蘇氨酸和異亮氨酸對皖西白鵝生長性能、盲腸組織結構、細胞因子和微生物區(qū)系的影響

楊亞南 孫 祁 徐廉竹 丁元翠 袁宇塵 胡倩倩 李升和 任 曼

(安徽科技學院動物科學學院，動物營養(yǎng)調控與健康安徽省重點實驗室，鳳陽233100)

我國是世界養(yǎng)鵝大國，2021年世界肉鵝出欄量約6.6億只，我國商品鵝出欄5.7億只[1]。除了養(yǎng)殖和消費數(shù)量大，我國鵝品種豐富、地方特色鮮明，本文所選用的皖西白鵝享有“世界珍禽”稱號，1981年首批列入《中國家禽品種志》，其羽絨質量得到了世界公認[2]，具有抗病力強、幼齡生長速度快、耐粗飼等特點。但是，隨著鵝養(yǎng)殖的規(guī)?；?，鵝腸道性疾病(鵝副黏病毒病、鵝大腸桿菌病、新型病毒性腸炎等)激增。大量研究表明，一些氨基酸除了參與合成動物體蛋白，還具有調控免疫功能和影響腸道健康作用。異亮氨酸可以減輕斷奶仔豬模型中的輪狀病毒感染和免疫反應，改善生長性能和免疫功能[3]，提高魚類腸道淀粉酶和胃蛋白酶活性[4]。蘇氨酸參與機體蛋白質合成和免疫等生理功能[5]。同時，作為腸道黏蛋白的重要組成部分，蘇氨酸可改善仔豬、雞和鴨的小腸組織形態(tài)[6-7]，維持空腸形態(tài)的完整性和修復大腸桿菌引起的絨毛損傷[8]，調節(jié)蛋雞腸道微生物種群[9]。上述研究為蘇氨酸和異亮氨酸的功能提供了重要線索，但二者在皖西白鵝中的研究和應用較少。與雞和鴨不同，鵝作為草食性動物，盲腸的結構和功能對其健康和生長具有重要作用。因此，本試驗旨在研究蘇氨酸和異亮氨酸對生長期皖西白鵝生長性能、盲腸組織結構、細胞因子和微生物區(qū)系的影響，為氨基酸在鵝飼糧中應用提供借鑒，也為鵝腸道性疾病的營養(yǎng)性預防提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養(yǎng)管理

選取30日齡皖西白鵝(購自六安市皖西白鵝原種場)180只，隨機分為3組，每組3個重復，每個重復20只，各重復之間體重接近。對照組飼喂基礎飼糧；試驗組分為蘇氨酸組和異亮氨酸組，蘇氨酸組在基礎飼糧中添加2.0 g/kg的蘇氨酸，異亮氨酸組在基礎飼糧中添加2.5 g/kg的異亮氨酸。蘇氨酸和異亮氨酸純度均為98%，添加形式分別為L-蘇氨酸和L-異亮氨酸。試驗期60 d。飼養(yǎng)場地包含鵝舍、運動場和水池。皖西白鵝自由采食、充足飲水，按正常免疫程序進行免疫接種。飼糧營養(yǎng)水平參考《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2019年第30版)》[10]計算，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目Items30～60日齡30 to 60 days of age61～90日齡61 to 90 days of age稻殼 Rice hull5.008.00L-賴氨酸鹽酸鹽 L-Lys·HCl0.05L-蘇氨酸 L-Thr0.120.20DL-蛋氨酸 DL-Met0.060.07氯化膽堿 Choline chloride0.500.50碘化鉀 KI0.010.01合計 Total100.00100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels3)粗蛋白質 CP17.1515.23粗脂肪 EE2.989.05代謝能 ME/(MJ/kg)11.7010.51粗纖維 CF4.346.71鈣 Ca0.800.80總磷 TP0.670.65有效磷 AP0.430.36賴氨酸 Lys0.930.77蛋氨酸 Met0.400.33蘇氨酸 Thr0.800.77異亮氨酸 Ile0.700.58

1.2 樣品采集

試驗第30天和第60天，每個重復隨機選取2只鵝，每組共6只鵝，頸靜脈放血處死，取左、右2段盲腸中段組織，一段置于4%多聚甲醛中固定，一段置于-80 ℃冰箱中保存。取中段盲腸食糜，置于滅菌EP管里，置于液氮中保存，待測。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 生長性能

每天記錄皖西白鵝采食量，每15 d稱1次空腹體重，計算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)、平均日增重(average daily gain，ADG)和料重比(feed/gain，F(xiàn)/G)。

