復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清激素含量、糞便微生物及消化酶活性的影響

丁亞偉 郭云霞 王海玉 楊彩虹 田星哲 徐艷輝 段春輝**嚴(yán) 慧 紀(jì)守坤 劉月琴 張英杰

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定071000)

羔羊哺乳期的生長發(fā)育對斷奶重及后續(xù)育肥性能有重要影響。而哺乳羔羊飼養(yǎng)管理不當(dāng)會影響胃腸道發(fā)育，降低飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化利用率，腹瀉率居高不下，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益。因此，通過營養(yǎng)調(diào)控方式促進(jìn)哺乳羔羊胃腸道發(fā)育，提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率、降低腹瀉是目前推動我國養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的根本途徑。發(fā)酵飼料含有大量乳酸菌、有機酸、活性肽、寡聚糖等代謝產(chǎn)物，可增加飼料適口性和營養(yǎng)價值，利于幼齡動物的消化吸收[1]。同時，低pH和高有機酸會降低腸道沙門氏菌的數(shù)量[2]，增加乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量[3]，有益于腸道菌群平衡，降低腹瀉率。農(nóng)業(yè)部公布的微生物添加制劑有乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和霉菌四大類，與單一菌種相比，在發(fā)酵過程中常選用多菌種發(fā)酵，通過菌種之間互補或者協(xié)同作用可以彌補單一菌種的短板，應(yīng)用效果較好[4]。研究表明，仔豬飼喂益生菌發(fā)酵豆粕后，腸道內(nèi)容物放線菌門、厚壁菌門和變形菌門相對豐度顯著升高，梭菌屬和擬桿菌屬的相對豐度顯著下降，腹瀉率顯著降低[5]。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料可降低動物有害氣體的排放[6]，同時飼料酸化可防止霉變、抑制有害菌生長，進(jìn)而減弱大腸桿菌及其他腐敗菌的活力[7]，減少蛋白質(zhì)向氨和胺的轉(zhuǎn)化[8]，同時可將部分的臭源化合物氧化成無臭物質(zhì)，從而降低糞便中有害氣體排放，改善飼養(yǎng)環(huán)境[9]。當(dāng)前，益生菌發(fā)酵飼料的研究多集中于單胃動物，在對幼齡反芻動物上的研究鮮有報道。基于此，本試驗以玉米-豆粕型飼料原料為發(fā)酵底物，以乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌為復(fù)合菌種制備發(fā)酵飼料，旨在研究添加不同比例發(fā)酵飼料對哺乳羔羊營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清生長相關(guān)激素含量和糞便消化酶活性、氨氣含量、微生物菌群數(shù)量的影響，以期為復(fù)合益生菌固體發(fā)酵飼料在羔羊培養(yǎng)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

本試驗在衡水市武邑縣志豪畜牧科技有限公司進(jìn)行，試驗時間為2021年8—10月。

1.2 發(fā)酵飼料制備

乳酸桿菌RSG-1(CGMCC22061，≥108CFU/mL)、枯草芽孢桿菌B-1(CGMCC22064，≥108CFU/mL)、地衣芽孢桿菌Y5-39(CGMCC22062，≥108CFU/mL)分別在MRS和NB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)Design 11.0軟件中Mixture模型設(shè)計益生菌單獨及不同復(fù)合比例發(fā)酵，測定發(fā)酵后飼料可溶性蛋白含量確定最佳比例是1∶1∶4，所有菌株由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物醫(yī)藥系分離并保存。發(fā)酵底物是由玉米粉、豆粕和麩皮(6.0∶2.5∶1.5)組成，按照發(fā)酵溫度30 ℃，接種量10%，含水量45%，在25 kg發(fā)酵袋發(fā)酵14 d，開封后發(fā)酵料在室溫放置14 d可保證最佳飼用效果。發(fā)酵飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 發(fā)酵飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 飼養(yǎng)試驗

