大豆皂苷對吉富羅非魚腸道菌群和腸道健康的影響

張 鑫 常恩慧 付 裕 徐 潔 韓 蓓 周梓涵 王安然 苗淑彥

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225000)

近年來，由于魚粉資源短缺和價格上漲等因素導(dǎo)致水產(chǎn)飼料成本不斷上升，尋找魚粉替代物成為水產(chǎn)動物營養(yǎng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。豆粕具有市場供應(yīng)穩(wěn)定、氨基酸組成較為平衡等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)配合飼料[1]，但其中包含的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、皂苷等，在一定程度上會損傷魚類的生長性能、腸道健康和免疫力[2]。例如，Baeverfjord等[3]報道，飼料中添加高水平的豆粕會誘發(fā)大西洋鮭(SalmosalarL.)感染亞急性腸炎；當(dāng)豆粕替代魚粉的量超過50%時，花鱸(Lateolabraxjaponicus)的腸道組織形態(tài)和腸黏膜屏障功能受到損傷[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高水平的豆粕會引起魚類腸道促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)基因表達(dá)量顯著上升，抗炎細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)基因表達(dá)量顯著下降[5-6]。

皂苷是豆粕中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，含量為0.43%～0.67%[7]，但皂苷對魚類攝食及生長的影響在不同種類上的研究結(jié)果卻不盡相同。例如，0.3%的大豆皂苷顯著抑制了大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的采食量和生長[8]，但飼料中添加2%的皂苷活性物卻能夠顯著提高南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)的增重率[9]，1.5%的大豆皂苷也能夠顯著提高鯉魚(CyprinuscarpioL.)的飼料利用效率[10]。此外，大豆皂苷通過破壞腸道黏膜屏障，從而改變腸道上皮細(xì)胞的通透性，并進(jìn)一步誘發(fā)大西洋鮭豆粕性腸炎[11]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，皂苷能夠清除小鼠機(jī)體自由基，防止機(jī)體氧化反應(yīng)的發(fā)生[12-13]，從而增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫能力等[13]。

魚類腸道存在由多種微生物構(gòu)成的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)，是魚類健康和生長發(fā)育的重要因素之一。腸道微生物不但能夠增強(qiáng)宿主的消化吸收能力，而且能夠通過激活腸道免疫系統(tǒng)，促進(jìn)杯狀細(xì)胞的生長和保持腸道黏膜的完整性[14]，從而調(diào)控機(jī)體的免疫防御功能。Reveco等[15]發(fā)現(xiàn)，攝食含20%豆粕的飼料后，大西洋鮭腸道內(nèi)能夠刺激腸道炎癥反應(yīng)的細(xì)菌，如乳球菌屬(Lactococcus)的數(shù)量顯著上升。Miao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中皂苷含量超過70%后，烏鱧(Channaargus)腸道內(nèi)Lactococcus、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和不動桿菌屬(Acinetobacter)的豐度顯著下降，而鯨桿菌屬(Cetobacterium)、浮霉?fàn)罹鷮?Planctomyces)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、熱單胞菌屬(Thermomonas)、紅長命菌屬(Rubrivivax)和肉食桿菌屬(Carnobacterium)的豐度顯著上升。

吉富羅非魚(genetic improved farmed tilapia，GIFT)屬于暖水性魚類，分布于熱帶、亞熱帶，具有生長快、雜食性、免疫力強(qiáng)、抗應(yīng)激能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。研究表明，羅非魚飼料中豆粕替代魚粉蛋白的量超過25%時，會顯著抑制羅非魚的生長和降低飼料利用效率[16]。本研究擬通過測定吉富羅非魚的生長性能、腸道菌群結(jié)構(gòu)、腸道炎癥相關(guān)基因和緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，評估大豆皂苷對其生長性能、腸道菌群和腸道健康的影響，并進(jìn)一步分析大豆皂苷、生長性能、腸道健康相關(guān)基因表達(dá)和腸道菌群間的關(guān)系，為進(jìn)一步了解高含量豆粕飼料對羅非魚生長和健康方面的不利影響提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配方及制作

