RAD51相關(guān)蛋白1在宮頸癌組織中的表達及通過TGF-β/Smad 通路 參與調(diào)控人宮頸癌細胞的增殖和凋亡*

梁殿迅 王秋宇 姜 平 李和麗 朱軍義 許 靜 郭 哲 孫慧霞

（南陽市中心醫(yī)院，南陽 473000）

宮頸癌是婦女常見惡性腫瘤，晚期患者生存率仍然很低，因此，尋找新的治療靶點對宮頸癌的治療具有重要意義[1-2]。RAD51相關(guān)蛋白1（RAD51-associated protein 1，RAD51AP1）是一種能激活同源重組蛋白RAD51的DNA結(jié)合蛋白，可調(diào)控腫瘤細胞增殖與DNA修復(fù)[3]。研究顯示[4]，RAD51AP1在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中上調(diào)表達，沉默RAD51AP1可抑制NSCLC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）/SMAD通路在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要調(diào)控作用，TGF-β/Smad 通路的激活可促進宮頸癌細胞的增殖與遷移[5]。本研究探討RAD51AP1對SiHa細胞增殖及TGF-β/Smad 通路的影響，初步探索RAD51AP1對SiHa細胞的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞與試劑

人正常宮頸上皮細胞（HUCEC）及宮頸癌Caski、Hela、C-33A、SiHa細胞系購自美國ATCC公司；人重組TGF-β1（規(guī)格1 mg）購自 HUICH公司；LY2109761（純度≥99%）購自Aladdin公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、DMEM培養(yǎng)液和胰酶購自美國Invitorgen公司；噻唑藍（MTT）試劑盒購自美國Sigma公司；RAD51AP1、TGF-β1及內(nèi)參GAPDH引物由上海生工生物工程科技有限公司設(shè)計與合成；抑制RAD51AP1表達（si-RAD51AP1）及其陰性對照（si-NC）質(zhì)粒由廣州銳博生物有限公司構(gòu)建；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人RAD51AP1、TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3、cyclin D1、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3抗體購自英國Abcam公司。

1.2 標(biāo)本來源

選 取2018年7月至2021年3月間河南省南陽市中心醫(yī)院手術(shù)治療的51例宮頸癌患者為研究對象，年齡37~75歲，平均年齡（49.50±9.20）歲。手術(shù)過程中取宮頸癌組織及相應(yīng)癌旁組織。51例患者中32例為鱗狀細胞癌，19例為腺癌。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測宮頸癌組織與癌旁組織RAD51AP1蛋白表達

宮頸癌組織與癌旁組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋后切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟，0.01 mol/L枸緣酸緩沖液抗原修復(fù)和封閉后，加入兔抗人RAD51AP1多克隆抗體（1∶500），室溫孵育4 h，再加入相應(yīng)二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，DAB染色，顯微鏡觀察。染色結(jié)果判斷：RAD51AP1主要定位于細胞核，根據(jù)陽性細胞數(shù)和染色強度進行評分。陽性細胞率＜5%、5%~25%、26%~50%、51%~75%、＞75%，分別記為0、1、2、3、4分；根據(jù)細胞染色強度，棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無染色為0分。將兩項評分相乘：得分為0或1分為陰性（-），2~3分為弱陽性（+），4~6分為中陽性（++），6分以上為強陽性（+++）。

1.4 免疫印跡檢測宮頸癌細胞RAD51AP1蛋白表達及細胞分組

宮頸癌Caski、Hela、C-33A、SiHa細胞與人正常宮頸上皮細胞（HUCEC）接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后，提取細胞總蛋白，免疫印跡檢測細胞中RAD51AP1蛋白表達，篩選RAD51AP1高表達宮頸癌細胞系。

收集對數(shù)生長期細胞，將SiHa細胞分為對照組、si-RAD51AP1組、si-NC組、抑制劑組、si-RAD51AP1+激活劑組，si-RAD51AP1組。si-NC組使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染si-RAD51AP1、si-NC質(zhì)粒，抑制劑組使用10 μmol/L的LY2109761處 理24 h，si-RAD51AP1+激 活 劑組轉(zhuǎn)染si-RAD51AP1質(zhì)粒同時使用10 ng/mL的人重組TGFβ1處理24 h。TGF-β/Smad通路抑制劑LY2109761與激活劑人重組TGFβ1濃度參照文獻[6]中所用濃度。

1.5 MTT法檢測細胞增殖活性

各組處理的SiHa細胞以每孔5×104個細胞接種于96孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，反應(yīng)4 h后，DMSO溶液終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀波長490 nm處測定各孔光密度（OD）值，繪制細胞生長曲線。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

各組處理的SiHa細胞培養(yǎng)48 h后，調(diào)整細胞濃度為4×105/mL，加 入200 μL的binding buffer重懸細胞，分別加入5 μL的Annexin V-FITC與10 μL的PI混勻，避光孵育20 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 平板克隆形成實驗檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的各組SiHa細胞，制備細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2~3 d觀察細胞形態(tài)，待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。多聚甲醛溶液固定20 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，計算克隆形成率。

