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    不同通路配置對(duì)大腸桿菌合成2’-巖藻糖基乳糖的影響

    2023-01-07 03:21:34梁山泉張登婭楊紹青江正強(qiáng)
    食品科學(xué) 2022年24期
    關(guān)鍵詞:補(bǔ)料基轉(zhuǎn)移酶乳糖

    梁山泉,張登婭,楊紹青,何 滋,劉 丹,江正強(qiáng)

    (中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,中國(guó)輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

    人乳寡糖是母乳中僅次于乳糖和脂肪的第3大固體成分,含量為5~15 g/L[1]。在人乳寡糖中,2’-巖藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)含量最高,達(dá)31%[2]。研究表明,2’-FL具有許多生理功能,包括益生元活性、防止病原體黏附、腸上皮細(xì)胞反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、免疫調(diào)節(jié)劑、預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎和促進(jìn)大腦發(fā)育等[3]。目前2’-FL已成為嬰幼兒配方奶粉核心配料的研究熱點(diǎn)。2’-FL的主要獲取方法包括從母乳中提取、化學(xué)合成、酶法合成和微生物合成[4]。相較于其他3種方法,微生物合成法更具有經(jīng)濟(jì)性和高效性,是合成2’-FL最有潛力的方法[5]。大腸桿菌(Escherichia coli)具有清晰的遺傳背景和豐富的遺傳操作工具,是目前用于微生物合成2’-FL最多的底盤細(xì)胞[6]。2’-FL的微生物合成是在α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下,將巖藻糖從鳥(niǎo)苷二磷酸(guanosine diphosphate,GDP)-L-巖藻糖轉(zhuǎn)移到乳糖上。GDP-L-巖藻糖是2’-FL合成過(guò)程中關(guān)鍵前體物,已經(jīng)確定了兩種不同的合成途徑:從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑。大腸桿菌自身能通過(guò)內(nèi)源性從頭途徑合成GDP-L-巖藻糖,主要涉及磷酸甘露糖變位酶(phosphomannomutase,manB)、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶(mannose-1-phosphate guanyltransferase,manC)、GDP-D-甘露糖-4,6-脫水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase,Gmd)和GDP-L-巖藻糖合酶(GDP-fucose synthase,WcaG/FuI)[7]。補(bǔ)救合成途徑中,在雙功能酶L-巖藻糖激酶/GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶(fucose kinase/fucose-1-phosphate guanylyltransferase,F(xiàn)KP)的作用下將巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)并合成GDP-L-巖藻糖[8]。

    兩種合成GDP-L-巖藻糖的途徑都通過(guò)許多代謝工程改造提高2’-FL的產(chǎn)量。在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)GDP-L-巖藻糖從頭合成途徑基因,2’-FL產(chǎn)量為1.23 g/L[9]。Huang Di等[10]過(guò)表達(dá)GDP-L-巖藻糖從頭途徑基因,并通過(guò)調(diào)節(jié)輔因子鳥(niǎo)嘌呤-5’-三磷酸(guanine-5’-triphosphate,GTP)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的供給、優(yōu)化前體物質(zhì)的供應(yīng)(敲除lacZ、wcaJ和編碼Lon蛋白酶的基因lon)、篩選更高效的菌株和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,大腸桿菌重組菌2’-FL產(chǎn)量提高了近10 倍,達(dá)9.12 g/L。此外,在大腸桿菌中引入了GDP-L-巖藻糖合成的補(bǔ)救途徑,對(duì)內(nèi)源性乳糖操縱子修飾,通過(guò)敲除巖藻糖異構(gòu)酶和巖藻糖激酶的fucI-fucK基因簇增加巖藻糖的供給,2’-FL產(chǎn)量顯著提高到23.1 g/L[11]。除了增加GDP-L-巖藻糖和乳糖的供給、減少旁路代謝通路的碳流量、增加α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá)外,平衡合成通路中基因表達(dá)強(qiáng)度也是提高2’-FL產(chǎn)量的一個(gè)重要策略。通過(guò)改變質(zhì)??截悢?shù),調(diào)整基因表達(dá)強(qiáng)度從而使重組菌2’-FL的產(chǎn)量從2.28 g/L提高到2.52 g/L[12]。通路配置可用于調(diào)整基因的表達(dá)強(qiáng)度,與改變質(zhì)粒拷貝數(shù)不同的是,其將多個(gè)基因組織成操縱子、假操縱子和單順?lè)醋有问竭M(jìn)行表達(dá)[13]。作為一種調(diào)節(jié)多個(gè)基因的便捷方法,通路配置已在提高多種化合物的合成中應(yīng)用,如類黃酮、丁醇和白藜蘆醇等[13-15]。但目前尚沒(méi)有關(guān)于通路配置對(duì)合成2’-FL影響的報(bào)道。

