黃賽賽, 趙 成, 梁 軍, 盧先艷, 王世穎
(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院, 1. 風(fēng)濕免疫科, 2. 婦產(chǎn)科, 江蘇 南京, 210008)
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以慢性滑膜增生和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征的全身性自身免疫病[1]。RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,遺傳易感因素和環(huán)境因素之間的相互作用是疾病發(fā)生所必需的。目前比較明確與RA發(fā)生相關(guān)的環(huán)境因素包括吸煙和感染[2], 但感染如何導(dǎo)致疾病發(fā)生的機(jī)制尚不清楚。研究[3]發(fā)現(xiàn),胞外誘捕網(wǎng)(ETs)形成似乎也是RA的可能發(fā)病機(jī)制。
RA滑膜中存在多種慢性炎癥細(xì)胞浸潤,巨噬細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLSs)是RA滑膜中最豐富的細(xì)胞類型?;罨木奘杉?xì)胞通過與炎癥微環(huán)境的相互作用,在炎癥的發(fā)展中起重要作用。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)在病原微生物所致的感染性疾病和免疫性疾病中的作用機(jī)制逐漸被闡明[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞同樣可形成巨噬細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(METs), 由于RA滑膜中存在大量的巨噬細(xì)胞,而中性粒細(xì)胞較為少見,本研究推測METs形成及其與FLSs的相互作用在RA發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用。本研究探討巨噬細(xì)胞大量形成METs參與RA發(fā)病的機(jī)制,為進(jìn)一步闡明RA發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。
THP-1細(xì)胞(武漢普諾賽, CL-0233)、人FLSs(ATCC細(xì)胞庫)、佛波酯(Sigma, PMA 16561-29-8)、脂多糖(LPS, SIGMA)、干擾素γ(IFN-γ, Solarbio, P00028)、F4/80大鼠抗人(Abcam, ab16911)、MPO兔抗人(Proteintech, 22225-1-AP)、NE小鼠抗人(Abcam, ab254178)、AF488-驢抗大鼠(Abcam, ab102260)、AF594-山羊抗兔(Abcam, ab150080)、AF647-山羊抗小鼠(Abcam, ab150115)、AF488-山羊抗兔(Abcam, ab150077)、Ni-IDA-Beadose Resin Kit試劑盒(百奧萊博, Ni-IDA-Beadose Resin Kit, GS4622)、C29(MCE, HY-100461)、IAXO-102(MCE, HY-125171)、Cell Counting Kit-8(Dojindo)、細(xì)胞遷移和侵襲試劑盒(Millipore)、抗NE(Abcam, ab254178)、抗MPO(Proteintech, 22225-1-AP)、抗GAPDH(Abcam, ab9485)、IL-6(EK-Bioscience, EK-H10352)、MMP-1(MultiSciences, 70-EK1M01-96)、MMP-3(Sino Biological, SEK10467)、MMP-13(Sigma-Aldrich, RAB0364)。
THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素+1%鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃, 5%CO2, 每隔3~4 d進(jìn)行傳代。傳代的THP-1單核細(xì)胞放入含有10% 熱滅活胎牛血清和10 U/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),維持細(xì)胞數(shù)1×108/培養(yǎng)瓶左右。將培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞稀釋成1×106/mL, 接種于35 mm培養(yǎng)皿中,于含100 ng/mL佛波酯、0.3% 牛血清白蛋白(BSA)的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h誘導(dǎo)分化。通過光鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并采用熒光顯微鏡對誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行熒光鑒定。
采用5 μg/mL LPS和10 μmol/L IFN-γ分別處理巨噬細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h時(shí)后,去除培養(yǎng)液,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,每次30 s, 然后每個(gè)孔加入Sytox(1∶10 000)進(jìn)行染色,免疫熒光染色法檢測METs的產(chǎn)生,并對其進(jìn)行半定量分析。
