陳化玉米固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化及其營養(yǎng)價值評定

王嘯林 劉梓涵 程傳騰 馮冠智 張廣寧 張永根

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

玉米是我國主要的儲備糧之一，其儲存尤為重要。我國每年有大量存儲期較長的玉米被輪換流入畜牧行業(yè)，最終用于飼料生產(chǎn)、食品加工以及工業(yè)乙醇的制備[1]。在長期儲存的過程中，由于自身的呼吸作用，玉米的營養(yǎng)成分和理化性質(zhì)發(fā)生改變。隨著貯藏時間的延長，蛋白質(zhì)游離的氨基與還原糖的羰基相互作用形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，抑制了淀粉水解酶的活性，阻礙了淀粉被瘤胃微生物獲得與利用；此外，玉米陳化的過程中直鏈淀粉含量有所增加，而支鏈淀粉含量降低，這加速了淀粉老化的進(jìn)程，從而溶解度降低，導(dǎo)致淀粉的消化速度和消化程度降低[2]。

微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)具有減少飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和霉菌毒素、提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率、改善發(fā)酵飼料品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。Hoffman等[5]的研究表明，青貯發(fā)酵能夠促進(jìn)高水分玉米中淀粉-蛋白質(zhì)基質(zhì)的降解，使瘤胃細(xì)菌更容易接觸到淀粉顆粒，促進(jìn)淀粉的降解。Kung等[6]和Saylor等[7]的研究表明，外源蛋白酶以及產(chǎn)酸能力強(qiáng)的布氏乳桿菌可降低高水分玉米發(fā)酵料的pH和醇溶蛋白含量，提高淀粉的體外降解率。

然而，影響固態(tài)發(fā)酵的因素較多，并且一些影響因素較難控制，為了獲得優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵飼料，不同的發(fā)酵底物應(yīng)該具有不同的發(fā)酵工藝[8-9]。酸性蛋白酶和鼠李糖乳桿菌被大量的研究證明具有降解醇溶蛋白以及提高發(fā)酵品質(zhì)的能力，可提高淀粉的消化率[6,10]。因此，針對陳化玉米淀粉消化率低的特點(diǎn)，本試驗分別以酸性蛋白酶和鼠李糖乳桿菌作為添加酶制劑和接種劑，利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)對陳化玉米進(jìn)行發(fā)酵，使用響應(yīng)面法對發(fā)酵因素進(jìn)行優(yōu)化，提高發(fā)酵料中瘤胃淀粉降解率。通過對比化學(xué)成分和抗氧化能力，分析發(fā)酵后陳化玉米品質(zhì)的變化，以期為陳化玉米的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

陳化玉米購自哈爾濱周邊糧庫，儲存時間為4年。酸性蛋白酶購自滄州某酶生物技術(shù)有限公司，活力≥60 000 U/g。鼠李糖乳桿菌(活菌數(shù)≥4×109CFU/g)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)反芻動物營養(yǎng)研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 Plackett-Burman主效應(yīng)因子的篩選

基于前期單因素預(yù)試驗的結(jié)果，將含水量、菌接種量、酶添加量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間作為考察的因素，每個因素選取高(1)、低(-1)2個水平，設(shè)計Plackett-Burman試驗，其中試驗次數(shù)=12，試驗因素及水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平

1.2.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗所篩選出的重要影響因素，通過最陡爬坡試驗確定這些影響因素的取值，使其逼近最大響應(yīng)區(qū)域，以確定響應(yīng)面試驗的中心試驗點(diǎn)。其爬坡方向與步長參考張昊月等[11]的方法。

1.2.3 Box-Behnken試驗

采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面試驗對陳化玉米發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，將Plackett-Burman試驗篩選出的顯著影響因素設(shè)置為自變量，以瘤胃淀粉降解率為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的分析試驗，如表2所示，中心試驗點(diǎn)為最陡爬坡試驗所確定。由陳化玉米發(fā)酵的擬合模型以及響應(yīng)面圖進(jìn)行最優(yōu)發(fā)酵條件的預(yù)測。在最優(yōu)條件下發(fā)酵陳化玉米，測定其瘤胃淀粉降解率，并與預(yù)測值進(jìn)行對比和驗證。

表2 Box-Behnken試驗因素及水平

1.3 瘤胃淀粉降解率的測定

根據(jù)Saylor等[7]的方法，采用尼龍袋法測定瘤胃淀粉降解率。向孔徑為50 μm、大小為10 cm×20 cm的尼龍袋中裝入已準(zhǔn)確稱取的7 g樣品，扎緊袋口后放置于3頭裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛的瘤胃中。每個樣品做3個重復(fù)，每頭牛為1個重復(fù)。在發(fā)酵7 h時將尼龍袋取出，用冷水沖洗所有尼龍袋直到水澄清，將洗凈后的尼龍袋于55 ℃的烘箱中烘48 h至恒重，回潮24 h后稱重。取出尼龍袋中的殘余物，粉碎過1 mm標(biāo)準(zhǔn)篩孔，裝入自封袋中保存。

