四川省甘孜縣部分牦牛肉致病菌及寄生蟲的檢測(cè)分析

古麗香，金 凡，蘇春麗，楊天龍，蔡 炯，楊 紅，韓 琴*

(1.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,四川成都 610500；2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都 611130)

食源性疾病是全世界的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。世界衛(wèi)生組織 (WHO) 表示，因食用受污染的食物每年會(huì)導(dǎo)致 200余種疾病，約有200萬(wàn)人死亡。根據(jù)對(duì)我國(guó)2010—2016年發(fā)生的家庭食源性疾病統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，共發(fā)生5 197 起，累計(jì)發(fā)病數(shù) 29 210 例，平均每年發(fā)病數(shù)約4 173例，死亡780 例，病死率為2.7%，且發(fā)病數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)[1]。食源性疾病主要是指人們通過(guò)進(jìn)食而造成毒害物質(zhì)或者生物性病原體等致病因子進(jìn)入體內(nèi)，進(jìn)而引發(fā)的疾病。當(dāng)前，細(xì)菌性微生物是導(dǎo)致食源性疾病暴發(fā)的重要原因[2-3]。而肉類在食品致病微生物污染中最為常見(jiàn)[4]，因其富含蛋白質(zhì)以及多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為致病微生物提供了良好的生存、繁殖環(huán)境，而且微生物能夠在肉制品中保留更久，在食用前若未進(jìn)行加熱，則易引發(fā)多種疾病[5]。在這種情況下，肉類食品成為微生物的天然培養(yǎng)基，極易引起食源性疾病。

在肉類中常見(jiàn)的致病菌有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、大腸桿菌0157：H7等。沙門氏菌在外環(huán)境中的生存能力較強(qiáng), 在肉類食品中能生存數(shù)月，是感染人類和動(dòng)物的常見(jiàn)腸道細(xì)菌病原體。據(jù)報(bào)道，在我國(guó)發(fā)生的128起沙門氏菌食物中毒事件中，由肉類食品引發(fā)的有108件，占總起數(shù)的84.3%，其中牛肉占32%[6]。而單增李斯特氏菌可在 4 ℃冰箱中生長(zhǎng)繁殖，并且冷藏時(shí)間越長(zhǎng)，危險(xiǎn)性越高，在各種食品中均可造成污染，尤其是在肉類食品中，污染率高達(dá)10%～30%,其主要感染對(duì)象為免疫力低下人群，致死率較高[7-8]。金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然界，由于其腸毒素致病力較強(qiáng)，由其引起的病人往往出現(xiàn)較為嚴(yán)重的食物中毒癥狀。美國(guó)疾控中心研究報(bào)告中指出，由金黃色葡萄球菌引起的食源性疾病占第2位，僅次于大腸桿菌。此外，寄生蟲也是引起食源性疾病的重要因素之一。它是一類寄生在人體或者其他動(dòng)物體內(nèi)的微生物，經(jīng)食物、水或土壤等傳播可導(dǎo)致寄生蟲病，嚴(yán)重威脅人的生命健康。寄生蟲的種類較多，主要是肉源性的帶絳蟲、旋毛蟲等危害較為嚴(yán)重[9]。除此之外，一些寄生蟲病為人畜共患病，包括豬、牛肉的囊尾蚴、旋毛蟲、棘球蚴、弓形蟲等，是影響人們健康公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。

甘孜縣擁有天然草場(chǎng)約37.8萬(wàn)hm2,是四川省重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地，憑借天然資源的優(yōu)勢(shì),造就了牦牛這一優(yōu)良畜種。牦牛肉具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，富含維生素、礦物質(zhì)及人體必需氨基酸，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他牛肉[10]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高及飲食習(xí)慣的改變，營(yíng)養(yǎng)保健、綠色無(wú)污染的食品受到消費(fèi)者的青睞。因此，牦牛肉逐漸成為市場(chǎng)開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，而牦牛養(yǎng)殖業(yè)已成為甘孜縣廣大農(nóng)民脫貧致富的一項(xiàng)支柱產(chǎn)業(yè)。隨著牦牛肉及肉制品在居民膳食結(jié)構(gòu)中的比重越來(lái)越大，其衛(wèi)生安全狀況也備受消費(fèi)者關(guān)注。因此，為了解常見(jiàn)食源性致病菌如沙門菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌O157：H7 及寄生蟲對(duì)四川省甘孜縣奪多鄉(xiāng)牦牛肉的污染情況，筆者進(jìn)行了檢測(cè)分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2020年9月至2021年11月自四川省甘孜縣雪域藍(lán)天養(yǎng)殖加工合作社采集樣品，該養(yǎng)殖合作社包括甘孜縣奪多鄉(xiāng)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，采集新鮮牦牛肉和風(fēng)干牦牛肉共5批，共計(jì)138份，其中鮮牦牛肉78份，風(fēng)干牦牛肉60份，采樣時(shí)間為每年9—12月，按照無(wú)菌操作采集樣品，每份最小采樣量為 500 g，置于無(wú)菌封口袋中，在冷藏條件下送至四川省成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院檢測(cè)。