1.3.2 盲腸組織形態(tài)

取固定24 h后的皖西白鵝盲腸組織，自來水沖洗24 h，經(jīng)過乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等處理后，以5 μm的厚度切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色。使用正置熒光顯微鏡(BX63，日本Olympus公司)對切片進行拍照，每張切片選擇5個視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media，美國Cybernetics公司)測量盲腸絨毛高度、隱窩深度，計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.3.3 盲腸細胞因子含量

取盲腸中段組織0.1 g，按1∶9質量體積比加勻漿介質，制備10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法和酶標儀(Multiskan，美國Thermo Fisher Scientific公司)檢測盲腸組織上清液中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)含量。

1.3.4 盲腸內容物16S rRNA高通量測序

取中段盲腸食糜，將樣品送至深圳微生太科技有限公司，使用DNA抽提試劑盒E.Z.N.A.?Soil DNA Kit(美國Omega Bio-Tek公司)提取DNA，以16S rRNA V3～V4區(qū)為目標片段，擴增引物為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。運用QIIME2 demux插件對不同樣本的序列進行拆分[11]。將拆分后的序列，運用QIIME2 dada2插件進行質控、修剪、去噪、拼接以及去除嵌合體后，得到最終的特征序列[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比較，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(mean±SE)表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 蘇氨酸和異亮氨酸對皖西白鵝生長性能的影響

由表2可知，各組之間30、60、90日齡體重無顯著差異(P>0.05)。各組之間30～60日齡ADG、F/G無顯著差異(P>0.05)，異亮氨酸組30～60日齡ADFI顯著高于蘇氨酸組(P<0.05)。各組之間61～90日齡ADG、ADFI無顯著差異(P>0.05)，蘇氨酸組和異亮氨酸組61～90日齡F/G極顯著低于對照組(P<0.01)。各組之間30～90日齡ADG、ADFI、F/G無顯著差異(P>0.05)。

2.2 蘇氨酸和異亮氨酸對皖西白鵝盲腸組織形態(tài)的影響

通過觀察組織切片(圖1)，盲腸管壁分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜。盲腸黏膜層絨毛較少，腸腺長而直，比較密集。

表2 蘇氨酸和異亮氨酸對皖西白鵝生長性能的影響

續(xù)表2項目Items對照組Control group蘇氨酸組Threonine group異亮氨酸組Isoleucine group平均日采食量 ADFI/g301.27±8.21288.87±7.81307.17±7.36料重比 F/G6.01±0.165.83±0.165.99±0.15

Ⅰ：60日齡對照組；Ⅱ：60日齡蘇氨酸組；Ⅲ：60日齡異亮氨酸組；Ⅳ：90日齡對照組；Ⅴ：90日齡蘇氨酸組；Ⅵ：90日齡異亮氨酸組。比例尺：200 μm。

由表3可知，60日齡時，異亮氨酸組盲腸絨毛高度極顯著高于對照組(P<0.01)，顯著高于蘇氨酸組(P<0.05)；異亮氨酸組盲腸隱窩深度顯著高于對照組(P<0.05)；各組之間盲腸絨毛高度/隱窩深度無顯著差異(P>0.05)。90日齡時，蘇氨酸組盲腸絨毛高度顯著高于異亮氨酸組(P<0.05)，蘇氨酸組盲腸隱窩深度顯著高于對照組和異亮氨酸組(P>0.05)，蘇氨酸組和異亮氨酸組盲腸絨毛高度/隱窩深度顯著低于對照組(P<0.05)。

2.3 蘇氨酸和異亮氨酸對90日齡皖西白鵝盲腸細胞因子含量的影響

由表4可知，90日齡時，各組之間盲腸IgG、IgA、IgM、SIgA、IL-2含量無顯著差異(P>0.05)，蘇氨酸組和異亮氨酸組盲腸TNF-α含量顯著低于對照組(P<0.05)，蘇氨酸組盲腸IFN-γ顯著高于對照組(P<0.05)，蘇氨酸組盲腸IL-4含量顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 蘇氨酸和異亮氨酸對90日齡皖西白鵝盲腸微生物區(qū)系的影響

2.4.1 操作分類單元(OTUs)稀釋曲線圖和盲腸菌群的OTUs韋恩圖

由圖2-Ⅰ可知，序列數(shù)量在5 000個以內各組OTUs數(shù)量增長較多，在序列數(shù)量超過5 000個以后，OTUs數(shù)量增加較平緩，序列數(shù)量已基本覆蓋樣品細菌物質，各個樣品豐富度差異較大。

