抑制STAT3、JAK2和雞肉瘤基因(Src)激酶信號通路,抑制A375異種移植瘤誘導(dǎo)的腫瘤生長、增殖和血管生成。OC對STAT3信號通路的影響如圖2所示[40]。

圖2 Oleocanthal對STAT3信號通路的影響[40]Fig.2 The effect of oleocanthal on the STAT3 signal pathway[40]

3.2.3多發(fā)性骨髓瘤 多發(fā)性骨髓瘤是一種典型的漿細(xì)胞惡性腫瘤,通過激活骨髓微環(huán)境中的破骨細(xì)胞(降解骨基質(zhì)的細(xì)胞)導(dǎo)致破壞性骨破壞。Scotece等[27]研究證明OC通過激活凋亡機(jī)制和下調(diào)ERK-1/2 和AKT信號通路來抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖；另外,MIP-1α的分泌是多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生溶骨性骨病變的關(guān)鍵因素,OC可以抑制其巨噬細(xì)胞抑制因子的表達(dá)。

3.2.4乳腺癌 在乳腺癌中,OC可以抑制乳腺癌細(xì)胞系中肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移、侵襲和G1/S細(xì)胞周期進(jìn)程的劑量依賴性以及乳腺癌小鼠模型中的腫瘤生長[41]。OC還能夠抑制管腔乳腺癌細(xì)胞系中雌激素受體的表達(dá),并且當(dāng)與他莫昔芬聯(lián)合使用時,可在體外和體內(nèi)協(xié)同抑制細(xì)胞生長[42],該結(jié)果證明了OC具有抑制激素依賴性乳腺癌，提高對他莫昔芬治療敏感性方面的潛力。

3.2.5結(jié)腸癌 激活蛋白-1(AP-1)是結(jié)腸癌細(xì)胞系中調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,OC可以抑制AP-1的活性[43]。Prem等[39]發(fā)現(xiàn)OC在HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中通過抑制COX2和激活腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活性達(dá)到在體外和體內(nèi)的抗癌作用。

綜上,OC具有廣泛且有效的抗癌活性,且相比其他植物化學(xué)物質(zhì)或癌癥藥物,OC價格便宜,沒有副作用[40],可以從橄欖油中直接獲取。因此，未來OC非常有希望作為預(yù)防或治療各種癌癥的有效補(bǔ)充藥物。

3.3 神經(jīng)保護(hù)作用

阿爾茨海默癥和帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病會逐漸損害人的記憶、認(rèn)知、步態(tài)、運(yùn)動協(xié)調(diào)和社交等,是對人口老齡化的巨大挑戰(zhàn)。這些神經(jīng)退行性疾病的病理學(xué)特征在于特定肽或蛋白質(zhì),比如阿爾茨海默癥中的β-淀粉樣蛋白(Aβ肽)和微管相關(guān)蛋白(Tau蛋白)形成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維狀聚集體的錯誤折疊和聚集,一般存在于彌漫性老年斑以及營養(yǎng)不良或退化性神經(jīng)突觸和腦血管周圍。這些斑塊沉積會損害細(xì)胞生理學(xué)活力、改變神經(jīng)元功能并導(dǎo)致行為缺陷的產(chǎn)生,這是許多神經(jīng)退行性疾病的特征。目前,炎癥的激活已被確定為阿爾茨海默癥發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素[15],而OC具有的強(qiáng)大抗炎活性,使其成為對抗阿爾茨海默癥相關(guān)神經(jīng)炎癥的很有潛力的化合物。

OC可降低阿爾茨海默癥動物模型大腦中的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和IL-1β水平[44]；還能夠有益地干擾疾病相關(guān)肽/蛋白質(zhì)的聚集和清除途徑,從而防止淀粉樣蛋白相關(guān)的神經(jīng)變性；OC可通過與Tau片段K18的賴氨酸殘基的ε-氨基共價交聯(lián)來抑制Tau蛋白纖維化[39]；還可以通過共價方式結(jié)合Tau蛋白,誘導(dǎo)構(gòu)象重排,避免蛋白質(zhì)聚集[44]。另外,OC還通過改變Aβ結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)性,減少突觸結(jié)合和突觸毒性來干擾Aβ聚集[31]；OC通過上調(diào)跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,即P-糖蛋白和LDL脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(LRP-1)來誘導(dǎo)Aβ流出和清除[45-46]；同時,OC還可以減少Aβ誘導(dǎo)的炎癥,恢復(fù)被Aβ降低的神經(jīng)支持蛋白的星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),并防止了Aβ誘導(dǎo)的突觸蛋白(SNAP-25和PSD-95)在SH-SY5Y-APP神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)[47]。

目前,評估OC神經(jīng)保護(hù)作用的生物體內(nèi)研究不多,在關(guān)于阿爾茨海默癥的動物模型中,Tg-SwDI小鼠的相關(guān)數(shù)據(jù)具有一定的參考價值。通過連續(xù)4周的腹腔注射OC(5 mg/(kg·d))實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：OC可以顯著降低海馬淀粉樣蛋白斑塊負(fù)荷和微血管,這與Aβ通過血腦屏障的大腦清除率增加、淀粉樣清除蛋白(如P-糖蛋白和LRP-1)的表達(dá)增加以及載脂蛋白E(ApoE)依賴性淀粉樣蛋白清除途徑的激活有關(guān)[43]。Batarseh等[48]在阿爾茨海默癥5xFAD小鼠模型中，使用富含OC的EVOO(476 μg/(kg·d))喂養(yǎng)4個月后也獲得了類似的結(jié)果。