1.2 試劑和儀器無(wú)菌生理鹽水、BPW 增菌液、TTB增菌液、SC 增菌液、BS 瓊脂、 LB1 增菌液、 LB2增菌液、 XLD瓊脂、 CT-SMAC瓊脂、 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基、Baird-Parker 瓊脂平板、改良 EC 肉湯( mEC+n )、TSI瓊脂、MUG-LST，單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、大腸埃希氏菌 O157 顯色培養(yǎng)基等。顯微鏡、振蕩器、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌均質(zhì)器、無(wú)菌試管、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、厭氧培養(yǎng)裝置等。

1.3 食源性致病菌檢測(cè)項(xiàng)目及方法檢測(cè)冷凍鮮牦牛肉及風(fēng)干牦牛肉中沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157：H7的污染情況。 根據(jù) GB 4789.4—2016《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[11]，GB 4789.10—2016《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[12]，GB4789.30—2016《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[13],GB 4789.36—2016 《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)》[14]，對(duì)其進(jìn)行處理及檢測(cè)。

1.4 寄生蟲檢測(cè)按照《國(guó)家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》操作。按照隨機(jī)采樣原則，從每批鮮肉中抽取腿部肌肉、橫膈膜肌肉和肋間肌肉各6份進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同種類寄生蟲分別采取剖檢法、飽和鹽水浮聚法、壓片法、沉淀法等進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)牛帶絳蟲、棘球蚴和旋毛蟲。

1.4.1飽和鹽水浮聚法。采用飽和鹽水浮聚法檢測(cè)牛帶絳蟲。將適量NaCl 溶于水中煮沸，直至不能溶解為止，將其靜置冷卻，有少量鹽析出，所得溶液即為飽和鹽水。取鮮牦牛肉500 g，加入適量飽和鹽水，清洗牛肉表面2～3遍，將清洗過(guò)的水倒入錐形瓶中，用膠頭滴管滴至瓶口稍高出但不溢出的狀態(tài)。在瓶口覆蓋一載玻片，使其與液面完全接觸但無(wú)氣泡產(chǎn)生，靜置 25 min。平提載玻片并迅速翻轉(zhuǎn)，蓋上蓋玻片，不存有氣泡，置顯微鏡下觀察。

1.4.2水洗沉淀法 。采用水洗沉淀法檢測(cè)棘球蚴。使用去離子水清洗牦牛肉表面，將清洗過(guò)的水倒入倒三角瓶中，靜置 30 min 后傾去上清，保留沉淀。再加滿去離子水，靜置30 min，傾去上清液，保留沉淀。反復(fù) 1～3 次直至上清澄清后轉(zhuǎn)至 50 mL 量杯中，再加蒸餾水重復(fù)清洗沉渣1～2次，每次均須靜置30 min，倒去上清液留下2～3 mL下層沉淀。最后用滴管吸取適量沉淀涂于載玻片上，置顯微鏡下觀察。

1.4.3直接剖檢法。將清洗過(guò)的牦牛肉置于解剖盤中，用刀順著紋理方向切開(kāi)，選擇不同部位及深度進(jìn)行檢查，肉眼觀察牦牛肉上是否有蟲體或囊包。發(fā)現(xiàn)蟲體或囊包后取出鏡檢，在顯微鏡下根據(jù)特征進(jìn)行鑒定。

1.4.4壓片法。采用壓片法檢測(cè)旋毛蟲。順著牦牛肉肌肉紋理方向剪取不同部位約0.2 g，置于載玻片上，并滴加堿性品紅染液，蓋上另一張載玻片。將2張載玻片擠壓成薄膜，置顯微鏡下觀察。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用 WPS Excel 對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)寄生蟲檢出率。