    本研究首先在大腸桿菌BL21 Star (DE3)中構(gòu)建2’-FL的從頭合成通路,再利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除lacZM15序列和wcaJ增加2’-FL產(chǎn)量,之后基于通路配置進(jìn)一步提高2’-FL產(chǎn)量,旨在為2’-FL的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    TransStart FastPfuDNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖 北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;DNA Marker 北京博邁德基因技術(shù)有限公司;瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒 美國(guó)Axygen公司;無(wú)縫克隆試劑盒C112、C113 南京諾唯贊生物科技股份有限公司;高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒 北京天根生物科技有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)、卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、大觀霉素、硫胺素 美國(guó)Inalco公司;2’-FL標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%) 上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    LB液體培養(yǎng)基、LB瓊脂固體培養(yǎng)基、改良的M9培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[16]的方法配制。分批補(bǔ)料培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[17]的方法配制。

    1.2 儀器與設(shè)備

    T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀 美國(guó)Bio-Rad公司;BG-Power 600電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司;凝膠成像分析系統(tǒng) 北京賽百奧科技有限公司;BSA124S天平美國(guó)Ohaus公司;HWS-26恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;移液槍 德國(guó)Eppendorf公司;ZQLY-180N搖床 上海知楚儀器有限公司;1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀美國(guó)Agilent公司;BIOTECH-10JG-7000A發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司;Q ExactiveTM質(zhì)譜儀美國(guó)Thermo Scientific公司。

    1.3 方法

    1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建

    根據(jù)文獻(xiàn)[13,18]的方法構(gòu)建質(zhì)粒pETDuet-BCGF、pCDFDuet-futC、pETDuet-CBGFF-gene cluster、pETDuetmanB-futC-operon、pETDuet-manB-futC-pseudo operon和pETDuet-manB-futC-monocistronic。實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒的信息如表1所示,引物和測(cè)序均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

    表1 本研究所用菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

    1.3.2 基因敲除

    采用Jiang Yu等[19]建立的pTargetF和pCas雙質(zhì)粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)。得到lacZM15序列敲除的菌株BS-1和wcaJ敲除的菌株BS-2。

    1.3.3 搖瓶發(fā)酵

    將重組質(zhì)粒pETDuet-BCGF和pCDFDuet-futC共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 Star (DE3)、BS-1和BS-2感受態(tài)細(xì)胞中,分別得到菌株BS-3、BS-4和BS-5。將重組質(zhì)粒pETDuet-BCGFF-gene cluster、pETDuet-manB-futC-operon、pETDuet-manB-futC-pseudo operon和pETDuetmanB-futC-monocistronic轉(zhuǎn)化至BS-2感受態(tài)細(xì)胞中,分別得到菌株BS-6、BS-7、BS-8和BS-9。鑒定正確的陽(yáng)性克隆子挑取至LB液體種子培養(yǎng)基(含有相應(yīng)的抗生素),37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)作為種子液。取1 mL種子液加入到含50 mL M9培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm=0.6~0.8,加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG。培養(yǎng)2 h后加入乳糖至10 g/L,25 ℃培養(yǎng)72 h,定時(shí)取樣,使用HPLC定量檢測(cè)2’-FL的產(chǎn)量。