參考樂貽榮等[17]的研究確定吉富羅非魚的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)及飼料營養(yǎng)水平。以脫脂魚粉為主要蛋白質(zhì)源，配制粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量分別為35%和8%對照組飼料，命名為G1；分別在對照組飼料中添加0.30%和0.60%的大豆皂苷(湖北帝柏化工有限公司，純度為60%)，配制2種添加大豆皂苷飼料，分別命名為G2和G3；另外，用40%的豆粕替代27%的魚粉(替代57.50%的魚粉蛋白)，配制1種添加豆粕飼料，命名為G4。4種試驗飼料等氮等能，其組成及營養(yǎng)水平見表1。所有飼料原料用飼料粉碎機(jī)(HK820，廣東旭朗機(jī)械有限公司)粉碎并過80目網(wǎng)篩。飼料原料混合均勻后分別加入油脂和蒸餾水，通過擠壓機(jī)(F-26Ⅲ，華南理工大學(xué))壓制成形，55 ℃烘至恒重后，制成約2 mm×2 mm的顆粒飼料，于-20 ℃冰箱中保存。根據(jù)Ireland等[7]的報道，豆粕中大豆皂苷含量為0.43%～0.67%，估算本研究中試驗飼料G4的大豆皂苷含量為0.17%～0.27%。各組飼料及飼料原料中的營養(yǎng)成分，包括干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量，參照AOAC(1995)[18]提供的方法測定。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗用魚及養(yǎng)殖管理

試驗用吉富羅非魚幼魚購自廣東農(nóng)業(yè)淡水魚苗養(yǎng)殖基地，為當(dāng)年的同一批健康魚苗。試驗開始前，所有幼魚在揚(yáng)州大學(xué)水產(chǎn)溫室水泥池(2 m×2 m×2 m)中暫養(yǎng)2周以適應(yīng)環(huán)境，期間每天08:00和17:00飽食投喂對照組飼料。正式試驗開始前，所有魚停喂1 d，挑選活力較好、體表無損傷、體質(zhì)量[(1.35±0.04) g]均勻的幼魚480尾，隨機(jī)分配到12個養(yǎng)殖桶(300 L)中，每桶放養(yǎng)40尾魚，每組3桶，共4組。養(yǎng)殖周期為28 d。每天2次(08:00和17:00)投喂試驗飼料。養(yǎng)殖期間，每桶每日換水約1/3，水溫為26～28 ℃，溶解氧濃度在5 mg/L以上，亞硝酸態(tài)氮濃度≤0.09 mg/L，總氨氮濃度≤0.19 mg/L。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

1.3.1 樣品采集

分別于養(yǎng)殖試驗的第14天和第28天采集試驗魚的全腸道樣品，每桶采集3尾，用于測定腸道炎癥相關(guān)基因和緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達(dá)量；另從每桶中采集3尾試驗魚的全腸道樣品，用于測定腸道菌群組成。樣品采集前，用MS-222(20 g/m3)對試驗魚進(jìn)行麻醉，以減少操作應(yīng)激。每組的120條魚逐尾稱重，記錄終末體重(FBW)，計算增重率(WGR)和特定生長率(SGR)。腸道菌群樣本的采集在無菌環(huán)境下進(jìn)行，解剖前使用70%的酒精擦拭魚體，將采集的樣品放入1.5 mL的無菌離心管中。所有樣品采集完立刻置入液氮凍存，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 生長性能指標(biāo)的測定

生長性能指標(biāo)計算公式如下：

WGR(%)=100×(Wt-W0)/W0；SGR(%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t。

式中：W0為初始體重(g)；Wt為終末體重(g)；t為試驗天數(shù)(d)。

1.3.3 基因表達(dá)量的測定

采用北京全式金生物公司的EasyPure RNA Kit試劑盒提取腸道樣品RNA，操作方法按照說明書進(jìn)行。提取RNA后采用北京全式金生物公司的TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒合成cDNA。使用實時熒光定量PCR法對腸道炎癥相關(guān)基因——IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ和緊密連接蛋白相關(guān)基因——閉合蛋白3(claudin 3，CLDN3)、閉合蛋白4(claudin 4，CLDN4)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)、咬合蛋白(occludin，OCLN)的相對表達(dá)量進(jìn)行測定。所用內(nèi)參基因為β-肌動蛋白(β-actin)。引物設(shè)計使用NCBI在線設(shè)計程序，引物序列見表2。實時熒光定量PCR使用ABI 7500Fast Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)和ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行分析。按說明書進(jìn)行操作，擴(kuò)增條件：預(yù)變性，95 ℃ 30 s；擴(kuò)增反應(yīng)(40個循環(huán))，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s。使用2-△△Ct方法[19]分析目的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

