附睪血管內(nèi)皮生長因子基因慢病毒干擾載體的構(gòu)建

戴研平 王 平 高曉勤

（1 岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，岳陽 414000；2 遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遵義 563006）

抗腫瘤血管生成基因治療是目前腫瘤治療的熱點(diǎn)之一[1-2]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化的首要因子，在血管生成過程中起關(guān)鍵作用。以VEGF/VEGFR2為靶點(diǎn)的腫瘤血管生成抑制劑研究較為廣泛，由于RNA干擾（RNA interference，RNAi）具有高效性、特異性、穩(wěn)定性和安全性等優(yōu)點(diǎn)，目前利用高效基因抑制工具-RNA干擾技術(shù)阻斷VEGF/VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為當(dāng)今抗腫瘤基因治療的研究重點(diǎn)[3]。這些藥物在惡性腫瘤治療中能有效地延長患者的無進(jìn)展生存率以及總生存期，并已被批準(zhǔn)用于多種實(shí)體腫瘤如結(jié)直腸癌、肺癌（非小細(xì)胞肺癌）、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌和腎癌等的治療[4-12]，但其在男性生殖系統(tǒng)的相關(guān)研究較少。本研究構(gòu)建VEGF的慢病毒shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠附睪，研究轉(zhuǎn)染后VEGF的表達(dá)。通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)篩選能明顯降低附睪VEGF表達(dá)水平的RNA干擾載體，為進(jìn)一步研究由慢性砷中毒引起男性不育的分子機(jī)制提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑

PM7.1（上海生物過程股份有限公司）；Taq酶和dNTP（TaKaRa公司）；T4 DNA ligase（Fermentas 公司）；Annealing Buffer for DNA Oligos（5X） （碧云天（D0251） 公司）；AgeI-HF（NEB（R3552L）公司）；EcoRI-HF（NEB（ R3101L） 公司）；DH5a感受態(tài)細(xì)胞 、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DL 2 000 DNA Marker（TaKaRa公司）；小抽試劑盒（Promega公 司）；DNA ladder marker （Fermentas 公司）；引物合成和陽性克隆質(zhì)粒測序（上海生物工程股份有限公司）；293T 人胚腎細(xì)胞（本課題組保存）；青霉素-鏈霉素、胰酶、無鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（GIBCO公司）。

1.2 VEGF-shRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及慢病毒載體構(gòu)建

根據(jù)基因庫報(bào)道的大鼠附睪特異VEGF基因序列（NCBI登錄號：NM_031836.3）和RNAi靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)原則，篩選出3個(gè)VEGF的干擾靶點(diǎn)，同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)陰性對照。引物均由上海生物工程有限公司合作完成。DNA合成片段如下：shRNA-1GCAGCTATTGCCGTCCAATTGCTCGAGCAATTGGAC GGCAATAGCTGCTTTTTTG；shRNA-2 CCGGGC GGATCAAACCTCACCAAAGCTCGAGCTTTGGT GAGGTTTGATCCGCTTTTTTG；shRNA-3 CCGG GCCAGCACATAGGAGAGATGACTCGAGTCATC TCTCCTATGTGCTGGCTTTTTTG。

引物退火形成帶粘性末端的雙鏈后將干擾片段連接入表達(dá)載體，于16 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化后進(jìn)行陽性克隆的鑒定，PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，10 ℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)。PCR陽性克隆測序由上海生物工程有限公司合作完成，并進(jìn)行測序結(jié)果分析。

1.3 慢病毒載體的包裝、濃縮和滴度測定

根據(jù)天根質(zhì)粒小提試劑盒的操作方法進(jìn)行質(zhì)粒的抽提及慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定。采用超速離心沉淀法進(jìn)行慢病毒的濃縮與純化；采用定量PCR法進(jìn)行病毒滴度的測定，通過計(jì)算得出重組慢病毒的滴度為6.72×108、8.10×108、8.62×108TU/L。

1.4 慢病毒載體感染大鼠附睪組織

將健康清潔級雄性SD大鼠用水合氯醛麻醉后分為空白對照組、NC-shRNA陰性感染組、VEGFshRNA-1感染組、VEGF-shRNA-2感染組、VEGFshRNA-3感染組。常規(guī)消毒鋪手術(shù)巾單，暴露雙側(cè)大鼠附睪處皮膚，仔細(xì)解剖暴露附睪，將200 μL病毒液（本實(shí)驗(yàn)干擾慢病毒未攜帶熒光標(biāo)記）分別注射到各組大鼠雙側(cè)附睪。每組隨機(jī)選取大鼠3只進(jìn)行處理，手術(shù)完畢后每只大鼠肌肉注射青霉素8萬單位抗炎，并在無菌動(dòng)物房飼養(yǎng)14 d。14 d后麻醉大鼠，無菌剝離雙側(cè)附睪組織進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RT-qPCR檢測各組睪丸組織VEGF mRNA的表達(dá)