    1.3.4 分批補(bǔ)料發(fā)酵

    挑取BS-9單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基(含有相應(yīng)的抗生素)中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)10 h。取3 mL于300 mL分批補(bǔ)料培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)10 h,作為種子液。10 L發(fā)酵罐中加入3.7 L分批補(bǔ)料培養(yǎng)基及300 mL種子液,25 ℃、800 r/min培養(yǎng)至甘油消耗完全,分別加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG和20 g/L乳糖。采用溶氧聯(lián)動(dòng)補(bǔ)料的策略(溶氧≤30%),維持pH 6.8,誘導(dǎo)表達(dá)后每6 h取樣1 次。

    1.3.5 生物量測(cè)定

    以分批補(bǔ)料培養(yǎng)基作為對(duì)照,發(fā)酵液稀釋到適當(dāng)濃度于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌體光密度。按式(1)計(jì)算細(xì)胞干質(zhì)量(dry cell weight,DCW)[20]:

    1.3.6 乳糖和2’-FL含量測(cè)定

    發(fā)酵液沸水浴10 min,8 000 r/min離心10 min,取上清液過(guò)0.22 μm濾器,使用HPLC進(jìn)行定量分析。HPLC條件:Rezex ROA-Organic Acid H+(8%)色譜柱(300 mm×7.8 mm);柱溫60 ℃;流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸溶液,流速為0.6 mL/min;進(jìn)樣體積為10 μL。采用示差折光檢測(cè)器,檢測(cè)器溫度35 ℃。按式(2)計(jì)算乳糖轉(zhuǎn)化率:

    1.3.7 分子質(zhì)量測(cè)定

    使用質(zhì)譜儀在電噴霧離子源正離子模式下,采集2’-FL標(biāo)準(zhǔn)品和重組菌發(fā)酵樣品的高分辨率一級(jí)質(zhì)譜圖,分析其分子質(zhì)量。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次平行。采用SPSS 20.0軟件,通過(guò)單因素方差分析評(píng)估差異顯著性,然后使用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,P<0.05,差異顯著,采用Origin 8.5作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 2’-FL合成通路的構(gòu)建

    由于巖藻糖價(jià)格高昂,在大腸桿菌體中通過(guò)補(bǔ)救合成2’-FL受到了制約。因此,采用應(yīng)用前景更為廣泛的從頭合成途徑合成2’-FL。將合成GDP-L-巖藻糖的基因manB、manC、gmd、fcI構(gòu)建到質(zhì)粒pETDuet-1上得到質(zhì)粒pETDuet-BCGF(圖1A),再將α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因futC構(gòu)建到質(zhì)粒pCDFDuet-1上得到質(zhì)粒pCDFDuetfutC(圖1B),之后將質(zhì)粒pETDuet-BCGF和pCDFDuet-futC共轉(zhuǎn)化到菌株BL21 Star (DE3)中得到能利用甘油和乳糖發(fā)酵生產(chǎn)2’-FL的菌株BS-3。該菌株發(fā)酵72 h后2’-FL搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生的質(zhì)量濃度為0.34 g/L。為進(jìn)一步證實(shí)菌株BS-3合成的產(chǎn)物,通過(guò)HPLC和MS對(duì)2’-FL標(biāo)準(zhǔn)品與BS-3發(fā)酵液進(jìn)行了比較。由圖2可知,BS-3發(fā)酵液中的產(chǎn)物與2’-FL標(biāo)準(zhǔn)品特征一致,說(shuō)明本研究構(gòu)建的重組菌BS-3能夠合成2’-FL。

    圖1 2’-FL生物合成質(zhì)粒pETDuet-BCGF(A)和pCDFDuet-futC(B)的構(gòu)建Fig. 1 Construction of plasmids pETDuet-BCGF (A) and pCDFDuetfutC (B) for 2’-FL biosynthesis

    圖2 2’-FL標(biāo)準(zhǔn)品和菌株BS-3發(fā)酵液的HPLC(A)和MS(B)譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms (A) and mass spectra (B) of 2’-FL standard and fermentation broth of strain BS-3

    2.2 lacZ M15和wcaJ基因敲除對(duì)大腸桿菌合成2’-FL的影響

    圖3 lacZ M15和wcaJ基因敲除后重組菌2’-FL的合成分析Fig. 3 Analysis of 2’-FL synthesis of recombinant E. coli deficient in lacZ M15 and wcaJ genes