表2 實時熒光定量PCR所用引物序列

1.3.4 腸道菌群檢測

采用16S rDNA法對腸道微生物組成進(jìn)行測定[20]。首先，用QIAampDNA試劑盒(QIAGEN,cat#51504)提取腸道微生物DNA，并擴(kuò)增16S rDNA的V3～V4區(qū)域進(jìn)行微生物檢測。然后，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，去除嵌合體后使用USEARCH GLOBAL軟件進(jìn)行生物學(xué)信息分析，根據(jù)97%的相似性生成操作分類單元(OTU)。最后，使用核糖體數(shù)據(jù)庫項目(RDP)分類器(v.2.2)將每個樣本中的OTU分配到不同的分類級別。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

對所有數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用Tukey’s法檢驗比較組間差異顯著性，顯著性水平為P<0.05。使用Excel 2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同飼料對吉富羅非魚生長性能的影響

不同飼料對吉富羅非魚生長性能的影響見表3。羅非魚攝食飼料14 d后，G2、G3組的WGR和SGR顯著低于G1和G4組(P<0.05)，并且G1與G4組無顯著差異(P>0.05)。而羅非魚攝食飼料28 d后，G4組的WGR和SGR顯著高于G1、G2和G3組(P<0.05)，并且G1、G2組之間無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同飼料對吉富羅非魚生長性能的影響

2.2 不同飼料對吉富羅非魚腸道炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

不同飼料對羅非魚腸道炎癥因子基因表達(dá)的影響見圖1。羅非魚攝食飼料14 d后，不同飼料對羅非魚腸道中IL-1β的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05)；G2、G3和G4組腸道中IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量與G1組相比均顯著上升(P<0.05)，且IL-10、IFN-γ和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量在這3組間無顯著差異(P>0.05)；G2和G3組腸道中IL-8的mRNA相對表達(dá)量顯著高于G4組(P<0.05)；另外，G2、G3和G4組腸道中TGF-β的mRNA相對表達(dá)量與G1組相比顯著下降(P<0.05)。羅非魚攝食飼料28 d后，腸道中IL-1β的mRNA相對表達(dá)量各組間無顯著差異(P>0.05)；G4組腸道中IL-8、IL-10和IFN-γ的mRNA相對表達(dá)量顯著高于其余3組(P<0.05)，而TGF-β的mRNA相對表達(dá)量則顯著低于其余3組(P<0.05)；對腸道中TNF-α的mRNA相對表達(dá)量來說，G3組最高，其次為G2組，再其次為G4組，G1組最低，且G2、G3組顯著高于G1、G4組(P<0.05)，G4組也顯著高于G1組(P<0.05)。

2.3 不同飼料對吉富羅非魚腸道緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

不同飼料對吉富羅非魚腸道緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響見圖2。羅非魚攝食飼料14 d后，不同飼料對腸道中CLDN3和OCLN的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05)；G2和G3組腸道中CLDN4的mRNA相對表達(dá)量顯著高于G1、G4組(P<0.05)，G4組也顯著高于G1組(P<0.05)；與G1組相比，G2、G3和G4組腸道中ZO-1的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，且這3組間無顯著差異(P>0.05)。羅非魚攝食飼料28 d后，腸道中OCLN的mRNA相對表達(dá)量各組間無顯著差異(P>0.05)；G4組腸道中CLDN4的mRNA相對表達(dá)量顯著高于其余3組(P<0.05)，而ZO-1的mRNA相對表達(dá)量則顯著低于其余3組(P<0.05)；G2和G3組的CLDN3的mRNA相對表達(dá)量顯著高于其余2組(P<0.05)。