選擇體重為(6.80±0.30) kg的15日齡湖羊羔羊48只(公母各占1/2)，按照體重和性別隨機分為4組，每組12個重復(fù)，每個重復(fù)1只羊，所有羔羊隨母哺乳并補飼開食料，試驗1、2、3和4組分別飼喂含有0、5%、10%和15%發(fā)酵飼料的開食料。試驗飼糧根據(jù)等能等氮原則，參照NRC(2007)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制，飼喂羔羊前將發(fā)酵飼料與開食料混合均勻后飼喂，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。預(yù)試期5 d，正試期40 d，羔羊60日齡斷奶。斷奶當(dāng)天所有羔羊頸靜脈采血5 mL，4 000 r/min離心20 min，收集上層血清測定生長激素(GH)、胰島素(INS)和胰島素生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量，同時利用直腸采糞法采集新鮮糞便，測定消化酶活性、微生物菌群數(shù)量和氨氣(NH3)含量。

試驗開始前對羊舍進(jìn)行打掃消毒及驅(qū)蟲，試驗期間每15 d對羊舍四周及地面進(jìn)行消毒。試驗羔羊在母子圈飼養(yǎng)，母羊無法進(jìn)入羔羊圈舍，羔羊可自由出入，所有羔羊斷奶前隨母哺乳加補飼開食料，斷奶后繼續(xù)飼喂哺乳期開食料。正試期間試驗羊每日07:00和17:00飼喂2次，羔羊自由采食與飲水。

表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3.2 消化試驗

羔羊60日齡斷奶后每組隨機選取3只體重相近、健康的羔羊進(jìn)行消化試驗，試驗羊每只于代謝籠中室內(nèi)飼養(yǎng)，預(yù)試期4 d，正試期3 d，試驗期間自由飲水與采食，正試期間每日08:00前利用全收糞法收集新鮮糞便進(jìn)行稱重計為前1 d的排糞量，將每日收集新鮮糞樣去除羊毛和其他雜物，一部分按每100 g糞樣加5 mL體積分?jǐn)?shù)10%硫酸固氮，用于測定粗蛋白質(zhì)(CP)含量，另一部分不做處理，用于總能(GE)及中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量測定。同時收集試驗羊飼糧樣品，并記錄羔羊的給料量和剩料量，計算羔羊每日采食量。試驗結(jié)束后，將3 d采集的飼糧與糞樣分別混合，于-20 ℃冷凍保存待測。

1.4 樣品采集及測定方法

1.4.1 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

飼糧和糞樣解凍后放入65 ℃烘箱內(nèi)烘干48 h，回潮24 h稱重，經(jīng)粉碎過16和40目網(wǎng)篩制成分析樣品，參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[10]測定樣品中CP、粗脂肪(EE)、干物質(zhì)(DM)、鈣(Ca)、總磷(TP)、NDF、ADF含量和GE。某營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率計算公式如下：

某營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100×(食入
該營養(yǎng)物質(zhì)含量-糞中該營養(yǎng)物質(zhì)含量)/
食入該營養(yǎng)物質(zhì)含量。

1.4.2 血清GH、INS和IGF-Ⅰ含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定血清中GH(檢測范圍0.2～10.0 ng/mL)、INS(檢測范圍5 ～100 mIU/L)、IGF-Ⅰ(檢測范圍15～600 μg/L)含量。試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司。

1.4.3 糞便消化酶活性測定

直腸糞樣采用比色法測定糞便中α-淀粉酶(α-AL)、脂肪酶(LPS)和纖維素酶(CL)活性，采用微板法測定糞便中胰蛋白酶(Try)活性。以上試劑盒均購自睿信生物科技有限公司。