3.4 心血管保護(hù)作用

富含OC的橄欖油在抗心血管疾病方面有多種積極作用,如改善早期動脈粥樣硬化患者的內(nèi)皮功能[49]和抗血小板作用[50]。OC還對核因子JB具有抑制作用[51],可減少血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)的表達(dá),從而減少白細(xì)胞在內(nèi)皮中的粘附,并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞功能的正?；痆52]。此外,OC作為酪醇衍生物被列入歐洲食品和安全局的健康聲明,其中指出每20 g油中含有5 mg羥基酪醇及其衍生物(例如橄欖苦苷復(fù)合物和酪醇)的EVOO可以保護(hù)低密度脂蛋白顆粒免受氧化損傷[53]。

3.5 糖尿病的預(yù)防和治療作用

OC在2型糖尿病的預(yù)防和治療方面具有很大潛力。糖尿病的特征是由細(xì)胞胰島素受體的非磷酸化引起的胰島素抵抗,其被促炎分子(如TNF-α)阻斷[54]。因此,OC可能具有抑制或減少促炎分子的作用,從而降低胰島素抵抗的能力。Czerwinska等[55]研究發(fā)現(xiàn)含有OC和OLEA的女貞葉子提取物可以減輕大鼠因糖尿病產(chǎn)生的痛覺過敏,從而提出了OC/OLEA與糖尿病之間的聯(lián)系,這種由周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的神經(jīng)性障礙是慢性糖尿病的典型并發(fā)癥。盡管在該領(lǐng)域已有大量研究,但還需要更多的數(shù)據(jù)來充分了解OC在糖尿病預(yù)防和治療方面的功能特性和對健康的潛在影響。特別是需要研究確定OC對Sirtuin蛋白家族的影響,因?yàn)镾irtuin蛋白家族可調(diào)節(jié)基因組的維持、壽命和代謝,并負(fù)責(zé)細(xì)胞機(jī)制,如衰老、轉(zhuǎn)錄、凋亡和炎癥[56-57]。

許多體外和體內(nèi)研究表明,EVOO中次生代謝產(chǎn)物OC可有效改善炎癥和氧化應(yīng)激,并對風(fēng)濕病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和糖尿病的標(biāo)志物產(chǎn)生有益影響。

4 OC的生物利用度

生物利用度是指制劑中藥物被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度與程度，而口服生物利用度不僅取決于吸收程度,還取決于首過代謝的程度。首過代謝可在物質(zhì)到達(dá)全身循環(huán)之前發(fā)生在腸道或肝臟中，因此,為了探索EVOO中的特征性多酚成分OC和OLEA如何被吸收、生物轉(zhuǎn)化/排泄，攝入后的作用機(jī)制及其對疾病的預(yù)防作用,有必要研究和了解影響EVOO中多酚生物利用度的因素。EVOO中多酚的生物利用度和生物轉(zhuǎn)化與其特性密切相關(guān),但目前仍知之甚少,必須對其通過人體代謝的方法進(jìn)行研究。常用的方法是使用具有生物學(xué)相關(guān)濃度的EVOO酚類化合物進(jìn)行干預(yù)，比如,口服EVOO后觀察其多酚結(jié)構(gòu)和活性的改變及代謝反應(yīng),發(fā)現(xiàn)EVOO苷元類環(huán)烯醚萜可以被胃的酸性環(huán)境部分水解,釋放出游離酚醇,但仍有相當(dāng)一部分完整地進(jìn)入了小腸[58-59]。雖然大部分多酚以糖苷的形式存在于植物中,但通常只有它們的苷元才可以被小腸吸收,因此多酚在上皮細(xì)胞中被β-葡萄糖苷酶去糖基化,對其后續(xù)的吸收和利用至關(guān)重要[32,59]。EVOO中多酚是通過小腸上皮細(xì)胞屏障中的Caco-2/TC7細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn),主要代謝物是甲基化偶聯(lián)物,并且羥基酪醇乙?；鰪?qiáng)了其向腸細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)[58-59]。

EVOO中多酚大多數(shù)在小腸中被吸收[58-60],但到達(dá)大腸的多酚會被結(jié)腸微生物群迅速降解,這樣有助于多酚的生物轉(zhuǎn)化[61]。EVOO中多酚及其代謝物被證明是腸道微生物群構(gòu)成及其功能的調(diào)節(jié)劑,即抑制有害細(xì)菌的生長和促進(jìn)有益細(xì)菌的生長(類似益生元的作用)[62]。Prieto等[63]研究發(fā)現(xiàn),相比富含黃油的飲食,富含EVOO的飲食對代謝綜合征的生化參數(shù)有積極影響,這可能與腸道細(xì)菌分類群的減少有關(guān)。此外,由于雙歧桿菌的特定生長以及具有抗氧化活性的微生物酚類代謝物的刺激,攝入富含酚類化合物的EVOO對高膽固醇患者具有心臟保護(hù)作用[62]。