1.8 實時熒光定量PCR法檢測細胞RAD51AP1及TGF-β1 mRNA水平

采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中RAD51AP1、TGF-β1 mRNA相對表達量。TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RAD51AP1上游引物序列為5'-ATGACAAGCTCTACCAGAGAGAC-3'，下游引物序列為5'-CACATTAGTGGTGACTGTTGGAA- 3'；TGF-β1上游引物序列為5'-CTGCAAGACTATC GACATGG-3'，下游引物序列為5'-AATGGTGGAA ACCCACAACG-3'；GAPDH上游引物序列為5'-AA TGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游引物序列為5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法 計 算RAD51AP1、TGF-β1 mRNA相對表達量。

1.9 免疫印跡檢測細胞中RAD51AP1蛋白、TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白及增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達

提取各組SiHa細胞總蛋白，取適量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用含5% BSA的TBST緩沖液封閉1 h，分別加入稀釋后的兔抗人RAD51AP1、TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3、cyclin D1、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3和β-actin抗體，4℃孵育過夜加入二抗，4℃孵育6 h，ECL液顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析各蛋白相對表達量。

1.1 0 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAD51AP1蛋白在宮頸癌組織與癌旁組織的表達

免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示，RAD51AP1主要定位于宮頸癌組織中的細胞核，癌旁組織陽性率為25.49%，宮頸癌組織中陽性率為72.55%，宮頸癌組織的陽性率顯著高于癌旁組織（P＜0.05）（圖1，表1）。

圖1 RAD51AP1蛋白在癌旁組織（A）與宮頸癌組織（B）的表達，×200。 標(biāo)尺=50 μm

表1 RAD51AP1蛋白在宮頸癌組織與癌旁組織的表達（n=51）

2.2 RAD51AP1蛋白在宮頸癌細胞系中的表達

與HUCEC細胞（0.21±0.03）比較，Caski（0.72±0.05）、Hela（0.93±0.08）、C-33A（0.88±0.06）、SiHa（1.09±0.12）4種宮頸癌細胞系中RAD51AP1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），其中SiHa細胞中RAD51AP1蛋白表達水平最高，故選擇SiHa細胞系進行后續(xù)實驗（圖2）。

圖2 RAD51AP1在宮頸癌細胞系中的表達

2.3 RAD51AP1對宮頸癌細胞增殖與凋亡的影響

與對照組比較，si-RAD51AP1組與抑制劑組細胞增殖活性與cyclin D1蛋白表達水平顯著降低，細胞凋亡率、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與si-RAD51AP1組比較，si-RAD51AP1+激活劑組細胞增殖活性與cyclin D1蛋白表達水平顯著升高，細胞凋亡率、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），表明抑制RAD51AP1的表達或使用TGF-β/Smad 通路抑制劑LY2109761均可顯著抑制SiHa細胞增殖、促進細胞凋亡，而使用si-RAD51AP1和TGF-β/Smad 通路激活劑共同處理細胞可部分逆轉(zhuǎn)以上變化（圖3~5，表2）。

圖3 各組SiHa細胞增殖活性檢測結(jié)果

圖4 RAD51AP1對SiHa細胞cyclin D1、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3蛋白表達的影響

表2 RAD51AP1對SiHa細胞增殖及凋亡的影響（n=6，±s）

表2 RAD51AP1對SiHa細胞增殖及凋亡的影響（n=6，±s）

*P＜0.05 vs對照組；△P＜0.05 vs si-NC組；#P＜0.05 vs si-RAD51AP1組

組別 凋亡率（%） Cyclin D1 Bax Caspase-3 Cleaved caspase 3 RAD51AP1對照組 4.05±0.87 1.03±0.12 0.33±0.03 0.43±0.04 0.21±0.03 1.05±0.12 si-NC組 3.67±0.82 1.01±0.13 0.34±0.04 0.45±0.06 0.23±0.04 1.07±0.11 si-RAD51AP1組 25.31±2.43*△ 0.41±0.05*△ 0.98±0.10*△ 1.04±0.13*△ 0.85±0.10*△ 0.31±0.04*△抑制劑組 28.33±3.06* 0.35±0.04* 1.05±0.11* 1.00±0.12* 0.81±0.08* 1.03±0.11 si-RAD51AP1+激活劑組 11.54±2.04# 0.91±0.09# 0.57±0.06# 0.65±0.08# 0.51±0.05# 0.34±0.03

2.4 RAD51AP1對SiHa細胞克隆形成能力的影響

與對照組[（57.26±4.36）%]比較，si-RAD51AP1組[（32.42±3.79）%]與抑制劑組[（30.50±3.21）%]細 胞 克 隆 形 成 率 顯 著降低（P＜0.05）；與si-RAD51AP1組比較，si-RAD51AP1+激活劑組[（45.41±4.05）%]細胞克隆形成率顯著升高（P＜0.05）（圖6）。