1.4.4 糞便NH3含量測定

新鮮直腸糞樣置于500 mL磨口玻璃瓶中，37 ℃下發(fā)酵2 d。參照魯琳等[11]中納氏試劑比色法測定糞樣中NH3含量，用內(nèi)裝10 mL吸收液的大氣采樣器抽取100 mL氣體，速度小于0.1 L/min，采氣5 L，然后經(jīng)0.005 mol/L硫酸溶液進(jìn)行吸收，采樣10 min后使用分光光度計于波長425 nm處比色。NH3含量計算公式如下：

C=(A-A0)Bs/V0。

式中：C為糞便中氨氣含量(mg/m3)；A為樣品溶液吸光度；A0為空白溶液吸光度；Bs為計算因子(μg/吸光度)，是標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)；V0為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下采樣體積(L)。

1.4.5 糞便微生物菌群數(shù)量測定

直腸糞樣采用平板計數(shù)法測定乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量。乳酸桿菌采用MRS培養(yǎng)基，雙歧桿菌采用BBL培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行計數(shù)。大腸桿菌采用EMB培養(yǎng)基，沙門氏菌采用SS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行計數(shù)。菌落數(shù)量單位以每克糞便中所含菌落形成的對數(shù)[lg(CFU/g)]表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 22.0軟件中one-way ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01為差異極顯著，以P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表3可知，試驗3組羔羊DM采食量顯著高于試驗4組(P<0.05)，極顯著高于試驗1組(P<0.01)，與試驗2組無顯著差異(P>0.05)；試驗2組顯著高于試驗1組(P<0.05)，與試驗4組無顯著差異(P>0.05)；試驗1和4組DM采食量無顯著差異(P>0.05)。各組間DM表觀消化率無顯著差異(P>0.05)。試驗3組食入氮和消化氮顯著高于試驗2和4組(P<0.05)，極顯著高于試驗1組(P<0.01)；試驗2和4組顯著高于試驗1組(P<0.05)。各組糞氮無顯著差異(P>0.05)。試驗3組羔羊CP表觀消化率顯著高于試驗2組(P<0.05)，極顯著高于1組(P<0.01)，與試驗4組無顯著差異(P>0.05)；試驗2和4組羔羊CP表觀消化率顯著高于試驗1組(P<0.05)。試驗3組GE攝入量顯著高于試驗1和2組(P<0.05)，極顯著高于試驗4組(P<0.01)，試驗4組顯著低于試驗1和2組(P<0.05)。試驗3組消化能顯著高于試驗2組(P<0.05)，極顯著高于1和4組(P<0.01)，試驗2組顯著高于1組(P<0.05)，極顯著高于4組(P<0.01)；試驗1組顯著高于4組(P<0.05)。試驗2和3組糞能顯著低于試驗1和4組(P<0.05)，GE表觀消化率顯著高于試驗1和4組(P<0.05)。試驗2和3組間、試驗1和4組間糞能和GE表觀消化率無顯著差異(P>0.05)。試驗2和3組羔羊NDF表觀消化率顯著高于試驗1組(P<0.05)，與試驗4組無顯著差異(P>0.05)。試驗2和3組ADF表觀消化率顯著高于試驗1和4組(P<0.05)。試驗2與3組間、試驗1與4組間ADF和NDF表觀消化率無顯著差異(P>0.05)。

表3 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊營養(yǎng)物質(zhì)攝入量和表觀消化率的影響

2.2 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊血清中GH、IGF-Ⅰ和INS含量的影響

由表4可知，試驗3組血清GH和IGF-Ⅰ含量顯著高于試驗1組(P<0.05)，與試驗2和4組無顯著差異(P>0.05)；試驗1、2和4組間無顯著差異(P>0.05)。試驗2、3和4組間羔羊血清INS含量無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于試驗1組(P<0.05)。