2.4 不同飼料對吉富羅非魚腸道菌群組成的影響

羅非魚腸道菌群屬水平組成見圖3，從羅非魚腸道內(nèi)共檢測出12個菌門，優(yōu)勢菌門為梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。

羅非魚攝食飼料14 d后，腸道菌群中35.21%～48.67%為Fusobacteria、20.04%～36.62%為Proteobacteria、3.08%～13.79%為Actinobacteria，0.01%～16.25%為Bacteroidetes，0.08%～9.53%為Firmicutes。G2和G4組Fusobacteria的相對豐度高于G1、G3組；G3組Bacteroidetes的相對豐度明顯高于其余3組；G4組Proteobacteria的相對豐度最高；G1組Actinobacteria和Firmicute的相對豐度高于其余3組。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

圖2 不同飼料對吉富羅非魚腸道緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

羅非魚攝食飼料28 d后，羅非魚腸道菌群中41.99%～95.35%為Fusobacteria，4.23%～24.29%為Proteobacteria，0.07%～17.81%為Actinobacteria，0.06%～6.47%為Bacteroidetes，0～2.01%為Firmicutes。大豆皂苷的添加使G2和G3組羅非魚腸道菌群中Actinobacteria、Proteobacteria的相對豐度降低，而Fusobacteria的相對豐度上升。G2、G3和G4組Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度明顯低于G1組。

另外，隨著養(yǎng)殖時間的延長，除G1組外，其余各組羅非魚腸道菌群中Fusobacteria的相對豐度明顯上升；除G2組外，其余各組羅非魚腸道菌群中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度明顯下降。

G1-14：G1組第14天；G1-28：G1組第28天；G2-14：G2組第14天；G2-28：G2組第28天；G3-14：G3組第14天；G3-28：G3組第28天；G4-14：G4組第14天；G4-28：G4組第28天。圖4同。

羅非魚腸道菌群屬水平組成見圖4，共從羅非魚腸道內(nèi)共檢測出40個菌屬，優(yōu)勢菌屬為Cetobacterium、Aurantimicrobium、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、Reyranella和Bacillus。

羅非魚攝食飼料14 d后，腸道菌群中29.19%～50.11%為Cetobacterium，2.64%～16.62%為Aurantimicrobium，0.12%～6.01%為Mycobacterium，0.11%～15.90%為Reyranella，0.02%～12.81%為Bacillus。G2、G3和G4組Cetobacterium的相對豐度均高于G1組，并且以G4組最高；Mycobacterium、Bacillus、Pseudorhodoplanes和Luteolibacter的相對豐度隨著大豆皂苷和豆粕的添加而降低。

羅非魚攝食飼料28 d后，腸道菌群中32.63%～85.35%為Cetobacterium，0.02%～12.5%為Aurantimicrobium，0.02%～6.70%為Mycobacterium，0.18%～9.22%為Reyranella，0～2.85%為Bacillus。大豆皂苷的添加使羅非魚腸道菌群中Cetobacterium的相對豐度上升；G2組Reyranella和Mycobacterium的相對豐度明顯高于其他3組。

另外，G1、G3和G4組羅非魚腸道菌群中Cetobacterium的相對豐度隨著養(yǎng)殖時間的延長而上升；G1和G2組羅非魚腸道菌群中Aurantimicrobium的相對豐度隨著養(yǎng)殖時間的延長而上升，G3和G4組的變化則相反；隨著養(yǎng)殖時間的延長，G2、G3和G4組羅非魚腸道菌群中Bacillus的相對豐度均呈下降趨勢。