圖6 各組SiHa細胞克隆形成圖

2.5 RAD51AP1對SiHa細胞中TGF-β/Smad通路的影響

與對照組比較，si-RAD51AP1組與抑制劑組細胞TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋 白 表 達水平顯著降低（P＜0.05）；與si-RAD51AP1組比較，si-RAD51AP1+激活劑組細胞TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），表明RAD51AP1可調(diào)控TGF-β/Smad 通路蛋白（圖7，表3）。

圖7 RAD51AP1對SiHa細胞TGF-β1、p-SMAD2、 p-SMAD3蛋白表達的影響

3 討論

RAD51AP1是DNA同源重組修復(fù)的關(guān)鍵蛋白，已有研究報道，RAD51AP1在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中異常表達[7-8]。Zhao等[9]研究表明，卵巢癌中RAD51AP1上調(diào)表達，與卵巢癌分期高和患者預(yù)后不良有關(guān)，在體外下調(diào)RAD51AP1表達可抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，RAD51AP1在宮頸癌組織與細胞系中表達上調(diào)，提示RAD51AP1與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。研究顯示[10]，RAD51AP1基因在管腔雌激素受體陽性乳腺癌和三陰性乳腺癌中表達上調(diào)，與預(yù)后不良有關(guān)。在乳腺癌基因工程小鼠模型中，敲除RAD51AP1基因可減少腫瘤生長和相關(guān)肺轉(zhuǎn)移，表明抑制RAD51AP1表達可抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。另外，還有研究表明，結(jié)直腸癌中RAD51AP1表達上調(diào)，可通過調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌干細胞（CRCSC）自我更新促進腫瘤生長與化療耐藥性[11]。本研究結(jié)果顯示，抑制RAD51AP1表達后，細胞增殖活性、細胞克隆形成率與cyclin D1蛋白表達水平顯著降低，細胞凋亡率、Bax、caspase-3蛋白表達水平顯著升高，表明抑制RAD51AP1表達可抑制SiHa細胞增殖，促進細胞凋亡，但RAD51AP1對SiHa細胞的作用機制尚不清楚。

表3 RAD51AP1對SiHa細胞TGF-β/Smad 通路蛋白表達的影響（n=6，±s）

表3 RAD51AP1對SiHa細胞TGF-β/Smad 通路蛋白表達的影響（n=6，±s）

*P＜0.05 vs對照組；△P＜0.05 vs si-NC組；#P＜0.05 vs si-RAD51AP1組

組別 TGF-β1 p-SMAD2 p-SMAD3對照組 0.98±0.11 1.01±0.10 0.95±0.09 si-NC組 1.00±0.13 1.05±0.11 0.97±0.10 si-RAD51AP1組 0.31±0.04*△ 0.37±0.05*△ 0.40±0.06*△抑制劑組 0.27±0.03* 0.35±0.04* 0.43±0.05*si-RAD51AP1+激活劑組 0.93±0.10# 0.85±0.08# 0.90±0.09#

TGF-β信號通路在調(diào)控腫瘤的生長中發(fā)揮重要作用，也與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)。TGF-β有多種亞型，其中人TGF-β1定位于染色體19q3，可誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸、促進血管生成和EMT。Smads蛋白是TGF-β的直接作用底物，其中Smad2/3介導(dǎo)信號傳導(dǎo)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中被磷酸化，參與TGF-β信號通路[12]。TGF-β1/Smads通路參與肝癌、NSCLC等多種腫瘤細胞增殖與凋亡[13-14]。Chen等[15]研究表明，LncRNA FOXD3-AS1通過上調(diào)miR-296-5p和抑制TGF-β1/Smads信號通路活化，抑制甲狀腺癌細胞增殖與侵襲。陳春苗等[16]研究表明，在TGF-β1誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細胞中，小檗堿可能通過抑制TGF-β/Smad信號通路，抑制HepG2細胞的遷移和侵襲及EMT進程。本研究發(fā)現(xiàn)，SiHa細胞轉(zhuǎn)染si-RAD51AP1或使用TGF-β抑制劑處理后，TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達水平顯著減低，提示抑制RAD51AP1表達與TGF-β/Smad 通路抑制劑的作用效果類似，抑制RAD51AP1表達可抑制TGF-β/Smad 通路。而使用si-RAD51AP1與TGF-β激活劑共同處理細胞后，與單獨使用si-RAD51AP1相 比，細 胞 中TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達水平顯著升高，細胞增殖活性、細胞克隆形成率升高，凋亡率降低，證實抑制RAD51AP1表達可通過抑制TGF-β/Smad 通路，抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，提示通過抑制RAD51AP1表達可能抑制宮頸癌腫瘤的生長，這為宮頸癌的治療提供了一個方向。研究顯示[17]，BRD4抑制劑可通過抑制RAD51AP1轉(zhuǎn)錄增加宮頸癌對放療的敏感性，提示RAD51AP1可能在在宮頸癌治療中發(fā)揮一定的作用。本研究接下來將結(jié)合動物模型，研究RAD51AP1對宮頸癌的抑制作用，為宮頸癌的診治提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，RAD51AP1在宮頸癌中表達上調(diào)，抑制RAD51AP1表達可通過抑制TGF-β/Smad通路抑制宮頸癌生長。