淡豆豉發(fā)酵過程總黃酮和多糖含量動態(tài)分析*

劉 鋒，曹冬英，徐 偉，隋利強

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學藥學院/福建省中藥制劑與質(zhì)量控制工程技術研究中心，福建 福州 350122）

淡豆豉以黑豆為原料，桑葉、青蒿為輔料，經(jīng)過微生物的轉(zhuǎn)化發(fā)酵而來，具有解表除煩、宣發(fā)郁熱的功效[1]。淡豆豉中含有多糖、黃酮、氨基酸等有效活性成分，其中多糖具有抗氧化、降血糖等藥理作用[2-3]，黃酮具有解熱、降血脂、抗腫瘤及抗動脈硬化等藥理作用[4-7]。淡豆豉發(fā)酵過程，多糖和黃酮類成分隨著微生物代謝發(fā)生轉(zhuǎn)化，并隨著發(fā)酵進展含量呈動態(tài)變化。為進一步明確淡豆豉發(fā)酵過程多糖和黃酮類成分的變化，本研究收集了淡豆豉發(fā)酵第2、4、6、13天及悶制第3、9、15天的樣品，測定其總黃酮和多糖的含量，分析淡豆豉在發(fā)酵不同階段總黃酮及多糖含量的動態(tài)變化。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 SP-1920型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；Q-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP型十萬分之一分析天平[賽多利斯科學儀（北京）有限公司]；R-1001VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；TC-M600D型低速臺式空冷型離心機（寧波拓普森科學儀器有限公司）；HH-ZK4型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 材料與試劑 黑豆（市售）經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為豆科植物大豆[Glycine max（Linn.）Merr.]的成熟種子；桑葉（北京本草方源藥業(yè)集團有限公司，批號：20170508）經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為?？浦参锷＃∕orus alba L.）]的葉；青蒿（安徽順和堂中藥飲片有限公司，批號：171201）經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為菊科植物黃花蒿（Artemisia annua Linn.）的干燥地上部分。染料木苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：3W87E685）；D-無水葡萄糖對照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C11653106）；甲醇、乙醇、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測定[8]

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取染料木苷對照品1.11 mg，用70%甲醇溶解至25 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.044 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取淡豆豉粉末1 g（過40目篩），置三角錐形瓶中，用70%甲醇25 mL加熱回流2次，每次0.5 h，放至室溫稱量，補足失重，搖勻濾過，合并續(xù)濾液，取續(xù)濾液0.5 mL置25 mL容量瓶中，用70%甲醇定容到刻度，即得。

2.1.3 檢測波長的確定 以甲醇為空白對照，將染料木苷對照品溶液和淡豆豉采用藥典法悶至15 d的供試品溶液在200～400 nm波長處進行掃描。結(jié)果確定兩者在260 nm處有最大吸收，故確定260 nm為檢測波長。（見圖1～2）

圖1 染料木苷對照品溶液紫外掃描光譜圖

圖2 供試品溶液紫外掃描光譜圖

2.1.4 線性關系考察 分別吸取對照品溶液0.2、0.6、0.8、1.0、1.5、1.8、2.0 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用紫外分光光度計測定260 nm處吸收，以吸光度值Y為縱坐標，染料木苷濃度X（mg/mL）為橫坐標，得到線性回歸方程：Y=9.973X+0.047，r=0.999 7，表明染料木苷在0.008～0.090 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 吸取對照品溶液1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.1.4”項下方法連續(xù)測定6次，RSD為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 吸取“2.1.2”項下淡豆豉提取溶液0.5 mL，至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.1.4”項下方法分別在0、2、4、8、12 h內(nèi)測定吸光度值，RSD為1.91%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 取淡豆豉粉末6份，分別按“2.1.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下的方法進行測定，樣品中總黃酮的平均含量為110.37 mg/g，RSD為0.31%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 分別取淡豆豉樣品6份，精密加入等量對照品，按“2.1.2”項下方法制備樣品，并測定其吸光度，計算樣品回收率，結(jié)果見表1。

表1 總黃酮加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

2.1.9 樣品總黃酮的含量測定 分別取淡豆鼓發(fā)酵第2、4、6、13天和悶制第3、9、15天的樣品，按“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制備樣品溶液，按“2.1.4”項下測定方法進行測定，測得淡豆豉總黃酮含量見表2。

表2 淡豆豉總黃酮含量 （n=3）

2.2 多糖的含量測定

2.2.1 線性關系考察 精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品11.5 mg，加水溶解定容至100 mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.115 mg/mL對照品溶液。精密吸取葡萄糖對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，加蒸餾水補至總體積1 mL，加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入5 mL濃硫酸，立即搖勻，沸水浴15 min，冰水浴15 min，485 nm處測定吸光度。以D-無水葡萄糖的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=8.055 2X+0.026 1，r=0.997 1，表明D-無水葡萄糖的質(zhì)量濃度在0.012～0.119 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關系。

2.2.2 供試品溶液的制備[9-10]精密測定淡豆豉粉末（過40目篩）4 g，采用回流水提多糖，12倍量水提取2次，每次0.5 h，合并提取液，抽濾。加入1/5 Sevag試劑去除提取液，震搖15 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液。將除去蛋白后的提取液濃縮至25 mL，加入無水乙醇使含醇量達到80%，靜置24 h，離心，收集沉淀，干燥，即得淡豆豉多糖。將干燥后淡豆豉多糖用水溶解并定容至100 mL，即得供試品溶液。

2.2.3 檢測波長的確定 以水為空白對照，將葡萄糖對照品溶液和淡豆豉藥典法悶至15 d的供試品溶液顯色后在400～800 nm波長處進行掃描。結(jié)果確定兩者在485 nm處有最大吸收，故確定485 nm為檢測波長。（見圖3～4）