檢出率=檢出數(shù)/樣本數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛肉食品致病菌檢測(cè)結(jié)果鮮肉及肉制品中致病菌污染的原因除牦牛本身帶菌、飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生條件差外，在屠宰、加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中肉品也會(huì)受到污染。對(duì)甘孜縣冷凍鮮牦牛肉及風(fēng)干牦牛肉進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、大腸埃希氏菌0157：H7 4種致病菌的檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家肉類衛(wèi)生合格標(biāo)準(zhǔn)(表1、圖1～6)。

表 1 四川省甘孜縣牦牛肉 4 種致病菌檢出情況

圖 1 沙門氏菌在XLD和BS平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Salmonella on both XLD and BS plates

注：A.沙門氏菌在三糖鐵瓊脂的反應(yīng)結(jié)果(K.產(chǎn)堿;A.產(chǎn)酸；+.陽(yáng)性;-.陰性 )；B.沙門氏菌在生化鑒定條上的反應(yīng)結(jié)果，樣品可判定為沙門氏菌陰性Note:A.The reaction results of Salmonella in trisaccharide iron agar (K.Alkali production; A.Acid production;+.Positive; -.Negative); B.The reaction result of Salmonella on the biochemical identification strip, the sample can be judged as Salmonella negative圖2 沙門氏菌的生化鑒定結(jié)果Fig.2 Biochemical identification results of Salmonella

圖3 金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of S.aureus on Baird-Parker plates

圖4 單增李斯特氏菌在PALCAM平板和單增李斯特氏菌顯色平板上的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of Listeria monocytogenes on PALCAM plate and Listeria chromogenic plate

圖5 大腸埃希氏菌0157在CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌 0157 顯色平板上的菌落形態(tài)Fig.5 Colony morphology of Escherichia coli 0157 on CT-SMAC plate and Escherichia coli 0157 color plate

注：A.大腸埃希氏菌0157：H7在三糖鐵瓊脂的反應(yīng)結(jié)果(K.產(chǎn)堿;A.產(chǎn)酸；+.陽(yáng)性;-.陰性)；B.大腸埃希氏菌0157：H7在生化鑒定條上的反應(yīng)結(jié)果，樣品可判定為大腸埃希氏菌0157：H7陰性Note:A.The reaction results of Escherichia coli 0157: H7 in trisaccharide iron agar (K.Alkali production;A.Acid production; +.Positive; -.Negative); B.The reaction result of Escherichia coli 0157: H7 on the biochemical identification strip, the sample can be judged as negative for Escherichia coli 0157: H7圖6 大腸埃希氏菌0157：H7的生化鑒定結(jié)果Fig.6 Results of biochemical identification of Escherichia coli 0157: H7

2.2 鮮牦牛肉寄生蟲檢測(cè)結(jié)果30份冷凍鮮牦牛肉中均未檢出牛帶絳蟲、棘球蚴和旋毛蟲。順著牦牛肉紋理方向?qū)⑷獗韺蛹吧顚觿濋_(kāi)，肉眼觀察牛肉表面、淺表及深層內(nèi)部，并置于顯微鏡下觀察，肉眼及鏡下均未發(fā)現(xiàn)牛帶絳蟲、棘球蚴和旋毛蟲(圖7)。

注：A.飽和鹽水浮聚法檢測(cè)牛帶絳蟲；B.沉淀法檢測(cè)棘球蚴；C.壓片法檢測(cè)旋毛蟲;D.切開(kāi)牦牛腿肉，橫膈膜肌及肋間肌肉,肉眼觀察并未發(fā)現(xiàn)囊尾蚴Note:A.Taenia by saturated saline; B.Cercariae by precipitation; C.Trichellae by pressure plate;D.No cysticercus was found in the diaphragmatic muscle and intercostal muscle after incision of yak leg meat圖7 顯微鏡下冷凍鮮牦牛肉寄生蟲檢測(cè)結(jié)果(10×10)Fig.7 Observation results of parasites in frozen fresh yak meat under microscope (10×10)