表4 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊血清中GH、INS和IGF-Ⅰ含量的影響

2.3 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊糞便中消化酶活性的影響

由表5可知，試驗2、3和4組糞便CL活性顯著高于試驗1組(P<0.05)。試驗3組糞便LPS和Try活性顯著高于試驗2和4組(P<0.05)，極顯著高于試驗1組(P<0.01)，試驗2和4組顯著高于試驗1組(P<0.05)，但試驗2和4組間無顯著差異(P>0.05)。試驗3組糞便α-AL活性顯著高于試驗2和4組(P<0.05)，極顯著高于試驗1組(P<0.01)，試驗4組顯著高于試驗1組(P<0.05)，與試驗2組無顯著差異(P>0.05)，試驗1和2組間糞便α-AL活性無顯著差異(P>0.05)。

表5 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊糞便中消化酶活性的影響

2.4 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊糞便中氨氣含量的影響

由表6可知，試驗3和4組糞便氨氣含量顯著低于試驗1組(P<0.05)，與試驗2組無顯著差異(P>0.05)，試驗1和2組間氨氣含量無顯著差異(P>0.05)。

表6 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊糞便氨氣含量的影響

2.5 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊糞便中微生物數(shù)量的影響

由表7可知，試驗4組糞便乳酸桿菌數(shù)量顯著高于試驗1組(P<0.05)，與試驗2和3組無顯著差異(P>0.05)，試驗1、2和3組間無顯著差異(P>0.05)。試驗3和4組糞便雙歧桿菌數(shù)量顯著高于試驗1和2組(P<0.05)，試驗1與2組間、試驗3與4組間無顯著差異(P>0.05)。試驗2、3和4組糞便大腸桿菌數(shù)量均顯著低于試驗1組(P<0.05)。試驗3和4組糞便沙門氏菌數(shù)量均顯著低于試驗1組(P<0.05)，與試驗2組無顯著差異(P>0.05)，試驗1和2組間無顯著差異(P>0.05)。

表7 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊糞便中微生物數(shù)量的影響

3 討 論

3.1 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊采食量和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

DM對動物的生長發(fā)育十分重要，采食更多的DM就意味著有更多的營養(yǎng)攝入[12]。張海濤[13]研究表明，哺乳犢牛飼糧中添加芽孢桿菌后采食量顯著提高，分析原因可能是芽孢桿菌進(jìn)入犢牛胃腸道定植，改變了相關(guān)酶的活性，進(jìn)而提高了采食量，也可能是由于芽孢桿菌的特殊酸味提高了犢牛食欲，從而影響采食量。薛晨[14]研究表明，微生物發(fā)酵飼料中代謝產(chǎn)物為瘤胃微生物生長提供底物，促進(jìn)乳酸利用菌增殖，降低pH，賦予飼料酸香味，刺激食欲，可顯著提高0～2月齡哺乳犢牛的采食量。白培鈿等[15]研究表明，添加0.2%益生菌復(fù)合制劑(乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌)顯著提高了28日齡斷奶仔豬的采食量和日增重，0.1%和0.3%益生菌劑未能使采食量和日增重達(dá)到預(yù)期結(jié)果，表明適宜劑量的益生菌可顯著提高生長性能，添加量過高可能過度降低飼糧pH，腸道未能適應(yīng)，影響適口性與采食量。本研究結(jié)果表明，5%、10%和15%組羔羊的DM采食量分別比對照組分別提高了14.62%、20.64%和9.38%，表明添加發(fā)酵飼料可影響羔羊的適口性和采食量。而10%組比5%組顯著提高7.05%，比15%組顯著提高12.43%，說明羔羊采食量不隨發(fā)酵飼料添加比例增加而增加，可能是由于高比例發(fā)酵飼料中酸度大導(dǎo)致適口性降低，從而使采食量降低。因此，在本試驗條件下哺乳羔羊開食料中添加發(fā)酵飼料的最佳添加量為10%。

飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率既能反映動物的消化能力，也是評價動物生長性能的參考。益生菌發(fā)酵飼料可降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子，其含有的消化酶等代謝產(chǎn)物可提高幼齡動物營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率[16-19]。反芻動物氮平衡是研究動物對蛋白質(zhì)利用的指標(biāo)，飼糧氮平衡可提高蛋白質(zhì)消化利用率、減少氮的排放[20]。Higgins等[21]研究表明，乳酸菌通過益生作用把飼糧中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解為可吸收利用的小分子肽和游離的氨基酸，提高機體食入氮含量，降低糞氮的排放，從而達(dá)到提高氮利用率的效果。本研究結(jié)果表明，各組食入氮的大小關(guān)系為10%組>5%組>15%組>0組(對照組)，與羔羊DM采食量結(jié)果相一致。而5%、10%和15%組消化氮分別比對照組顯著提高了19.44%、32.02%和18.57%，表明發(fā)酵飼料利于瘤胃微生物對氮的利用，促進(jìn)微生物蛋白合成，這可能是因為益生菌在胃腸道定植后具有一定固氮能力，增加了含氮物質(zhì)的吸收和利用，減少糞中氮排出[22]；或是發(fā)酵飼料組的食入氮增加與糞氮的相對穩(wěn)定提高氮的消化有關(guān)[23]。各組飼糧CP表觀消化率的關(guān)系為10%組>15%組>5%組>對照組，與糞便Try活性增加規(guī)律一致，表明發(fā)酵飼料可通過影響羔羊腸道胰蛋白酶活性提高CP表觀消化率，分析原因：一是發(fā)酵飼料本身由于微生物代謝可分泌多種蛋白酶[24]，可促進(jìn)CP的吸收率；二是發(fā)酵飼料含有益生菌和益生素，可調(diào)節(jié)動物胃腸道菌群平衡，促進(jìn)胃腸道發(fā)育，從而提高CP表觀消化率[25]。

曾鈺等[26]研究表明，發(fā)酵雜粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子(單寧和棉酚)含量降低，蛋白酶等消化酶活性提高，可促進(jìn)肉牛瘤胃中普雷沃氏菌屬和擬桿菌屬增殖，從而提高NDF和ADF的消化率，其中以75%替代比例最佳。Qiao等[27]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加100 g/d芽孢桿菌培養(yǎng)物可顯著提高荷斯坦奶牛NDF和ADF消化率。本研究中，5%、10%和15%組中NDF表觀消化率分別比對照組顯著提高了16.00%、20.96%和3.36%，ADF表觀消化率分別提高45.65%、52.87%和16.07%，可能與發(fā)酵飼料中微生物發(fā)酵產(chǎn)生的纖維降解酶可提高纖維吸收率有關(guān)[28]。張喆萍等[29]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂15%發(fā)酵棗粉降低4～6月齡荷斯坦?fàn)倥DF和ADF消化率。以上研究說明，飼料中粗纖維(NDF和ADF)消化率不隨發(fā)酵飼料添加比例的增高而增加。本研究也取得一致的結(jié)果，5%組比15%組NDF、ADF表觀消化率分別提高了3.05%和35.24%，10%組比15%組分別提高了8.20%和43.84%，與本研究中DM采食量結(jié)果一致，原因可能是過量發(fā)酵飼料中益生菌可促進(jìn)瘤胃內(nèi)微生物大量增殖分泌乳酸，降低瘤胃內(nèi)食糜酸度，過量乳酸會一定程度上抑制微生物增殖，加速食糜排空速率，降低飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收[30]，這與金立明等[31]研究表明，采食量與飼糧在瘤胃中降解率和食糜在小腸中排空的速度呈正相關(guān)結(jié)果一致。