2.5 大豆皂苷與吉富羅非魚腸道炎癥相關(guān)基因、緊密連接蛋白相關(guān)基因以及腸道菌群的相關(guān)性分析

圖5為大豆皂苷與羅非魚腸道炎癥相關(guān)基因、緊密連接蛋白相關(guān)基因以及腸道菌群之間相關(guān)性分析熱圖。

在第14天，大豆皂苷添加量與IL-8、IFN-γ、IL-10、CLDN4和OCLN的mRNA相對表達(dá)量呈正相關(guān)，與IL-1β、TNF-α呈較強(qiáng)的正相關(guān)，與TGF-β和ZO-1的mRNA相對表達(dá)量呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)；大豆皂苷添加量與軟壁菌門(Tenericutes)、醋桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度呈較強(qiáng)的正相關(guān)，與藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、Aurantimicrobium、Reyranella、紅桿菌屬(Rhodobacter)、包西氏菌屬(Bosea)、喬治菌屬(Georgenia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、布赫納氏菌屬(Buchnera)、鞘脂單胞菌屬(Sphingopyxis)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)和糞桿菌屬(Faecalibacterium)的相對豐度呈正相關(guān)，與Mycobacterium、Bacillus、Pseudorhodoplanes、Luteolibacter、未定義菌屬(unidentified_g_Bacteria)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、Phreatobacter、小梨形菌屬(Pirellula)、微桿菌屬(Microbacterium)、Aquicella、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、土壤絲菌屬(Nocardia)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)和土微菌屬(Pedomicrobium)的相對豐度呈負(fù)相關(guān)。

圖4 不同飼料對羅非魚腸道菌群屬水平組成的影響

在第28天，大豆皂苷添加量與IL-1β、IFN-γ和CLDN4的mRNA相對表達(dá)量呈正相關(guān)，與TGF-β、TNF-α、CLDN3和ZO-1呈較強(qiáng)的正相關(guān)性，與IL-8和OCLN的mRNA相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；大豆皂苷添加量與Bacteroidetes、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Firmicutes、Actinobacteria和Chloroflexi的相對豐度呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，與Fusobacteria、Tenericutes和鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、支原體屬(Mycoplasma)的相對豐度呈較強(qiáng)的正相關(guān)，同時與Rhodobacter、Pseudorhodoplanes、Luteolibacter、unidentified_g_Bacteria、Legionella、林桿菌屬(Alsobacter)、Pirellula、Microbacterium、Aquicella、Hyphomicrobium、Pedomicrobium、Methyloversatilis的相對豐度呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，與Bosea、Aurantimicrobium的相對豐度呈負(fù)相關(guān)。

3 討 論

3.1 大豆皂苷對吉富羅非魚生長性能的影響

研究表明飼料中添加大豆皂苷對魚類的生長性能有不利影響[8,11]。本研究中，在飼養(yǎng)14 d時，飼料中添加大豆皂苷顯著降低了羅非魚的WGR和SGR，生長性能受到不利影響。然而，在飼養(yǎng)28 d時，攝食大豆皂苷的羅非魚生長性能高于對照組。Chen等[21]用含0.32%大豆皂苷的飼料飼養(yǎng)牙鲆(Paralichthysolivaceus)也發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)28 d后牙鲆的攝食和生長受到顯著抑制，而飼養(yǎng)56 d后牙鲆的生長性能及攝食率與對照組無顯著差異。這說明大豆皂苷對羅非魚生長性能的影響與養(yǎng)殖周期密切相關(guān)。

5-1：大豆皂苷與腸道炎癥相關(guān)基因、緊密連接蛋白相關(guān)基因的相關(guān)性 the correlation of soyasaponins and intestinal inflammation and tight junction protein related genes；5-2：大豆皂苷與腸道菌群(門水平)的相關(guān)性 the correlation of soyasaponins and intestinal flora (phylum level)；5-3：大豆皂苷與腸道菌群(屬水平)的相關(guān)性 the correlation of soyasaponins and intestinal flora (genus level)。