巨噬細(xì)胞進(jìn)行爬片培養(yǎng),采用5 μg/mL LPS和10 μmol/L IFN-γ分別處理巨噬細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h, PBS清洗1次, 4%多聚甲醛固定, 0.25%Triton X-100透膜20 min, 3%牛血清白蛋白(BSA)清洗3次,每次10 min, 然后10%山羊血清封閉1 h, 加入一抗混合液, 4 ℃孵育過夜。3% BSA清洗3次,每次10 min, 滴加熒光二抗混合液,避光孵育2 h。DAPI染核10 min, 3%BSA清洗3次,每次10 min, 抗熒光猝滅劑封片,熒光顯微鏡觀察并拍照。
采用5 μg/mL LPS處理巨噬細(xì)胞細(xì)胞,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。12 h后,去除培養(yǎng)液,然后使用PBS清洗3次,每次1 min。按照Ni-IDA-Beadose Resin Kit試劑盒操作步驟來進(jìn)行蛋白組分純化,并用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。
將人FLSs接種至培養(yǎng)皿中, 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)到細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上,用濃度為0.25%胰蛋白酶消化2 min, 消化過程每隔30 s吹打1次; 用含10% FBS的DMEM制備細(xì)胞懸液(1×106/mL), 加至培養(yǎng)板,每孔100 mL, 置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。采用METs蛋白組分以及Toll樣受體(TLR)抑制劑進(jìn)行干預(yù), METs蛋白組分的濃度為5 μg/mL: TLR2抑制劑C29的工作濃度為5 μmol/mL; TLR4抑制劑IAXO-102的工作濃度為10 μmol/mL; PBS作為空白對照。以上抑制劑單用或者聯(lián)用對滑膜細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理12 h, 然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
將人FLSs細(xì)胞系分為對照組、METs組、C29組、IAXO-102和C29+IAXO-102聯(lián)合干預(yù)組,除對照組外,其余組均將純化的METs蛋白組分加入FLSs培養(yǎng)液中, C29組同時(shí)加入TLR2抑制劑C29, IAXO-102組加入TLR4抑制劑IAXO-102, 聯(lián)合干預(yù)組同時(shí)加入C29和IAXO-102。
取FLSs滑膜細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室,進(jìn)行培養(yǎng), 12 h后加入不同的刺激物進(jìn)行干預(yù),繼續(xù)再培養(yǎng)12 h。收集細(xì)胞,使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8)測定細(xì)胞活力; 細(xì)胞遷移和侵襲試劑盒檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。
制備細(xì)胞懸液,加入適量蛋白裂解液[RIPA 蛋白裂解液1 mL + 磷酸酶/蛋白酶抑制劑10 μL+苯甲磺酰氟(PMSF)10 μL], 置于冰上,于搖床上裂解30 min, 離心去蛋白上清,BCA法測蛋白濃度,加熱使蛋白變性。向聚丙烯酸凝膠每孔中加入20~30 μg的蛋白樣品,經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上,封閉洗滌后,加入一抗4 ℃孵育過夜,洗膜緩沖液(TBST)清洗3次,每次10 min, 然后室溫下二抗孵育2 h, 最后TBST清洗3次,每次10 min。使用Syngene G: BOX 凝膠成像系統(tǒng),曝光拍照。
表達(dá)
分別收集對照組、METs組、C29組、IAXO-102和C29+IAXO-102聯(lián)合干預(yù)組的培養(yǎng)液上清,根據(jù)制造商的說明,用ELISA試劑盒測量白細(xì)胞介素6(IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)的水平。所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均使用酶標(biāo)儀(SpectraMax M5, Molecular Devices)在 450/505 nm波長下進(jìn)行測量。
1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 2組正態(tài)分布資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
采用佛波酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞成巨噬細(xì)胞,通過光鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并采用熒光顯微鏡對誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行熒光鑒定(圖1), 藍(lán)色的DAPI為細(xì)胞核,綠色的F4/80為巨噬細(xì)胞標(biāo)記物。