    由圖3A可知,lacZM15未敲除片段的PCR產(chǎn)物為320 bp,而敲除該片段的PCR產(chǎn)物為227 bp,該P(yáng)CR產(chǎn)物測(cè)序鑒定堿基正確,lacZM15片段缺失的菌株BS-1(大腸桿菌BL Star (DE3)lacZΔM15)構(gòu)建成功。同理,由圖3B可知,wcaJ基因缺失的菌株BS-2(大腸桿菌BL Star (DE3)lacZΔM15ΔwcaJ)構(gòu)建成功。由圖3C可知,lacZM15和基因wcaJ被敲除后,重組菌2’-FL的產(chǎn)量明顯提高,其中BS-4發(fā)酵產(chǎn)生0.83 g/L的2’-FL;菌株BS-5的2’-FL合成能力進(jìn)一步提高,達(dá)到1.26 g/L,合成2’-FL質(zhì)量濃度是BS-3的3.71 倍。

    2.3 通路配置對(duì)大腸桿菌合成2’-FL的影響

    進(jìn)一步研究通路配置對(duì)2’-FL合成的影響,并比較了基因簇(gene cluster)形式下2’-FL的合成能力,manB-manC和gmd-fcI基因簇為大腸桿菌MG1655中的基因簇(圖4A)。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:目的基因組織成不同形式對(duì)2’-FL質(zhì)量濃度影響較大,其中BS-7菌株(操縱子形式)產(chǎn)生的2’-FL質(zhì)量濃度最高,為1.92 g/L;BS-8菌株(假操縱子形式)產(chǎn)生的2’-FL質(zhì)量濃度最低,為0.39 g/L;與BS-5菌株相比較,BS-7菌株的產(chǎn)量提高了53%(圖4B)。在這4種組織形式中,基因簇形式的基因表達(dá)強(qiáng)度適中,假操縱子形式的基因表達(dá)強(qiáng)度最高,其次是單順?lè)醋有问?,最后是操縱子形式。結(jié)果表明2’-FL的合成效率與基因表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān),即基因表達(dá)強(qiáng)度越高,2’-FL質(zhì)量濃度越低。

    圖4 不同通路配置的重組菌2’-FL的合成分析Fig. 4 Analysis of 2’-FL synthesis of recombinant E. coli with different pathway configurations

    2.4 分批補(bǔ)料發(fā)酵合成2’-FL分析

    由圖5可知,BS-7菌株分批補(bǔ)料發(fā)酵37 h時(shí),菌株生物量達(dá)到最高,DCW為37.44 g/L;同時(shí)2’-FL質(zhì)量濃度也達(dá)到了最高,為14.04 g/L,是搖瓶發(fā)酵質(zhì)量濃度的7.31 倍,2’-FL產(chǎn)率為0.59 g/(L·h),乳糖轉(zhuǎn)化率為63%(表2)。

    圖5 BS-7菌株分批補(bǔ)料發(fā)酵合成2’-FLFig. 5 2’-FL synthesis by strain BS-7 in fed-batch fermentation

    表2 BS-7菌株2’-FL的合成能力與代表性研究的比較Table 2 Comparison of 2’-FL production capacity of BS-9 with recent studies

    3 討 論

    許多研究報(bào)道采取多種調(diào)控措施提高重組大腸桿菌2’-FL的產(chǎn)量,包括增加胞內(nèi)乳糖和GDP-L-巖藻糖的可利用性,減少中間產(chǎn)物的代謝,增加關(guān)鍵酶α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá),增加胞內(nèi)GTP和NADPH輔因子的供應(yīng),調(diào)節(jié)合成通路中基因的表達(dá)水平等[9-12,27]。本研究通過(guò)在大腸桿菌中建立2’-FL從頭合成途徑,敲除乳糖和GDP-L-巖藻糖代謝的關(guān)鍵基因,并采用不同通路配置調(diào)控合成途徑基因的表達(dá)水平,成功構(gòu)建了具有一定應(yīng)用潛力的2’-FL合成菌株BS-7。