TRIzol法 提 取RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。內(nèi)參基因β-actin正向引物序列為5'-AGCGAGCA- TCCCCCAAAGTT-3'，反向引物序列為5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'；VEGF正向引物序列為5'-GAGCAACGTCACTATGCAGATC-3'；反 向引物序列為5'-TTTCTCCGCTCTGAACAAGG-3'。PCR反應(yīng)條件如下：25 ℃ 孵育10 min；cDNA合成 50 ℃ 30 min；終止反應(yīng)85 ℃ 5 min，置于冰上。將上述溶液-20 ℃保存。將cDNA樣品稀釋10倍作為模板上機(jī)檢測。反應(yīng)體系總體積20 μL，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算相對表達(dá)量。

1.6 免疫印跡檢測各組VEGF蛋白的表達(dá)

取附睪組織碾磨成粉末狀，使用RIPA裂解液裂解組織，抽提總蛋白。采用BCA試劑盒定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測VEGF表達(dá)水平。VEGF兔抗鼠多克隆工作濃度為1∶1 000，二抗工作濃度為1∶5 000，ECL發(fā)光、曝光、顯影2 min，定影。應(yīng)用Bio-Rad公司的全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，以目的條帶與內(nèi)參（β-actin）條帶的灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示。兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和方差齊性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果

慢病毒包裝后感染 293 T 細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察可見熒光表達(dá)，且表達(dá)情況良好（圖1）。

圖1 各組大鼠慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染圖片

2.2 VEGF-shRNA重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果

將PCR陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序，結(jié)果與預(yù)期序列一致，表明合成的VEGF-shRNA寡聚核苷酸序列插入正確，證明DNA重組成功。

2.3 慢病毒干擾大鼠附睪VEGF對VEGF mRNA表達(dá)的影響

各組重組慢病毒顆粒感染大鼠附睪組織后，與空白對照組比較，NC-shRNA陰性感染組的VEGF mRNA表達(dá)水平差異無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意義（P＞0.05），VEGF-shRNA-1、2、3感 染 組VEGF mRNA表 達(dá)水平均低于對照組及NC-shRNA陰性感染組（P＜ 0.05），其中以VEGF-shRNA-3感染組下降最顯著（P＜0.05）（圖2）。

圖 3 VEGF-shRNA感染大鼠附睪組織對VEGF mRNA表達(dá)的影響

2.4 慢病毒干擾大鼠附睪VEGF對VEGF蛋白表達(dá)的影響

各組重組慢病毒顆粒感染大鼠附睪組織后，與空白對照組相比，NC-shRNA陰性感染組的VEGF蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），VEGFshRNA-1、2、3感染組VEGF的蛋白表達(dá)水平均低于正常對照組及NC-shRNA陰性感染組，其中以VEGF-shRNA-3組下降最顯著（P＜0.05）（圖4）。

圖 4 VEGF-shRNA感染大鼠附睪組織對VEGF蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前最常用的RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)的手段主要有以下幾種： RNA干擾片段的直接轉(zhuǎn)染、通過介導(dǎo)質(zhì)粒、慢病毒作為載體的RNAi?；虺聊葱「蓴_RNA（small interference RNA，siRNA）通過堿基互補(bǔ)原則識別靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，與siRNA和Dicer形成的復(fù)合體結(jié)合，經(jīng)過換位、Dicer的切割，導(dǎo)致由特定目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA功能沉默，并產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)[11-13]。RNAi通過dsRNA啟動(dòng)，經(jīng)過同源mRNA的降解，特異性地阻斷目的基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)基因沉默，由于其具有干擾范圍廣、高效的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被作為一種基因功能研究的有效工具并廣泛應(yīng)用于腫瘤治療方面[14]。

眾所周知，附睪功能的異常會(huì)影響精子的成熟，導(dǎo)致男性不育。而VEGF和VEGFR2參與了精子的發(fā)生和成熟[15-16]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性砷中毒不同劑量組大鼠VEGF及其受體2的mRNA及蛋白表達(dá)具有差異[17]。為明確VEGF對慢性砷中毒大鼠雄性生殖能力影響的具體機(jī)制，本研究利用RNAi構(gòu)建大鼠附睪VEGF的慢病毒shRNA表達(dá)載體并進(jìn)行包裝，將通過驗(yàn)證的高滴度病毒感染大鼠附睪組織后觀察其沉默效果。PCR陽性克隆質(zhì)粒DNA測序結(jié)果與預(yù)期序列一致，證明DNA重組成功，即成功構(gòu)建了VEGF-shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒。RT-qPCR及免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，NC-shRNA陰性感染組的VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)水平無明顯差異，VEGF-shRNA-1、2、3感染組VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于對照組及NC-shRNA陰性感染組，其中以VEGFshRNA-3 組干擾效果最明顯，對VEGF的表達(dá)有很好的抑制作用，筆者將篩選出沉默效果最佳的表達(dá)質(zhì)粒VEGF-shRNA-3進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)研究。

總之，本研究成功建立了3種VEGF基因的RNA干擾靶點(diǎn)的慢病毒載體，通過陽性克隆質(zhì)粒測序和免疫印跡方法證實(shí)，VEGF基因的沉默效果明顯，為下一步研究VEGF基因?yàn)榘悬c(diǎn)的RNAi技術(shù)治療男性不育奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。