致病性大腸桿菌感染小鼠氧化損傷模型的建立及其分子機(jī)制研究

魏朝陽(yáng) 尚智援 李春玲 李?；?喬家運(yùn)*

(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384)

致病性大腸桿菌是動(dòng)物生產(chǎn)中常見(jiàn)病原菌之一，該菌定植在動(dòng)物腸道，產(chǎn)生腸毒素，破壞腸上皮結(jié)構(gòu)完整性，損壞腸道屏障功能，間接導(dǎo)致斷奶仔豬腹瀉引起氧化應(yīng)激[1]，腸道屏障受損，病原體擴(kuò)散到其他器官，如增加肝臟酶類(lèi)活性，誘導(dǎo)肝臟損傷[2-3]。大腸桿菌促使蛋氨酸和半胱氨酸代謝并產(chǎn)生具有毒性的同型半胱氨酸，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[4]。氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、免疫功能、腸道菌群組成、腸道形態(tài)和健康狀況造成影響和損害[5-6]。所以，致病性大腸桿菌感染誘導(dǎo)氧化損傷，降低家畜生長(zhǎng)性能，影響?zhàn)B殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。在動(dòng)物生產(chǎn)中，緩解大腸桿菌誘導(dǎo)氧化損傷的常用措施是使用抗氧化飼料添加劑，然而抗氧化飼料添加劑究竟有無(wú)作用以及效果如何我們尚不清楚。所以，利用動(dòng)物氧化損傷模型來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化飼料添加劑的作用效果是最為直觀和可靠的方法。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，致病性大腸桿菌誘導(dǎo)小鼠氧化損傷模型少有報(bào)道，僅在Guo等[7]利用大腸桿菌誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激的模型中，對(duì)小鼠心臟中的谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。利用致病性大腸桿菌建立一種氧化損傷模型，并對(duì)氧化損傷指標(biāo)進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià)就顯得尤為重要。因此，本試驗(yàn)通過(guò)用不同濃度致病性大腸桿菌攻毒小鼠，以期建立一種穩(wěn)定的小鼠氧化損傷模型。

研究表明，大腸桿菌感染小鼠后，其肝臟中的MDA含量及GSH-Px、SOD活性顯著增加[8]。此外，大腸桿菌感染仔豬小腸上皮細(xì)胞后，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放[9]，降低緊密連接蛋白的表達(dá)[10]。通常來(lái)說(shuō)，在酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)中，組織內(nèi)MDA含量及GSH-Px、SOD等活性的變化是衡量機(jī)體氧化系統(tǒng)是否平衡的重要標(biāo)志[11-12]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路和巨自噬系統(tǒng)是2種宿主防御機(jī)制，參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。Nrf2是一種氧化還原性轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)節(jié)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)、GSH-Px、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)和SOD的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受炎癥和氧化應(yīng)激損傷[14]。p62是自噬基因的調(diào)節(jié)因子(編碼基因?yàn)镾QSTM1)[15]，Keap1-Nrf2系統(tǒng)可以與自噬調(diào)節(jié)因子p62結(jié)合并且被磷酸化的p62激活，p62還與核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)相互作用，誘導(dǎo)NF-κB活化，促進(jìn)釋放抗炎因子[16]。有研究表明，p62/Nrf2信號(hào)通路是體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路，可以調(diào)節(jié)抗氧化酶基因的表達(dá)[17]，進(jìn)而緩解氧化損傷。Huang等[18]在膳食中補(bǔ)充蘋(píng)果多酚，增加益生菌和減少大腸桿菌數(shù)量來(lái)改善腸道生物屏障，激活豬模型中的Nrf2/Keap1信號(hào)通路，提高其腸道抗氧化能力。Zhang等[19]研究表明，益生菌激活斷奶仔豬肝臟和空腸Nrf2/Keap1信號(hào)通路，改善仔豬的抗氧化能力。因此，根據(jù)前人研究結(jié)果，本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)血清中MDA含量、GSH-Px、SOD活性以及肝臟和空腸緊密連接蛋白、p62以及Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量等指標(biāo)的變化作為評(píng)判小鼠氧化損傷模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)致病性大腸桿菌誘導(dǎo)小鼠氧化損傷的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

MDA、GSH-Px、SOD酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；核酸提取試劑RNAzol RT購(gòu)自深圳研順生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó)GeneCpoeia公司。

YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，JA2003型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，MLX-204型離心機(jī)(美國(guó)精騏有限公司)，WH-2型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)，Veriti V255249型PCR擴(kuò)增儀(ABI公司)，Light Cycler?480型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Roche公司)，ULTS1368型超低溫冰箱(Thermo公司)。

1.2 菌液制備及培養(yǎng)

試驗(yàn)所用致病性大腸桿菌為產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌，為天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。將10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸粉和10 g氯化鈉溶于1 L蒸餾水中，配制肉湯(LB)液體培養(yǎng)基，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，儲(chǔ)存于4 ℃。固體培養(yǎng)基需在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2%瓊脂粉。將活化的大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，以菌液：甘油(1∶1)按比例配制后保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)前，需用LB固體培養(yǎng)基對(duì)-80 ℃保存的大腸桿菌進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?jì)數(shù)。使用前，用生理鹽水稀釋至3.7×107和3.7×108CFU/mL。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用6～8周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠18只，預(yù)飼3 d后，隨機(jī)分為3組，每組6只。分別進(jìn)行以下處理：空白對(duì)照組(CONT組)，每只灌胃0.2 mL生理鹽水；低劑量組(L-ETEC組)，每只灌胃0.2 mL 3.7×107CFU/mL大腸桿菌菌液；高劑量組(H-ETEC組)，每只灌胃0.2 mL 3.7×108CFU/mL大腸桿菌菌液。

1.4 樣品采集

灌胃大腸桿菌24 h后，收集小鼠眼球血樣，血清分離后置于4 ℃保存，用于檢測(cè)血清MDA含量以及GSH-Px和SOD活性。取血后，采用頸椎脫臼法處死小鼠。在無(wú)菌條件下，采集小鼠肝臟和空腸組織，一部分放于4%多聚甲醛中固定，待用于觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，另一部分用液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，用于檢測(cè)緊密連接蛋白、抗氧化酶、p62以及Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 肝臟和空腸組織切片的制備與觀察

將小鼠肝臟、空腸進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，切片厚3～5 μm處理，再采用蘇木精-伊紅(HE)染色，使用正倒置一體熒光顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察與拍照。

1.5.2 血清MDA含量及抗氧化酶活性的檢測(cè)

嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定血清中MDA含量，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清中SOD活性，采用可見(jiàn)光比色法測(cè)定血清中GSH-Px活性。

1.5.3 肝臟和空腸中抗氧化酶、抗氧化酶信號(hào)通路、緊密連接蛋白以及p62和Nrf2相關(guān)基因mRNA表達(dá)測(cè)定

按照All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)，向定量PCR管中加入10 μL(2×)All-in-One qPCR Mix、3 μL PCR水、3 μL cDNA、4 μL引物(2 μL上游和2 μL下游)，總體積為20 μL?；靹螂x心后，用Light Cycler?480 Real-Time PCR檢測(cè)目的基因mRNA的Ct值，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)[20]作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)HO-1[21]、GSH-Px[22]、緊密連接蛋白1(Claudin1)[20]、超氧化物歧化酶2(SOD2)[21]、超氧化物歧化酶1(SOD1)[23]、緊密連接蛋白8(Claudin8)[24]、閉合蛋白(Occludin)[25]以及閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)[20]mRNA相對(duì)表達(dá)量。p62、Nrf2特異性引物是通過(guò)在NCBI獲取其基因的全序列，使用Primer 5設(shè)計(jì)引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。上述引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

續(xù)表1基因名稱(chēng)Gene names引物序列Primer sequence (5’—3’)產(chǎn)物長(zhǎng)度Product length/bp退火溫度Annealing temperature/℃GenBank登錄號(hào)GenBank accession number核因子E2相關(guān)因子 Nrf2F:CAGTGCTCCTATGCGTGAAR:GCGGCTTGAATGTTTGTC10956NM_010902.4甘油醛-3-磷酸脫氫酶 GAPDHF:GCACAGTCAAGGCCGAGAATR:GCCTTCTCCATGGTGGTGAA15156/62XM_036165840.1

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Excel 2016軟件對(duì)肝臟和空腸目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行初步處理，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。使用Graphpad Prism 8.0制作柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌對(duì)小鼠肝臟和小腸組織病理學(xué)的影響