A: THP-1單核細(xì)胞系被誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞的明場圖像; B: THP-1單核細(xì)胞系被誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞的熒光鑒定,藍(lán)色的DAPI為細(xì)胞核,綠色的F4/80為巨噬細(xì)胞標(biāo)記物,標(biāo)尺為100 μm。圖1 THP-1細(xì)胞系誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞
分別使用LPS和IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生METs, Sytox標(biāo)記外泄的DNA水平,Western blot和免疫熒光法檢測METs主要蛋白成分彈性蛋白酶(NE)和髓過氧化物酶(MPO), 結(jié)果提示LPS誘導(dǎo)METs能力顯著強(qiáng)于IFN-γ(P<0.05), 外泄DNA采用綠色的Sytox標(biāo)記,藍(lán)色的DAPI為細(xì)胞核,綠色的為MPO, 紅色為NE, 見圖2。
A: LPS與IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生METs蛋白組分NE與MPO的能力; B: LPS與IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生METs蛋白組分外泄的DNA能力的代表性圖像,外泄DNA采用綠色的Sytox標(biāo)記,標(biāo)尺為100 μm; C: LPS與IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生METs蛋白組分彈性蛋白酶(NE)與髓過氧化物酶(MPO)能力的熒光代表性圖像; 藍(lán)色的DAPI為細(xì)胞核,綠色的為MPO, 紅色為NE, 標(biāo)尺為100 μm。與LPS誘導(dǎo)METs比較, *P<0.05, **P<0.01。圖2 LPS、IFN-γ誘導(dǎo)METs的形成能力
用METs蛋白組分刺激FLSs 24 h, 檢測FLSs細(xì)胞活力,結(jié)果顯示與對照組相比, METs蛋白顯著增強(qiáng)FLSs的活力、FLSs的遷移和侵襲能力(P<0.05); 同時(shí)上清中細(xì)胞因子IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13水平顯著升高(P<0.05)。與METs組相比,采用TLR2抑制劑(C29)和TLR4抑制劑(IAXO-102)單用或聯(lián)用干預(yù)后FLSs的活力下降,細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱(P<0.05), 聯(lián)合干預(yù)組上清中IL-6[對照組: (26.03±4.99) pg/mL; METs組: (337.80±67.34) pg/mL; C29組: (183.80±11.73) pg/mL; IAXO-102組: (78.85±8.02) pg/mL; C29+IAXO-102聯(lián)合干預(yù)組: (82.30±11.05) pg/mL]、MMP-1[對照組: (234.90±31.40) pg/mL; METs組: (3 404.00±678.70) pg/mL; C29組: (1 750.00±191.00) pg/mL; IAXO-102 組: (766.50±85.14) pg/mL; C29+IAXO-102聯(lián)合干預(yù)組: (790.50±134.60) pg/mL)]、MMP-3[對照組: (18.44±4.88) pg/mL; METs組: (151.60±21.49) pg/mL; C29組: (115.80±9.76) pg/mL; IAXO-102組: (94.27±16.86) pg/mL; C29+IAXO-102 聯(lián)合干預(yù)組: (97.04±11.50) pg/mL]和MMP-13[對照組: (118.40±20.87) pg/mL; METs組: (836.40±105.20) pg/mL; C29 組: (587.70±90.57) pg/mL; IAXO-102組: (396.20±80.91) pg/mL; C29+IAXO-102聯(lián)合干預(yù)組: (327.20±60.74) pg/mL]水平下降(P<0.05), 且IAXO-102組抑制能力強(qiáng)于C29組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖3。
A: CCK-8檢測各組FLSs細(xì)胞的活力; B: 不同處理?xiàng)l件下的FLSs遷移能力結(jié)晶紫染色代表性圖像,標(biāo)尺為100 μm; C: 不同處理?xiàng)l件下的FLSs侵襲能力結(jié)晶紫染色代表性圖像,標(biāo)尺為100 μm; D: ELISA檢測各組FLSs培養(yǎng)上清細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13的水平; 與METs單用比較, C29和IAXO-102單用或聯(lián)用干預(yù)后FLSs的活力下降,細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱,上清IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13水平增高; 與C29組比較, IAXO-102組抑制能力更強(qiáng), *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。 圖3 METs通過TLR2和TLR4促進(jìn)FLSs活化