測定各組陳化玉米原樣和7 h瘤胃降解殘渣樣中的淀粉含量，淀粉含量使用Megazyme總淀粉檢測試劑盒(產(chǎn)品編號：K-TSTA；Megazyme國際有限公司，愛爾蘭)進(jìn)行測定。根據(jù)公式計算7 h瘤胃淀粉降解率：

7 h瘤胃淀粉降解率(%)=100×(S0-S7)/S0。

式中：S0為陳化玉米原樣中的淀粉含量；S7為7 h瘤胃降解殘渣淀粉含量。

1.4 發(fā)酵前和發(fā)酵后化學(xué)成分的測定

按照AOAC(2000)[12]的方法測定干物質(zhì)(DM)和粗蛋白質(zhì)(CP)含量；根據(jù)Van Soest等[13]的方法測定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量；采用硫酸-蒽酮法[14]測定可溶性碳水化合物(WSC)含量；根據(jù)張霞等[15]的方法測定醇溶蛋白含量；pH采用Sartorius PB-10型酸度計(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)測定。

1.5 發(fā)酵前和發(fā)酵后抗氧化能力的測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力使用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定；羥基自由基清除能力按照Ajibola等[16]的方法測定；還原能力根據(jù)Chi等[17]的方法測定。

1.6 統(tǒng)計分析

陳化玉米發(fā)酵條件優(yōu)化部分的結(jié)果采用Design-Export 10.0.4進(jìn)行分析，P<0.05代表有顯著性差異。發(fā)酵對陳化玉米的化學(xué)成分和抗氧化能力的影響采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one way-ANOVA)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。經(jīng)過12次不同發(fā)酵試驗后，瘤胃淀粉降解率變化范圍為44.27%～59.60%。其中，當(dāng)含水量為40%，菌接種量為1×109CFU/g，酶添加量為0.6%，發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵時間為15 d時淀粉降解率最高。對表3的結(jié)果進(jìn)行方差分析如表4所示，模型P<0.05表明模型顯著；R2=0.973 1說明此回歸模型擬合程度良好。此外，顯著影響發(fā)酵陳化玉米中淀粉降解率的因子分別為含水量、菌接種量和酶添加量；而發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對淀粉降解率影響不大，因此后續(xù)試驗中，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間設(shè)定為前期單因素試驗中的最優(yōu)水平(36 ℃和20 d)。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗結(jié)果方差分析

2.2 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示，當(dāng)含水量(X1)=40%，菌接種量(X2)=7×108CFU/g，酶添加量(X3)=0.5%時淀粉降解率最高，而繼續(xù)升高含水量、菌接種量和酶添加量的水平反而會降低淀粉降解率。因此，響應(yīng)面試驗的中心試驗點(diǎn)為：含水量40%，菌接種量7×108CFU/g，酶添加量0.5%。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 Box-Behnken試驗

優(yōu)化瘤胃淀粉降解率的Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果如表6所示，經(jīng)過17次不同發(fā)酵試驗后，發(fā)現(xiàn)淀粉降解率在中心試驗點(diǎn)2、4、8、15和16時最大，依次為63.49%、61.18%、63.02%、62.48%和62.87%，此時的發(fā)酵條件為含水量40%，菌接種量7×108CFU/g，酶添加量0.5%。對表6的試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析見表7，模型P<0.01達(dá)到極顯著水平；R2=0.979 6說明表明97.96%的淀粉降解率可由該模型解釋，與實(shí)際情況擬合良好；失擬項不顯著(P=0.233 8)，代表回歸方程擬合度良好。此外，含水量、菌接種量和酶添加量的一次項和二次項、含水量和菌接種量的交互作用以及菌接種量和酶添加量的交互作用均顯著影響瘤胃淀粉降解率(P<0.05)。通過回歸擬合，這3種試驗因子對瘤胃淀粉降解率(Y)影響的回歸方程為：