3.2 大豆皂苷對吉富羅非魚腸道炎癥因子的影響

腸黏膜因子是魚類黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，包括白細(xì)胞介素(ILs)、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRFs)和腫瘤壞死因子(TNFs)等[22]。研究表明，TNF-α、IFN-γ和IL-8可以誘導(dǎo)體內(nèi)粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞募集到炎癥部位，并進(jìn)一步產(chǎn)生更多的炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[23]。作為抗炎因子，IL-10和TGF-β在腸道黏膜免疫反應(yīng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[24-25]。當(dāng)腸道受到炎癥應(yīng)激時，炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)呈現(xiàn)一定程度的變化。例如，飼料中添加豆粕易誘發(fā)大西洋鮭腸道炎癥，同時TGF-β的基因表達(dá)量顯著降低[26]。在本試驗的第14天，飼料中的大豆皂苷和豆粕均顯著上調(diào)了羅非魚腸道中促炎因子基因的表達(dá)，包括IL-8、IFN-γ和TNF-α，顯著下調(diào)了抗炎因子TGF-β基因的表達(dá)，并且基因的mRNA相對表達(dá)量與大豆皂苷添加量均有較大的相關(guān)性。Gu等[27]在飼料中添加大豆皂苷后發(fā)現(xiàn)，大豆皂苷顯著增加了大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚腸道IL-1β和IL-8的基因表達(dá)，在一定程度上損傷了腸道的屏障功能，并進(jìn)一步誘導(dǎo)了大菱鲆腸炎的發(fā)生。這與本研究結(jié)果一致，說明羅非魚攝食大豆皂苷后，腸道中抗炎因子與促炎因子受到顯著影響，腸道健康受到損傷，從而對羅非魚生長產(chǎn)生不利影響。然而，試驗第28天時，添加大豆皂苷組羅非魚腸道IL-8、IFN-γ、ZO-1和CLDN3的mRNA相對表達(dá)量與對照組無顯著差異CLDN4的mRNA相對表達(dá)量顯著上升，同時IL-8、ZO-1和CLDN3的mRNA相對表達(dá)量與大豆皂苷添加量的相關(guān)性與試驗第14天時相反，也說明大豆皂苷對羅非魚腸道健康的影響與養(yǎng)殖周期密切相關(guān)。

3.3 大豆皂苷對吉富羅非魚腸道緊密連接蛋白的影響

一般來說，引起炎癥性腸道疾病的重要原因是緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞[28]。腸道緊密連接結(jié)構(gòu)由4種跨膜蛋白[OCLN、閉合蛋白(claudins，CLDNs)、緊密連接黏附分子(JAM)、tricellulin]和胞質(zhì)分子閉合小環(huán)蛋白閉鎖小帶蛋白(Zos)等組成，在維持腸道上皮細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)、控制腸道通透性方面發(fā)揮重要作用[29]。在本研究中，攝食飼料的第14天，添加大豆皂苷組羅非魚腸道內(nèi)緊密連接蛋白ZO-1的mRNA相對表達(dá)量與對照組相比顯著下降，與大豆皂苷添加量有呈負(fù)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和IFN-γ可以分別通過MLCK轉(zhuǎn)錄[30]和巨噬細(xì)胞胞飲作用[31-32]誘導(dǎo)OCLN的內(nèi)吞，因此在一定程度上加劇了由于大豆皂苷添加而導(dǎo)致的腸道緊密連接的損傷[11]，這說明本研究中羅非魚腸道OCLN的mRNA相對表達(dá)量與大豆皂苷添加量一直有較強(qiáng)的相關(guān)性。以上結(jié)果也表明，隨著飼料中大豆皂苷添加量的增加，羅非魚腸道屏障功能和腸道健康受到的損傷程度更大。