NETs 組成成分復(fù)雜,其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中附著多種參與炎癥反應(yīng)的蛋白[6]。RA患者外周血和滑液中NETs的形成數(shù)量顯著高于健康人群,且NETs數(shù)量與炎癥指標(biāo)如血沉、C反應(yīng)蛋白以及RA標(biāo)志性自身抗體抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)水平均存在顯著正相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也證實(shí)由瓜氨酸化蛋白介導(dǎo)生成的NETs可以作用于滑膜FLSs, 促進(jìn)FLSs分泌炎性細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等,從而擴(kuò)大RA的炎癥反應(yīng)。研究[7]發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞同樣可形成METs。METs與NETs具有相似的特征,由DNA纖維和組蛋白等細(xì)胞蛋白組成。目前研究[8]發(fā)現(xiàn),細(xì)菌、病毒等病原微生物以及M1型巨噬細(xì)胞等均可導(dǎo)致METs形成增多。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn), RA滑膜巨噬細(xì)胞較正常人明顯增多,增多的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量METs,提示其可能參與RA發(fā)病,但具體機(jī)制尚不清楚。
滑膜是RA炎癥發(fā)生的主要場所,高度活化的滑膜巨噬細(xì)胞能夠通過與FLSs相互作用分泌介質(zhì),促進(jìn)滑膜炎的持續(xù)和細(xì)胞外基質(zhì)的破壞?;ぞ奘杉?xì)胞能產(chǎn)生致炎細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-6等][9]、趨化因子[趨化因子2(CCL-2)、趨化因子3(CCL-3)、趨化因子5(CCL-5)、趨化因子8(CXCL-8)和趨化因子1(CXCL-1)][10]和生長因子,而活化的FLSs是RA患者IL-6和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的主要來源。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn), RA滑膜存在METs過度形成的現(xiàn)象。METs的成分較為復(fù)雜,主要由DNA組成的胞外纖維和蛋白組分構(gòu)成。將純化的METs蛋白組分加入FLSs培養(yǎng)液中,結(jié)果發(fā)現(xiàn), METs中的蛋白組分可以增強(qiáng)FLSs的活力,促進(jìn)FLSs分泌IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13, 并增強(qiáng)FLSs的遷移和侵襲能力,提示METs蛋白參與FLSs的激活,但其具體機(jī)制尚未明確。
TLRs是一類重要的模式識(shí)別受體,可識(shí)別微生物感染的存在,激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)。同時(shí), TLRs識(shí)別一些宿主衍生分子降解產(chǎn)物,即損傷相關(guān)模式分子(DAMPS), 主要包括細(xì)胞壞死后釋放的細(xì)胞內(nèi)分子和細(xì)胞外基質(zhì)分子等[11]。TLR2和TLR4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維細(xì)胞(FLSs)活化過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)菌肽聚糖(PGs)通過TLR2促進(jìn)FLSs中MMP-1、MMP-3、MMP-13、IL-6和IL-8的表達(dá)[12]。TLR4在氧化劑刺激下,誘導(dǎo)FLSs增殖,導(dǎo)致高遷移率蛋白酶1(HMGB1)和其他炎癥因子釋放[13]。此外, TLR2表達(dá)增加,可上調(diào)磷脂酶A2(PLA2)的磷酸化水平,促進(jìn)花生四烯酸(AA)的釋放、前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生和FLSs中促炎因子的表達(dá),參與RA炎癥過程[14]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),純化的METs蛋白可以激活FLSs, 在培養(yǎng)體系中單獨(dú)或同時(shí)加入TLR2、TLR4抑制物, FLSs活化能力顯著減弱,且TLR4抑制物(IAXO-102)作用顯著強(qiáng)于TLR2抑制物(C29), 提示METs蛋白作為損傷相關(guān)模式分子活化TLR4, 活化的TLR4進(jìn)一步激活FLSs, 進(jìn)而參與RA發(fā)病。
本研究探討了巨噬細(xì)胞除增殖、極化參與RA炎癥外,還可通過形成METs激活FLSs, 進(jìn)而參與RA發(fā)病。本研究以期為進(jìn)一步闡明RA發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。