Y(%)=62.606+2.462A+1.048B+
1.166C-2.459AB-0.209AC-1.315BC-
4.132A2-4.744B2-4.678C2。

式中：A為含水量(%)；B為菌接種量(CFU/g)；C為酶添加量(%)。

圖1至圖3為2個因素之間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖。響應(yīng)面的斜率越大，對應(yīng)的等高線越密集(接近于橢圓)，說明2個因素的交互作用越顯著。含水量與菌接種量的交互作用如圖1，隨著含水量和菌接種量的增加，瘤胃淀粉降解率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，其交互圖曲面坡度較陡，斜率較大，而等高線圖接近于橢圓形，說明含水量與菌接種量的交互作用顯著。由圖2可知，隨著菌接種量和酶添加量的增加，瘤胃淀粉降解率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，其交互圖曲面坡度與圖1相比較為平緩，說明其交互作用小于含水量與菌接種量的交互作用。同理，圖3中瘤胃淀粉降解率隨著含水量和酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，而交互圖曲面坡度平緩，等高線不密集，說明含水量和酶添加量的交互作用不顯著。以上結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表7 Box-Behnken試驗回歸模型方差分析

運(yùn)用Design-Export 10.0.4軟件優(yōu)化所得到的提高陳化玉米中瘤胃淀粉降解率的最優(yōu)發(fā)酵條件為:含水量41.44%，菌接種量7.04×108CFU/g，酶添加量0.51%，發(fā)酵溫度為36 ℃，發(fā)酵時間為20 d。在此條件下，所得瘤胃淀粉降解率預(yù)測值為63.04%。根據(jù)上述發(fā)酵條件重新發(fā)酵3次，所得瘤胃淀粉降解率分別為62.75%、63.15%和63.54%，與預(yù)測值相近。

圖1 含水量和菌接種量對瘤胃淀粉降解率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖2 酶添加量和菌接種量對瘤胃淀粉降解率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖3 酶添加量和含水量對瘤胃淀粉降解率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.4 發(fā)酵對陳化玉米化學(xué)成分和pH的影響

發(fā)酵前后陳化玉米的化學(xué)成分如表8所示，與陳化玉米相比，發(fā)酵陳化玉米顯著降低了NDF、ADF和WSC、醇溶蛋白含量以及pH(P<0.05)，但顯著提高了淀粉含量(P<0.05)。

表8 發(fā)酵前后陳化玉米的化學(xué)成分和pH

2.5 發(fā)酵對陳化玉米抗氧化能力的影響

發(fā)酵前后陳化玉米的DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力以及還原能力如圖4所示。由圖可知，發(fā)酵前后的陳化玉米的DPPH自由基清除能力和還原能力隨著濃度的升高而增加。在不同的濃度下，發(fā)酵陳化玉米的DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力以及還原能力均顯著高于陳化玉米(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化陳化玉米的發(fā)酵條件

玉米中的淀粉與醇溶蛋白結(jié)合形成的淀粉-蛋白質(zhì)基質(zhì)被認(rèn)為是反芻動物利用和消化淀粉的障礙之一[5]。醇溶蛋白并不來源于淀粉的內(nèi)部，而是位于淀粉顆粒的表面。醇溶蛋白可分為α、β、γ和δ 4種亞類，隨著玉米醇溶蛋白的成熟，β以及γ玉米醇溶蛋白相互交聯(lián)，與中間穿插的α和δ玉米醇溶蛋白共同形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將淀粉牢牢包裹在具有強(qiáng)疏水性的淀粉-蛋白質(zhì)基質(zhì)中，導(dǎo)致淀粉不容易被瘤胃獲得和利用[18-19]。Corona等[20]的研究也表明，玉米中醇溶蛋白含量與體外淀粉降解率以及瘤胃淀粉降解率均呈負(fù)相關(guān)。本研究中，含水量、菌接種量和酶添加量能夠顯著地影響陳化玉米的瘤胃淀粉降解率，這可能是通過改變醇溶蛋白含量來實(shí)現(xiàn)的。酸性蛋白酶的添加降低蛋白組分中醇溶蛋白的含量，但并不影響粗蛋白質(zhì)的含量，這與Landry等[21]的研究結(jié)果一致。醇溶蛋白的降解使淀粉顆粒更容易與瘤胃微生物接觸，促進(jìn)了淀粉的消化吸收。Young等[22]和Kung等[6]也表明，蛋白酶可以提高全株玉米和高水分玉米的淀粉降解率。乳酸菌的接種能夠增加發(fā)酵產(chǎn)物中的有機(jī)酸含量，降低pH，有利于醇溶蛋白的酸解，從而提高淀粉的利用效率[7]。因此，本研究中酸性蛋白酶和鼠李糖乳桿菌的添加通過破壞疏水性淀粉-蛋白質(zhì)基質(zhì)來提高瘤胃淀粉降解率。而含水量對于淀粉降解率的影響可能是由于其對乳酸菌活性和濃度的調(diào)控所致，含水量過低會導(dǎo)致乳酸菌的活性偏低，不利于發(fā)酵的進(jìn)行；含水量過高則是對乳酸菌起到稀釋的作用，降低了有機(jī)酸的濃度，導(dǎo)致醇溶蛋白的酸解受到抑制，這也間接解釋了含水量與菌接種量的交互作用顯著的原因。而由于蛋白酶與鼠李糖乳桿菌均能降低醇溶蛋白含量，菌酶協(xié)同發(fā)酵使陳化玉米中的淀粉降解率大大提升，因此菌接種量與酶添加量之間也具有顯著的交互作用。