EVOO被吸收后，其所含的多酚通過與兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、尿苷-5-二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDPGT)和磺基轉(zhuǎn)移酶(SULT)的作用發(fā)生結(jié)合。因此,在首過代謝(腸-肝)后,這些多酚以葡萄糖醛酸化、甲基化和硫酸化結(jié)合物的形式進(jìn)入體循環(huán)[58-59]。多項(xiàng)研究[58-60,64]證實(shí)口服EVOO后,EVOO類脂代謝產(chǎn)物(如羥基酪醇、酪醇和油橄欖苷)主要在人體血漿和尿液中；同時,也有一小部分代謝物是葡萄糖醛酸產(chǎn)物,以及兒茶酚基團(tuán)與硫酸鹽多重結(jié)合物；此外,EVOO類環(huán)烯醚萜類化合物的生物轉(zhuǎn)化還包括還原(氫化)、羥基化和水合作用。有研究表明橄欖油多酚及其代謝物可以包埋在低密度脂蛋白(LDL)中,這與LDL的體外抗氧化性直接相關(guān)[58]。

EVOO中多酚到達(dá)血液后,能夠穿透組織,特別是具有代謝作用的組織；EVOO中的多酚也可以通過血腦屏障,雖然它的大腦攝取率低于其他器官,但是組織代謝物可能與血液代謝物不同,特別是在肝臟和腎臟中可以檢測到未結(jié)合的羥基酪醇[58-59,65-66]。EVOO中多酚的葡萄糖醛酸結(jié)合代謝物可以通過β-葡萄糖醛酸酶在組織中解偶聯(lián),釋放母體糖苷配基；此外,EVOO中的多酚也可以通過劑量依賴性在特定組織內(nèi)積累并被檢測到[67]。橄欖油多酚在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)和生物利用度的研究已經(jīng)很多[60,67-69],但大多數(shù)報道是關(guān)于人體尿液中EVOO多酚含量和形式的研究,涉及到其在人體中新陳代謝和排泄,及在血漿濃度中的數(shù)據(jù)仍然很少。Gómez-Romero等[58]研究發(fā)現(xiàn),EVOO中多酚的最大排泄量發(fā)生在攝入2～6 h后,而可從尿液中回收的多酚至少是攝入量的5%,但代謝物主要是葡萄糖醛酸化的結(jié)合物。

目前,關(guān)于EVOO中多酚生物利用度的研究還有待進(jìn)一步完善和加強(qiáng),尤其是對OC生物利用度的獨(dú)立研究仍然非常有限。Pang等[70]在模擬胃酸條件下研究OC和其他油橄欖多酚的穩(wěn)定性和擴(kuò)散性,結(jié)果表明OC可從油相擴(kuò)散到水溶液中,且在37 ℃的酸性條件下可穩(wěn)定存在長達(dá)4 h。García-Villalba等[64]研究了人體中OC的生物轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)OC主要通過I相代謝進(jìn)行代謝,特別是氫化、羥基化和水合作用,并且一些氫化的OC代謝物會進(jìn)一步經(jīng)歷II相代謝,即葡萄糖醛酸化。

5 結(jié)語與展望

橄欖油次生代謝產(chǎn)物oleocanthal(OC)具有極好的生物活性,尤其是優(yōu)于布洛芬的抗炎能力,使其對炎癥介導(dǎo)的慢性疾病的預(yù)防和治療具有巨大潛力。尤其是隨著與年齡有關(guān)的慢性疾病如關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病、阿爾茨海默病等的發(fā)病率不斷上升,亟需制定新穎且合理的預(yù)防策略,而OC作為天然抗炎活性成分有望發(fā)揮巨大作用。因此,以富含OC的優(yōu)質(zhì)EVOO為原料開發(fā)天然的營養(yǎng)保健品,是改善人們健康的有效手段,對提高EVOO在膳食營養(yǎng)補(bǔ)充劑行業(yè)的競爭力具有重要意義。同時,以O(shè)C為主導(dǎo)的藥物制劑的開發(fā)也是十分必要的,而藥物化學(xué)和計(jì)算化學(xué)可對其分子支架的生物可利用性和生物活性分子的快速設(shè)計(jì)提供助力,但作為具有廣泛理化性質(zhì)和生物活性的信號分子,OC的作用機(jī)理仍未明確,仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。另外,利用新型遞送系統(tǒng)(通過口服或局部給藥)的設(shè)計(jì)來提高EVOO次生代謝產(chǎn)物OC的吸收利用也是非常重要的課題。但是,由于細(xì)胞培養(yǎng)研究中所使用的濃度可能無法在生理上實(shí)現(xiàn),因此下一步OC在臨床研究中的健康特性還需要更多的體外和體內(nèi)研究數(shù)據(jù)來驗(yàn)證,這也將極大地促進(jìn)OC藥理、藥效的綜合探索,為其在人體健康領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展提供更多助力。