由圖1可知，CONT組肝細(xì)胞排列整齊，竇間隙寬度適中，胞質(zhì)染色清晰。L-ETEC組竇間隙變寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝組織中出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死。H-ETEC組在肝臟匯管區(qū)出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞聚集，組織中出現(xiàn)片狀壞死，部分肝細(xì)胞水腫，胞核消失(圖1-A、圖1-C、圖1-E)。

CONT組空腸絨毛排列整齊。L-ETEC組絨毛固有層和上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的分離。H-ETEC組絨毛固有層和上皮細(xì)胞分離，絨毛頂端脫落，炎性細(xì)胞出現(xiàn)聚集，腸隱窩深度增加(圖1-B、圖1-D、圖1-F)。

2.2 大腸桿菌對(duì)小鼠肝臟和空腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響

由圖2可知，在肝臟中，與CONT組相比，L-ETEC組的Claudin8 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，OccludinmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，Claudin1、ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)，但有增加趨勢(shì)；H-ETEC組Claudin8、OccludinmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Claudin1、ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)，但有下降趨勢(shì)。與L-ETEC組相比，H-ETEC組Claudin1、Claudin8、Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖2-A～圖2-D)。

圖1 小鼠肝臟和空腸組織切片觀察

在空腸中，與CONT組相比，L-ETEC組的Claudin1、Claudin8 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，Occludin、ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；H-ETEC組的Claudin1、Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而Claudin8 mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。與L-ETEC組相比，H-ETEC組Claudin1、Claudin8、Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)(圖2-E～圖2-H)，此結(jié)果說(shuō)明高劑量的大腸桿菌降低了小鼠空腸的緊密連接蛋白的表達(dá)，破壞了腸道屏障功能。

Claudin 1:緊密連接蛋白1；Claudin 8：緊密連接蛋白8；Occludin:閉合蛋白；ZO-1：閉鎖小帶蛋白-1 zonula occludens-1。

2.3 大腸桿菌對(duì)小鼠血清MDA含量及抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，大腸桿菌感染后，試驗(yàn)組小鼠血清中MDA含量顯著高于CONT組(P<0.05)，且H-ETEC組差異尤為明顯，誘導(dǎo)機(jī)體氧化損傷。H-ETEC組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性顯著低于CONT組、L-ETEC組(P<0.05)，說(shuō)明高劑量的大腸桿菌對(duì)小鼠有明顯的氧化損傷作用。

圖3 大腸桿菌對(duì)小鼠血清MDA含量及抗氧化酶活性的影響

2.4 大腸桿菌對(duì)小鼠p62/Nrf2通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

由圖4可知，在肝臟中，與CONT組相比，L-ETEC組的Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，H-ETEC組的Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖4-A～圖4-B)。在空腸中，L-ETEC組和H-ETEC組的p62和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)(圖4-C～圖4-D)。以上結(jié)果說(shuō)明，大腸桿菌感染有可能抑制肝臟和空腸p62/Nrf2信號(hào)通路，為驗(yàn)證是否抑制，進(jìn)而檢測(cè)下游相關(guān)蛋白因子的表達(dá)。

Nrf2：核因子E2相關(guān)因子 nuclear factor-E2-related factor 2。

2.5 大腸桿菌對(duì)小鼠肝臟和空腸抗氧化酶表達(dá)的影響

由圖5可知，在肝臟中，與CONT組相比，L-ETEC組的HO-1、GSH-Px、SOD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著提高(P<0.05)，而SOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)；H-ETEC組的HO-1、GSH-Px、SOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著提高(P<0.05)，而SOD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。與L-ETEC組相比，H-ETEC組的HO-1、GSH-Px、SOD1、SOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。在空腸中，與CONT組相比，L-ETEC組的HO-1、GSH-Px、SOD1、SOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，與L-ETEC組相比，H-ETEC組的GSH-Px、SOD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，而HO-1、SOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，大腸桿菌感染能夠降低抗氧化酶基因的表達(dá)，且高劑量效果更為明顯。