3.2 發(fā)酵對陳化玉米營養(yǎng)價值的影響

根據(jù)Hoffman等[5]的報道，青貯發(fā)酵使淀粉-蛋白質(zhì)基質(zhì)中的所有α、β和δ Zein亞基減少了10%～40%，而γ 醇溶蛋白亞基的降幅高達(dá)60%，醇溶蛋白含量的減少促進(jìn)淀粉顆粒簇解離，增加了細(xì)菌在瘤胃中附著的表面積，從而促進(jìn)淀粉的降解。然而，這需要較長的發(fā)酵時間。在實(shí)際生產(chǎn)中，一般采用添加酶制劑和菌接種劑而不是延長發(fā)酵時間的方式來提高飼料品質(zhì)。本研究中，蛋白酶和乳酸菌的協(xié)同發(fā)酵降低了醇溶蛋白的含量，使淀粉更容易被瘤胃所利用。在飼料中，NDF和ADF難以消化和吸收，飼料的可接受性和采食量隨著NDF含量的增加而下降，飼料的消化率隨著ADF含量的增加而下降[23]。微生物發(fā)酵是一種高效的降解纖維，提高動物采食量和消化率的方法[24]，在本研究中，發(fā)酵降低了陳化玉米的NDF和ADF含量，改善了發(fā)酵飼料的品質(zhì)。在發(fā)酵的過程中，原料中的微生物利用可溶性糖作為底物，代謝產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致WSC含量的減少。有機(jī)酸的增加造成pH的下降，發(fā)酵后的陳化玉米發(fā)酵液pH低于4.20，抑制了有害細(xì)菌的生長繁殖，有利于粗蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分的保留，這也是本研究中粗蛋白質(zhì)含量變化不顯著的主要原因。據(jù)報道，發(fā)酵可以改變淀粉的理化性質(zhì)，并提高淀粉含量[25]，與本研究的結(jié)果一致，這可能是由于發(fā)酵降低了其他組分的含量，使得淀粉含量升高。

3.3 發(fā)酵對陳化玉米抗氧化能力的影響

在儲藏過程中，由于多不飽和脂肪酸含量較高，玉米容易發(fā)生氧化酸敗，游離脂肪酸氧化生成的過氧化氫會影響過氧化氫酶和過氧化物酶的活性，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化也會導(dǎo)致二者活性的進(jìn)一步下降[26]。此外，過量的自由基含量會抑制動物的生產(chǎn)性能發(fā)揮，甚至危害動物的健康，這大大限制了陳化玉米的使用[27-29]。乳酸菌作為常用的益生菌和青貯接種劑，具有清除自由基、提高機(jī)體抗氧化能力[30]。然而，Ellis等[31]的研究表明，不同的乳酸菌抗氧化能力并不相同。Li等[32]和Zhang等[33]報道了具有抗氧化能力的植物乳桿菌和乳酸片球菌可提高紫花苜蓿青貯料的總抗氧化能力和谷胱甘肽過氧化物酶活性，進(jìn)而提高了發(fā)酵料的抗氧化能力。本研究將鼠李糖乳桿菌作為發(fā)酵的接種劑應(yīng)用于陳化玉米。據(jù)報道，鼠李糖乳桿菌在體外具有類似于抗氧化劑的活性，攝入機(jī)體內(nèi)也能起到對機(jī)體細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用[34-35]。鼠李糖乳桿菌的接種提高了陳化玉米DPPH清除自由基能力、羥基自由基清除能力和還原能力，這與陳永芳等[36]將鼠李糖乳桿菌接種于胡蘿卜汁，提高了其抗氧化能力的結(jié)果一致。這可能是由于鼠李糖乳桿菌細(xì)胞內(nèi)存在的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化酶在發(fā)酵的過程中起到清除自由基的作用，或者是某種發(fā)酵產(chǎn)物具有抗氧化作用，而具體的抗氧化機(jī)制則需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

響應(yīng)面法優(yōu)化陳化玉米的最佳發(fā)酵條件為：含水量41.44%，鼠李糖乳桿菌的接種量7.04×108CFU/g，酸性蛋白酶的添加量0.51%，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時間20 d。發(fā)酵條件優(yōu)化后提高了陳化玉米的營養(yǎng)價值和抗氧化能力。