3.4 大豆皂苷對吉富羅非魚腸道菌群的影響

健康的腸道微生物區(qū)系對于促進(jìn)宿主腸道結(jié)構(gòu)和健康狀態(tài)至關(guān)重要[33]。本研究結(jié)果表明，羅非魚腸道優(yōu)勢菌門為Fusobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes。需要注意的是，本試驗中攝食添加大豆皂苷飼料14 d后，羅非魚腸道中Fusobacteria的相對豐度顯著增加，28 d后成為羅非魚腸道中的主要優(yōu)勢菌門，并且與飼料中皂苷添加量呈現(xiàn)極高的正相關(guān)性。據(jù)報道，人和大鼠腸道中的擬桿菌屬(Bacteroides)和梭桿菌屬(Fusobacterium)等能夠代謝人參皂苷成分[34-35]。此外，添加大豆皂苷組羅非魚腸道內(nèi)Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度降低，在第28天時與大豆皂苷添加量呈現(xiàn)出較大的負(fù)相關(guān)性，這與在人類炎癥性腸病患者腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的情況[36]相似。杜敏[37]發(fā)現(xiàn)，Bacteroidetes中的雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、Lactobacillus等有益菌可以改善肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡，維持腸道健康。而Mycobacterium豐度的上升[38]和Bifidobacteria豐度的下降[39]是炎癥性腸病(IBD)發(fā)生的重要因素。在本研究中，添加大豆皂苷組Mycobacterium的相對豐度顯著下降，在第14天與大豆皂苷添加量有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，但在第28天后相關(guān)性降低，這說明羅非魚攝食一定時間的添加大豆皂苷飼料后，其腸道菌群組成發(fā)生改變，從而影響腸道健康。Firmicutes是影響免疫的關(guān)鍵微生物區(qū)系[40]。Hu等[41]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中分別添加大豆異黃酮和大豆皂苷后，黃鱔(Monopterusalbus)腸道內(nèi)Firmicutes和Proteobacteria的豐度均降低。這與本研究結(jié)果相似，因此認(rèn)為大豆皂苷影響了羅非魚的腸道菌群結(jié)構(gòu)，并可能是導(dǎo)致腸道炎癥發(fā)生的主要原因。

3.5 豆粕對吉富羅非魚腸道炎癥因子、緊密連接蛋白以及腸道菌群的影響

本研究中添加豆粕飼料中大豆皂苷含量為1.72～2.68 g/kg DM。添加豆粕組羅非魚腸道中IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、TGF-β等基因的表達(dá)變化趨勢在第14天與添加大豆皂苷組(大豆皂苷含量分別為1.8、3.6 g/kg DM)一致，在第28天的表達(dá)變化趨勢卻與其他3組相反，同時腸道緊密連接蛋白基因的表達(dá)變化趨勢也是如此，推測這可能是豆粕中其他抗?fàn)I養(yǎng)因子導(dǎo)致的。據(jù)報道，大豆原料中固有的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如蛋白酶抑制因子、大豆凝集素和植酸等，能夠通過改變魚類腸道黏膜形態(tài)和通透性，顯著降低飼料中蛋白質(zhì)的利用率[42]。Buttle等[43]研究表明，攝食含大豆凝集素的飼料84 d后，大豆凝集素在大西洋鮭、虹鱒魚體內(nèi)能夠與腸道上皮細(xì)胞結(jié)合，從而導(dǎo)致魚類腸道的病理性變化。本研究表明，隨著養(yǎng)殖時間的延長，添加豆粕組羅非魚腸道菌群表現(xiàn)出相同的趨勢，以Fusobacteria為主要菌門，Cetobacterium為主要菌屬，同時在門和屬水平上腸道菌群多樣性均顯著降低。本試驗中添加豆粕組優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬的占比要高于添加大豆皂苷組，菌群多樣性低于添加大豆皂苷組。這可能是因為豆粕中其他抗?fàn)I養(yǎng)因子發(fā)揮著與大豆皂苷類似的作用。然而，攝食添加豆粕飼料28 d后，羅非魚生長性能并沒有受到負(fù)面影響，其WGR和SGR較對照組顯著上升。由此推斷，豆粕替代飼料中27%的魚粉對羅非魚的生長性能具有促進(jìn)作用，但對其腸道健康依然有不利影響。

4 結(jié) 論

在本試驗中，飼料中添加大豆皂苷和豆粕后，吉富羅非魚腸道中促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-8的mRNA相對表達(dá)量顯著上調(diào)，抗炎因子TGF-β的mRNA相對表達(dá)量顯著下調(diào)，緊密連接蛋白ZO-1的mRNA相對表達(dá)量顯著下降；羅非魚腸道菌群中Fusobacteria的相對豐度升高，Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度下降；并且，腸道炎癥和緊密連接蛋白相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量和菌群的相對豐度都與大豆皂苷添加量有一定的相關(guān)性。但隨著養(yǎng)殖時間的延長，吉富羅非魚對大豆皂苷表現(xiàn)出一定的耐受性。豆粕替代飼料中27%的魚粉(替代57.5%的魚粉蛋白)對吉富羅非魚生長性能具有促進(jìn)作用，但對其腸道健康依然有不利影響。