動物消耗碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪三大能量源進(jìn)行養(yǎng)分代謝，同時必然伴隨著能量代謝[32]。嚴(yán)慧等[23]研究表明，羔羊的能量消化吸收率主要與瘤胃微生物促使酶的合成有關(guān)。高俊峰[32]研究表明，飼喂20%發(fā)酵木薯渣能調(diào)節(jié)黑山羊瘤胃微生物的健康繁殖，加快飼料中各種營養(yǎng)物質(zhì)快速分解，產(chǎn)生足夠多的揮發(fā)性脂肪酸，為山羊快速生長和發(fā)育提供足夠的能量，從而提高GE消化率。本研究中，飼喂5%和10%發(fā)酵飼料后羔羊GE表觀消化率顯著高于對照組，主要是因為發(fā)酵飼料中益生菌和代謝產(chǎn)物的添加可調(diào)節(jié)胃腸道發(fā)育，從而促進(jìn)羔羊?qū)I養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高能量利用率。研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門和厚壁菌門比例可降低能量吸收利用率[33]。本研究中，15%組羔羊GE表觀消化率比對照組降低了2.87%，推測可能是因為15%發(fā)酵飼料含有的活菌數(shù)量較多，影響了腸道菌群結(jié)構(gòu)，過多的微生物在腸道增殖會額外消耗飼糧的營養(yǎng)物質(zhì)[34]，從而影響羔羊營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收。

3.2 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊血清中GH、IGF-Ⅰ和INS含量的影響

GH是動物生長最重要的激素之一，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，加速蛋白質(zhì)代謝，增強機體肌肉蛋白質(zhì)沉積率[35]。IGF-Ⅰ主要由肝臟分泌，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)骨骼肌生長發(fā)育[36]。Fan等[37]研究表明，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵玉米-豆粕飼糧可以提高肝臟IGF-Ⅰ的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而顯著提高育肥豬血清中IGF-Ⅰ含量。鄭杰等[38]研究表明，50%發(fā)酵菜籽粕中多肽可促進(jìn)3月齡斷奶羔羊血清中GH合成，顯著提高血清IGF-Ⅰ含量，促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)沉積，加速生長。占今舜等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在2月齡斷奶山羊飼糧中添加高水平乳酸菌會增加GH分泌，降低脂肪利用，山羊生長發(fā)育遲緩，添加低水平乳酸菌使血清總膽固醇含量提高，使機體脂代謝受阻，從而降低山羊生長發(fā)育，因此，適宜水平乳酸菌可促進(jìn)激素分泌，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，提高動物生長性能。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加10%發(fā)酵飼料顯著提高了羔羊血清中GH和IGF-Ⅰ含量，而5%和15%組血清GH和IGF-Ⅰ含量與對照組無顯著差異，這與本研究中消化試驗中飼喂發(fā)酵飼料后羔羊DM結(jié)果采食量結(jié)果一致，表明適宜水平益生菌發(fā)酵飼料可調(diào)節(jié)機體激素水平，提高采食以促進(jìn)羔羊生長發(fā)育。

INS是胰島B細(xì)胞分泌的一種可促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞加強糖元合成的蛋白質(zhì)激素，可促進(jìn)脂肪沉積和蛋白質(zhì)、核酸的合成，有利于肌肉發(fā)育，促進(jìn)動物生長。Jia等[40]研究表明，飼糧添加地衣芽孢桿菌和釀酒酵母替代莫能菌素可以顯著提高育肥羔羊血清INS含量。白璐等[41]研究表明，利用雄性小鼠建立動物模型驗證益生菌對胰島素的作用，乳酸菌可調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群變化，促進(jìn)腸道短鏈脂肪酸產(chǎn)生，激活G蛋白耦聯(lián)受體促進(jìn)胰島素分泌，顯著提高小鼠血清INS含量。本試驗結(jié)果表明，添加復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料組與對照組相比均顯著提高了羔羊血清中INS含量，說明發(fā)酵飼料中的益生菌可能通過改變羔羊腸道菌群平衡促進(jìn)胰島素分泌，有利于羔羊生長。而5%、10%和15%組間羔羊血清INS含量無顯著差異，說明發(fā)酵飼料的添加水平對血清INS含量無顯著影響，可能原因是羔羊在試驗期內(nèi)長期飼喂發(fā)酵飼料，益生菌已在羔羊腸道定植形成一個較高代謝水平的動態(tài)平衡，INS含量處在較高水平上的平衡狀態(tài)內(nèi)[42]。