    大腸桿菌內(nèi)源性的β-半乳糖苷酶會(huì)消耗攝入的乳糖,敲除lacZ基因能提高乳糖的利用率從而增加2’-FL的合成[28]。研究表明缺失該基因功能性片段M15肽段的大腸桿菌BL21 (DE3)β-半乳糖苷酶活性降低了97%[28]。此外,合成2’-FL的供體GDP-L-巖藻糖在大腸桿菌中可用于合成莢膜異多糖酸,尿苷二磷酸-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶是該合成途徑中的第一個(gè)酶[10]。敲除lacZM15和wcaJ后,阻斷了乳糖的代謝,同時(shí)也合成了更多的GDP-L-巖藻糖,利于產(chǎn)物2’-FL的不斷積累,因此產(chǎn)生的2’-FL質(zhì)量濃度從0.34 g/L提升到1.26 g/L(圖3)。

    微生物合成天然或非天然產(chǎn)物通常涉及引入多個(gè)編碼代謝途徑酶的基因,一般情況下這些基因應(yīng)以適當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá),以避免有毒中間體的積累或生長(zhǎng)被抑制的問(wèn)題[29]。本研究中,從頭合成途徑基因組織在操縱子形式下大腸桿菌BS-7產(chǎn)生的2’-FL質(zhì)量濃度最高,而在假操縱子形式下產(chǎn)生的2’-FL質(zhì)量濃度最低,即重組菌產(chǎn)生2’-FL的質(zhì)量濃度與合成途徑中的基因表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)(圖4)。大腸桿菌中GDP-L-巖藻糖合成途徑的基因較低水平表達(dá),α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶較高水平表達(dá)能顯著增加2’-FL產(chǎn)量[12]。在操縱子形式下,通路中各基因處在較低的表達(dá)水平,GDP-L-巖藻糖合成途徑的基因表達(dá)水平與α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平能達(dá)到較為平衡的狀態(tài),因此能提高2’-FL產(chǎn)量。而在假操縱子形式和單順子形式中,各基因的表達(dá)水平顯著提高,GDP-L-巖藻糖合成途徑的基因表達(dá)水平與α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平失衡,導(dǎo)致2’-FL產(chǎn)量下降。

    提高重組菌2’-FL產(chǎn)量、使用廉價(jià)發(fā)酵原料、增加底物轉(zhuǎn)化效率是推動(dòng)2’-FL工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵點(diǎn)[5]。與補(bǔ)救途徑使用巖藻糖和乳糖作為底物相比,從頭合成途徑只需乳糖作為底物便可生產(chǎn)2’-FL,其具有更高的經(jīng)濟(jì)性[5]。甘油價(jià)格低廉,不會(huì)存在細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成過(guò)程中代謝物抑制的情況,因此甘油已被廣泛應(yīng)用于2’-FL和3-巖藻糖基乳糖的合成[30]。本研究得到的重組菌BS-7采用從頭合成途徑,使用甘油作為碳源。BS-7在10 L發(fā)酵罐中產(chǎn)生的2’-FL質(zhì)量濃度最高,為14.04 g/L(圖5),產(chǎn)率為0.59 g/(L·h),乳糖轉(zhuǎn)化率為63%(表2)。與已發(fā)表文獻(xiàn)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)BS-7的乳糖轉(zhuǎn)化率處于較高水平,產(chǎn)率也處在中等水平(表2),該菌株在工業(yè)化應(yīng)用具有較高的潛力。

    4 結(jié) 論

    基于通路配置構(gòu)建了能高效合成2′-FL的大腸桿菌重組菌BS-7,以操縱子形式表達(dá)從頭合成途徑的基因manB、manC、gmd、fuI和futC時(shí)產(chǎn)生的2′-FL質(zhì)量濃度顯著提高,其乳糖轉(zhuǎn)化率和2′-FL產(chǎn)率處于較高的水平,顯現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力,為大腸桿菌高產(chǎn)2′-FL微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建和生物合成提供一定理論依據(jù)。

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