3 討 論

腸道屏障一方面可以維持腸道菌群的耐受性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，另一方面能夠抵御病原體的入侵[26]。腸道絨毛高度和隱窩深度是決定動(dòng)物機(jī)體腸道吸收、消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵因素，其比值反映腸道功能情況[27]。當(dāng)腸道絨毛高度變短時(shí)，腸道吸收面積減少，腸道通透性增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)，影響機(jī)體正常攝食[28]。Lin等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠感染大腸桿菌后，脾組織白髓區(qū)出現(xiàn)輕度局灶變性、壞死和脾結(jié)節(jié)擴(kuò)張。在新生仔豬模型中，大腸桿菌處理后空腸絨毛高度與隱窩深度降低，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少[30]。與此相似，本試驗(yàn)中，高劑量大腸桿菌感染會(huì)使小鼠空腸絨毛固有層和上皮細(xì)胞分離，炎性細(xì)胞聚集，隱窩深度增加，由此說(shuō)明大腸桿菌感染會(huì)對(duì)小鼠腸道功能造成損傷。

緊密連接是細(xì)胞間的主要連接類(lèi)型，與營(yíng)養(yǎng)吸收和抵抗致病微生物密切相關(guān)[31]。緊密連接蛋白，包括跨膜蛋白(Claudins和Occludin)和胞質(zhì)蛋白(ZO-1、ZO-2、ZO-3)，能夠阻止微生物和毒素的入侵，維持屏障功能的健全性[32-33]。在抗氧化系統(tǒng)與氧化系統(tǒng)失衡的情況下，過(guò)量的活性氧(ROS)可通過(guò)減少緊密連接和細(xì)胞數(shù)量進(jìn)而干擾上皮細(xì)胞的完整性和屏障功能的健全性[34]。據(jù)報(bào)道，大腸桿菌黏附在小腸微絨毛上，能夠誘導(dǎo)小腸形態(tài)學(xué)病變，并產(chǎn)生腸毒素作用于腸細(xì)胞，破環(huán)緊密連接結(jié)構(gòu)，打破物理屏障，允許腸道病原微生物入侵[35-36]。為了探究不同濃度致病性大腸桿菌感染對(duì)小鼠肝臟和空腸細(xì)胞完整性和屏障功能，本試驗(yàn)檢測(cè)了Claudin1、Claudin8、Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。Wu等[37]用產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC K88)攻擊豬小腸上皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Claudin1、Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著降低。Bao等[38]研究表明，海蘭褐雞腹腔注射大腸桿菌后，其肝臟中Claudin1、Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低。本試驗(yàn)中，大腸桿菌感染使空腸中Claudin1、Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，高劑量大腸桿菌感染使小鼠肝臟中Occludin和Claudin8 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，這與前人研究結(jié)果相似。并且高劑量大腸桿菌攻毒小鼠使肝臟和空腸各緊密連接蛋白表達(dá)量均顯著低于低劑量感染，由此說(shuō)明，不同劑量的大腸桿菌均能夠降低小鼠肝臟、空腸部分緊密連接蛋白表達(dá)，破壞其屏障功能，但以高劑量的大腸桿菌對(duì)小鼠的損傷更為明顯。

HO-1：紅素加氧酶-1 heme oxygenase-1；SOD1：超氧化物岐化酶1 superoxide dismutase 1；SOD2：錳超氧化物歧化酶2 manganese superoxide dismutase 2。

MDA屬于脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，能夠直接反映動(dòng)物機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化強(qiáng)度及速率，間接反映組織受自由基損傷程度[39]。GSH-Px是一種抗氧化酶，可以催化過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物還原為水或脂質(zhì)醇[40]。SOD是細(xì)胞內(nèi)最有效的抗氧劑之一，它催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為分子氧和過(guò)氧化氫[41]。正常情況下，MDA、SOD和GSH-Px通常負(fù)責(zé)去除氧離子，過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物來(lái)平衡氧化系統(tǒng)[42]，應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激。Nrf2是轉(zhuǎn)錄激活因子，在響應(yīng)氧化應(yīng)激等許多誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)基因激活中起到關(guān)鍵作用[43]，Nrf2的靶基因參與谷胱甘肽合成、ROS的消除、外源性代謝和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)[44]。當(dāng)機(jī)體受到ROS或活性氮(RNS)積累誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激后，與Keap1結(jié)合的Nrf2會(huì)迅速?gòu)募?xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核，小Maf異構(gòu)體(small Maf heterodimer,sMaf)蛋白二聚化，并通過(guò)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)激活靶基因進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)，這些基因維持氧化平衡，應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激[45-46]。此外，當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過(guò)自噬途徑以減輕損傷來(lái)增加細(xì)胞存活機(jī)會(huì)。調(diào)節(jié)因子p62和Nrf2為正反饋調(diào)節(jié)[47]，當(dāng)機(jī)體發(fā)生自噬時(shí)，p62活性上調(diào)，與Keap1相互作用，激活Nrf2信號(hào)通路，中和過(guò)量的ROS，進(jìn)而達(dá)到氧化平衡狀態(tài)[48]。研究表明，當(dāng)大腸桿菌K88刺激仔豬誘導(dǎo)腸道氧化損傷，腸道中MDA含量提高，SOD、GSH-Px、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性和總抗氧化力(total antioxidant capacity,T-AOC)降低[49]。Dou等[50]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌K88攻毒豬腸上皮細(xì)胞24 h后Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，且細(xì)胞中抗氧化基因的表達(dá)也降低。因此，本試驗(yàn)從抗氧化酶基因的表達(dá)和是否通過(guò)p62/Nrf2信號(hào)通路這2方面進(jìn)行評(píng)定小鼠氧化損傷，尋找致病性大腸桿菌感染的適宜劑量，進(jìn)而較完整地反映小鼠肝臟和空腸的損傷程度，為尋找合適的抗氧化飼料添加劑提供穩(wěn)定的動(dòng)物氧化損傷模型。