3 討論

食源性致病菌和寄生蟲污染是食物中毒和食源性疾病暴發(fā)的重要因素，是當(dāng)前食品安全的主要風(fēng)險(xiǎn)隱患。除食品本身是致病菌的攜帶者外，在屠宰、加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中肉品也會(huì)受到污染。由四川省甘孜縣奪多鄉(xiāng)冷凍鮮牦牛肉和風(fēng)干牦牛肉的食源性致病菌檢驗(yàn)結(jié)果可知，沙門氏菌、單增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157：H7檢驗(yàn)結(jié)果均在國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。在甘孜縣牦牛肉及肉制品中雖未檢出致病菌，但我國(guó)各地調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，牛肉及肉制品仍存在著被食源性致病菌污染的情況。如天祝白牦牛肉中金黃色葡萄球菌的檢出率為14.7%[15]，新疆烏魯木齊地區(qū)零售生牛肉中沙門氏菌的感染率達(dá)到6.44%[16]。而在各類零售肉產(chǎn)品中也檢測(cè)出大腸埃希菌0157：H7，主要包括牛肉產(chǎn)品[17-18]。此外，在上海地區(qū)市售生鮮肉中食源性致病菌的調(diào)查結(jié)果顯示，鮮牛肉的單增生李斯特氏菌檢出率也非常高，達(dá)到48.0%，高于鮮豬肉(17.5%)和整雞(19.6%)[19]。因此，對(duì)牦牛肉及肉制品中的食源性致病菌污染仍不能放松警惕。

隨著牦牛養(yǎng)殖量的不斷增加，牦牛養(yǎng)殖相對(duì)集中，交通運(yùn)輸交易頻繁，給寄生蟲病的傳播感染也提供了更多機(jī)會(huì)。寄生蟲感染會(huì)造成牦牛生長(zhǎng)緩慢，生產(chǎn)性能降低，甚至引起繼發(fā)感染導(dǎo)致死亡，造成嚴(yán)重?fù)p失。除此之外，它們也能夠作為病原引起疾病及作為疾病的傳播媒介，嚴(yán)重威脅人民生命健康[20]。帶絳蟲病被世界衛(wèi)生組織列為十大危害食源性寄生蟲病之一，它不僅會(huì)造成人體殘疾，還會(huì)危及生命。據(jù)報(bào)道，我國(guó)帶絳蟲病總感染率為0.06%，感染數(shù)約37萬(wàn)例，感染率居前3位的包括四川省(0.18%)[21]。旋毛蟲病呈全球性分布，主要是因生食或半生食含旋毛蟲幼蟲囊包的肉類而感染。因此，在喜生食或半生食肉的國(guó)家和地區(qū)，經(jīng)常會(huì)暴發(fā)感染事件[22]。棘球蚴素有 “蟲癌” 之稱，包囊好發(fā)于肝臟、 肺臟和腦部，幾乎可造成所有臟器和組織的損害，危害大， 病死率高[23]。我國(guó)第2次人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查報(bào)告顯示，帶絳蟲、棘球蚴和旋毛蟲病感染率仍較嚴(yán)重，與第1次調(diào)查結(jié)果相比，四川省帶絳蟲感染率上升幅度最為明顯, 高達(dá)98%[24]。此外，四川省也是棘球蚴病(俗稱包蟲病)的高發(fā)區(qū)之一，主要流行于甘孜州和阿壩州的31個(gè)縣。棘球蚴成蟲寄生在犬科動(dòng)物小腸，其蟲卵或孕卵節(jié)片隨糞便排出污染水、草及環(huán)境，在放牧過(guò)程中，牦牛因食入蟲卵而被感染，造成當(dāng)?shù)仃笈＜蝌矢腥韭瘦^高[25]。筆者在甘孜縣的冷凍鮮牦牛肉中未檢出寄生蟲污染，說(shuō)明四川省甘孜縣近年來(lái)的防治措施取得了一定成效，但仍需持續(xù)和重點(diǎn)關(guān)注感染率較高的重點(diǎn)人群和重點(diǎn)地區(qū)。

該研究中，在甘孜縣冷凍鮮牦牛肉及其肉制品中雖未檢出食源性致病菌和寄生蟲污染，但仍不能松懈，相關(guān)部門應(yīng)對(duì)牦牛肉養(yǎng)殖及生產(chǎn)加工全過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格管控，加強(qiáng)相關(guān)操作人員的食品衛(wèi)生知識(shí)培訓(xùn)，提高衛(wèi)生意識(shí)。同時(shí)，政府應(yīng)加大監(jiān)督力度，以確保肉制品安全，切斷傳播及感染途徑，防止食源性疾病暴發(fā)。