3.3 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊糞便消化酶活性的影響

動物消化道中的消化酶根據(jù)專一性可分為LPS、Try、CL和α-AL[43]。LPS又稱三?；视王；饷?，在堿性條件具有水解甘油三酯生成甘油和脂肪酸的能力，是動物脂質(zhì)利用的標(biāo)志[44-45]。CL是催化纖維素降解而生成葡萄糖的酶總稱，可以提高動物對飼料粗纖維和抗性淀粉利用率，降低飼糧黏性促進(jìn)反芻動物瘤胃發(fā)育[46]。Try是由胰腺分泌存在機體內(nèi)的一種絲氨酸蛋白酶，可將蛋白分解為多肽[47]。α-AL可以反映碳水化合物在腸道中被消化成葡萄糖并被吸收利用的狀態(tài)[48]。糞便消化酶活性可在一定程度上代表腸道消化酶活性。王長康等[49]研究表明，發(fā)酵豆粕中含有的乳酸等有機酸、益生菌和活性因子，通過降低pH、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡刺激消化腺體及器官分泌消化酶，從而提高1～4周齡肉仔雞十二指腸中AL和Try活性。研究表明，飼喂18%發(fā)酵刺梨渣可提高育肥肉牛小腸AL、糜蛋白酶、Try活性[50]，具有影響糞便消化酶活性的潛力[51]。Wang等[52]和Sun等[53]研究表明，在肉仔雞飼糧中添加外源菌(乳酸菌和酵母菌)可顯著提高小腸Try和LPS活性，提高肉雞生長性能。聶召龍等[54]研究表明，28日齡斷奶公犢牛飼喂復(fù)合乳酸菌劑可改善腸道內(nèi)環(huán)境，加強消化器官和消化腺功能的完善，顯著提高空腸和回腸Try和LPS活性，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率。霍姝伊等[55]研究表明，枯草芽孢桿菌劑作為外源菌種可分泌多種消化酶，可顯著提高斷奶仔豬糞便α-AL、LPS和CL活性，降低回盲腸內(nèi)容物及糞便中CP、EE及粗纖維的含量，提高各營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收。李媛媛等[56]研究表明，7日齡哺乳仔豬口服乳酸菌后刺激仔豬小腸上皮發(fā)育，從而可顯著提高空腸α-AL、Try和LPS活性。本研究結(jié)果表明，飼喂發(fā)酵飼料的羔羊糞便中α-AL、CL、Try和LPS活性均顯著高于對照組，與上述結(jié)果一致，可能是因為發(fā)酵飼料中含有益生菌及其代謝產(chǎn)物，可以改善腸道微生物菌群，有利于維持腸道健康，從而提高消化酶活性，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。5%、10%和15%組羔羊糞便中的CL活性無顯著差異，推測原因可能是α-AL、Try和LPS由羔羊消化腺分泌[55]，而CL受腸道共生微生物影響，當(dāng)發(fā)酵飼料進(jìn)入腸道后，機體會形成新的菌群平衡，因此發(fā)酵飼料劑量對糞便CL活性無顯著影響。孟芳等[57]通過研究外源酶對羔羊瘤胃體外發(fā)酵液消化酶活性顯示，中、低水平外源酶可提高飼糧在瘤胃中的降解率，而高劑量外源酶添加和消化道內(nèi)源酶之間具有協(xié)同作用使部分內(nèi)源酶的合成受到抑制[58]。飼喂發(fā)酵飼料組的羔羊糞便α-AL、Try和LPS活性大小關(guān)系為10%組>15%組>5%組，羔羊腸道中消化酶活性不隨發(fā)酵飼料添加比例的增加而提高，這與營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的結(jié)果一致，推測可能是由于高水平發(fā)酵飼料組益生菌數(shù)量較多，導(dǎo)致外源酶大量進(jìn)入腸道，抑制了腸道內(nèi)源酶的活性[34]，從而降低營養(yǎng)物質(zhì)吸收率。而10%組糞便α-AL、Try和LPS活性分別比5%組提高了16.07%、26.04%和19.84%，表明適宜比例發(fā)酵飼料可提高羔羊腸道中消化酶活性，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收。綜上所述，本試驗條件下，哺乳羔羊開食料中復(fù)合益生菌發(fā)酵料的最佳添加量為10%。