本試驗(yàn)中，在小鼠感染致病性大腸桿菌24 h后，小鼠血清MDA含量升高，血清中SOD、GSH-Px活性降低，這與前人研究結(jié)果[51]相似。Dou等[50]通過(guò)ETEC K88刺激豬小腸上皮細(xì)胞誘導(dǎo)氧化損傷，其SOD1和SOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低。本研究在小鼠上同樣得到了證實(shí)，高劑量大腸桿菌感染后，小鼠空腸中的SOD1和SOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低。此外，Guo等[7]在大腸桿菌誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激的模型中，小鼠心臟中的GSH、GSH-Px、SOD和MDAmRNA相對(duì)表達(dá)量在不同時(shí)間段均有不同程度的增加。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量大腸桿菌使小鼠肝臟中HO-1、GSH-Px和SODmRNA相對(duì)表達(dá)量增加，而在空腸中，HO-1和GSH-PxmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，說(shuō)明與肝臟相比，空腸更容易受到氧化應(yīng)激的影響。

Ying等[52]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染牛乳腺上皮細(xì)胞，可以激活Nrf2信號(hào)，并且上調(diào)p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量。本試驗(yàn)研究同樣表明，低劑量大腸桿菌攻毒小鼠后，肝臟中Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著性變化，但有所提高，說(shuō)明低劑量大腸桿菌感染可以誘導(dǎo)小鼠肝臟發(fā)生氧化反應(yīng)。此外，本試驗(yàn)中，感染低劑量的大腸桿菌使空腸中p62和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，肝臟中p62和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量增加；但感染高劑量的大腸桿菌使小鼠肝臟和空腸中p62和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，這與Ding等[53]在大腸桿菌攻毒家禽研究中的血清中MDA含量、GSH-Px活性以及肝臟中SOD活性、Nrf2含量變化一致，Nrf2 mRNA和抗氧化酶相對(duì)表達(dá)量顯著降低。由此說(shuō)明，低劑量大腸桿菌感染能夠誘導(dǎo)小鼠發(fā)生氧化反應(yīng)，而高劑量大腸桿菌感染能夠降低小鼠肝臟和空腸中p62和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，抑制p62/Nrf2信號(hào)通路，進(jìn)而降低抗氧化酶(HO-1、GSH-Px、SOD1、SOD2)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)小鼠腸道氧化損傷，高劑量大腸桿菌感染可通過(guò)p62/Nrf2信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠氧化損傷并成功建立小鼠氧化損傷模型。

4 結(jié) 論

用0.2 mL 3.7×108CFU/mL大腸桿菌菌液灌胃小鼠24 h，血清中MDA含量增加，SOD、GSH-Px活性均降低；肝臟和空腸中HO-1、GSH-Px、SOD1、SOD2、p62和Nrf2基因表達(dá)下降，成功建立了致病性大腸感染小鼠氧化損傷模型，其損傷的分子機(jī)制可能是通過(guò)抑制p62/Nrf2信號(hào)通路，進(jìn)而降低小鼠肝臟、空腸部分緊密連接蛋白及抗氧化酶基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。