圖3 葡萄糖對照品溶液掃描光譜圖

圖4 供試品溶液掃描光譜圖

2.2.4 苯酚-硫酸法測定多糖含量[11-14]精密量取供試品溶液1 mL定容至10 mL容量瓶，定容得待測樣品溶液。精密量取1 mL待測樣品溶液置具塞試管中，加入5%苯酚水溶液1 mL后迅速加濃硫酸5 mL，搖勻，沸水反應15 min后，冰水浴15 min終止反應，以水為空白對照同法顯色，在485 nm處測定。

2.2.5 精密度試驗 以吸光值計算，吸取對照品溶液適量，按“2.2.1”項下方法連續(xù)測定6次，RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取淡豆豉溶液適量，按“2.2.1”項下方法分別于0、0.5、1.0、2.0、4.0 h時，測定其吸光值，RSD為1.23%，表明供試品在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取淡豆豉粉末6份，分別按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下的方法進行測定，樣品中多糖的平均含量為173.09 mg/g，RSD為0.14%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 分別取淡豆豉樣品6份，精密加入等量對照品，按“2.2.2”項下方法制備樣品，并測定其吸光度，計算樣品回收率，結(jié)果見表3。

表3 多糖加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

2.2.9 樣品多糖的含量測定 分別取淡豆鼓發(fā)酵第2、4、6、13天和悶制第3、9、15天的樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法樣品溶液，按“2.2.1”項下測定方法進行測定，測得淡豆豉多糖含量見表4。

表4 淡豆豉多糖的含量 （n=3）

3 討 論

3.1 淡豆豉發(fā)酵過程中多糖的動態(tài)分析 淡豆豉多糖含量在發(fā)酵2～4 d時逐漸升高，在4～6 d時呈下降趨勢，在6～13 d時呈上升趨勢，發(fā)酵13 d時，達到最高值；淡豆鼓多糖在悶制1～3 d呈明顯下降趨勢，在悶制第3～15 d時呈上升趨勢，悶制15 d時達到最高值，與發(fā)酵13 d時的多糖含量接近。多糖含量動態(tài)變化見圖5。由此可知，淡豆豉發(fā)酵過程的悶制環(huán)節(jié)對多糖含量影響不明顯。

圖5 多糖含量變化動態(tài)圖

3.2 淡豆豉發(fā)酵過程中總黃酮的動態(tài)分析 淡豆豉總黃酮含量在發(fā)酵2～6 d時逐漸升高，在6～13 d時呈下降趨勢，悶制過程隨著時間累積呈上升趨勢，悶制15 d時達到峰值?？傸S酮含量動態(tài)變化見圖6。此由可知，淡豆豉發(fā)酵過程的悶制環(huán)節(jié)對總黃酮含量影響較大，淡豆豉發(fā)酵過程的悶制環(huán)節(jié)有利于總黃酮的累積。

圖6 總黃酮含量變化動態(tài)圖

3.3 對照品的選擇 經(jīng)查閱文獻，淡豆豉總黃酮含量測定可用染料木素和染料木苷[15,8]作為對照品，本研究經(jīng)過分析選定染料木苷作為測定總黃酮的對照品。結(jié)果顯示，該方法簡便、穩(wěn)定、可行。

3.4 淡豆豉多糖含量測定方法的選擇 經(jīng)查閱文獻，多糖含量測定的顯色方法有蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法[12]。預實驗過程中對兩種方法進行了比較，結(jié)果顯示，苯酚-硫酸法較蒽酮-硫酸法穩(wěn)定，故本實驗采用苯酚-硫酸法進行顯色測定。

3.5 淡豆豉多糖含量測定過程中除蛋白方法的選擇 淡豆豉中含有大量的蛋白質(zhì)，影響淡豆豉多糖的組成及化學結(jié)構分析，也影響其生物活性的研究。因此，本研究對淡豆豉多糖進行了脫蛋白研究，以提高其純度。經(jīng)查閱文獻[12]，提取多糖時有多種除淡豆豉蛋白的方法，預實驗比較了sevag法和三氯乙酸法去除淡豆豉蛋白質(zhì)的效果，結(jié)合實驗室的實驗條件，sevag法操作簡便，更適用于淡豆豉蛋白質(zhì)的去除。

3.6 測定波長的選擇 經(jīng)查閱文獻，淡豆豉總黃酮檢測波長有322、260、261 nm[16-18]，本研究采用紫外分光光度法在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果顯示樣品最大吸收波長為259～269nm，染料木苷的最大吸收波長為263～269 nm，故最終選定淡豆豉總黃酮的檢測波長為260 nm。經(jīng)查閱文獻，淡豆豉多糖檢測波長有490、450 nm[10,19]，本研究采用可見分光光度在400～800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果顯示，樣品最大吸收波長為485～488 nm，對照品最大吸收波長為482～486 nm，故最終選定淡豆豉多糖的檢測波長為485 nm。

淡豆豉發(fā)酵過程主要包括兩個階段，分別是自然條件下發(fā)酵和悶制。淡豆豉發(fā)酵過程中總黃酮和多糖含量呈動態(tài)變化，推測該變化與淡豆豉發(fā)酵過程中微生物代謝過程，伴隨著藥效成分的轉(zhuǎn)化有關?？傸S酮和多糖含量動態(tài)分析結(jié)果顯示，淡豆豉發(fā)酵時悶制發(fā)酵有助于總黃酮的累積，悶制與否對淡豆豉多糖含量影響不明顯。綜合總黃酮和多糖含量的動態(tài)分析，淡豆豉發(fā)酵過程悶制環(huán)節(jié)是必要過程。該結(jié)果可為淡豆豉的炮制原理和生產(chǎn)工藝研究提供參考。