3.4 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊糞便NH3含量的影響

飼料搭配不合理或者蛋白質(zhì)類物質(zhì)消化不完全，會導(dǎo)致飼料中未消化的蛋白質(zhì)在微生物的作用下產(chǎn)生大量NH3，不僅浪費飼料資源，而且會造成環(huán)境污染[59]。Seok等[60]研究表明，肉羊使用青貯飼料飼糧可改善糞便中氮的排放，主要與青貯飼料中CP含量和消化率相關(guān)[61]。也有報道，在斷奶仔豬飼糧中添加乳酸桿菌[62]、枯草芽孢桿菌[63]和地衣芽孢桿菌[64]可分別使糞便NH3排放降低19.66%、17.85%和22.95%。廖云瓊等[8]也證實，奶牛益生菌發(fā)酵飼料中細(xì)菌與腸道有益菌協(xié)同作用，增強胃腸功能，使含氮化合物向氨基酸方向轉(zhuǎn)化，提高蛋白質(zhì)利用率，同時腸道有益菌增殖通過競爭位點抑制大腸桿菌的活動，減少蛋白質(zhì)向氨和胺的轉(zhuǎn)化，從而降低牛糞NH3排放。本試驗結(jié)果顯示，添加5%、10%和15%發(fā)酵飼料使糞便氨氣含量分別比對照組降低了40.68%、61.37%和71.56%，這與飼喂發(fā)酵飼料組中糞便Try活性顯著增加，從而促進(jìn)了飼糧氮消化結(jié)果一致，說明添加發(fā)酵料可以提高羔羊飼糧中蛋白質(zhì)的利用率，降低氮排放，且添加比例越高氮排放越低，可能與發(fā)酵飼料中益生菌及其代謝產(chǎn)物的數(shù)量有關(guān)。

3.5 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對羔羊糞便微生物數(shù)量的影響

動物腸道是由益生菌、致病菌群和宿主組成的動態(tài)平衡。腸道菌群失衡極易造成動物腹瀉。乳酸桿菌和大腸桿菌是評價動物腸道平衡的主要指標(biāo)。乳酸菌進(jìn)入腸道后可與大腸桿菌等有害菌競爭腸道上皮的空間位點，爭奪生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，從而降低有害菌數(shù)量[25]，同時乳酸菌代謝可產(chǎn)生乳酸等有機酸，可將pH降低到3～4，抑制大腸桿菌等有害菌生長，改善羔羊腸道菌群[65]。劉輝等[3]研究表明，副干酪乳桿菌發(fā)酵飼料可顯著提高生長豬糞便乳酸菌數(shù)量，降低大腸桿菌和金黃色葡萄球菌數(shù)量。Yuan等[66]利用乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕，顯著降低斷奶仔豬糞便大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，顯著提高乳酸菌數(shù)量。本試驗中，隨著發(fā)酵飼料添加比例增加糞便中有益乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量逐步提高，大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量顯著降低，與上述研究結(jié)果基本一致，說明哺乳羔羊飼喂復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料后，由于微生物的攝入增加了腸道乳酸桿菌等有益菌數(shù)量，降低了大腸桿菌等有害菌數(shù)量，可調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，促進(jìn)羔羊腸道健康。

4 結(jié) 論

復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料可提高羔羊營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清生長類激素含量和糞便消化酶活性，降低腹瀉致病菌數(shù)量和NH3排放。本試驗條件下，哺乳羔羊復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料的最適添加量為10%。