由圖2-Ⅱ可知，在相似度97%的水平下，共鑒定5 580個OTUs，每個樣本平均有(372±22)個。對照組和蘇氨酸組共有528個相同的OTUs，蘇氨酸組和異亮氨酸組共有452個相同的OTUs，對照組和異亮氨酸組有452個相同的OTUs，3組共有398個相同的OTUs。

2.4.2 各組盲腸樣品alpha多樣性分析

由表5可知，各組之間盲腸菌群Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

2.4.3 各組盲腸樣品beta多樣性分析

盲腸菌群beta多樣性的主坐標分析(PCoA)和無度量多維標定法(NMDS)分析結果如圖3所示，圖中每1個點代表1個樣本，相同顏色的點為同1個分組，2點之間得到距離越近表明二者的群落構成差異越小。當應力值(stress)<0.2時，說明數(shù)據(jù)可靠。通過NMDS分析和PCoA，顯示樣本相似性較好。主成分1貢獻率約為21.5%，主成分2貢獻率約為12.2%。

表3 蘇氨酸和異亮氨酸對皖西白鵝盲腸組織形態(tài)的影響

表4 蘇氨酸和異亮氨酸對90日齡皖西白鵝盲腸細胞因子含量的影響

CON90D1～CON90D6代表對照組6個樣品，BAA90D1～BAA90D4代表蘇氨酸組4個樣品，PAA90D1～PAA90D5代表異亮氨酸組5個樣品。A、B、C分別代表對照組、蘇氨酸組、異亮氨酸組。下圖同。

表5 90日齡皖西白鵝盲腸菌群alpha多樣性分析

圖3 90日齡皖西白鵝盲腸菌群beta多樣性

2.4.4 物種菌群分析

皖西白鵝盲腸微生物在門水平上組成如圖4所示，16個門中排名靠前的優(yōu)勢菌門有擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、螺旋菌門(Spirochaetes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、疣微菌門(Verrucomicrobia)。各組最優(yōu)勢地位的菌門均為擬桿菌門，次級優(yōu)勢地位的菌門為厚壁菌門，從整體上看，蘇氨酸組和異亮氨酸組的厚壁菌門相對豐度大于對照組。

圖4 各組(Ⅰ)和各樣品(Ⅱ)皖西白鵝盲腸菌群在門水平上的相對豐度

由表6可知，90日齡時，異亮氨酸組盲腸軟壁菌門(Tenericutes)相對豐度極顯著高于對照組和蘇氨酸組(P<0.01)。各組之間盲腸其余菌門相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

表6 90日齡皖西白鵝盲腸菌群門水平相對豐度

皖西白鵝盲腸微生物在屬水平上組成如圖5所示，在屬水平上物種注釋共獲得21個屬，位于前10的優(yōu)勢菌屬分別為：擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃球菌科未分類菌屬(unspecified_Ruminococcaceae)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)、普雷沃菌屬(Prevotella)、梭菌未分類屬(unspecified_Clostridiales)、擬桿菌未分類屬(unspecified_Bacteroidales)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum)、消化球菌屬(Peptococcus)。

圖5 各組(Ⅰ)和各樣品(Ⅱ)皖西白鵝盲腸菌群在屬水平上的相對豐度

由表7可知，90日齡時，蘇氨酸組盲腸顫螺旋菌屬、消化球菌屬和S24_7科未分類菌屬(unspecified_S24_7)相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)。蘇氨酸組盲腸消化球菌屬和S24_7科未分類菌屬相對豐度顯著異高于異亮氨酸組(P<0.05)。各組之間盲腸其余菌屬相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

表7 90日齡皖西白鵝盲腸菌群屬水平相對豐度

3 討 論

3.1 蘇氨酸和異亮氨酸對皖西白鵝生長性能的影響

作為功能性氨基酸，蘇氨酸和異亮氨酸可改善畜禽生長性能。額外補充蘇氨酸和異亮氨酸可提高仔豬和育肥豬的生長性能[13-14]。Lin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加5.5、5.7、6.9和8.1 g/kg的異亮氨酸可顯著增加黃羽肉雞體重。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加異亮氨酸提高了30～60日齡皖西白鵝的ADFI，飼糧中添加異亮氨酸和蘇氨酸均降低了61～90日齡皖西白鵝的F/G。蘇氨酸是胃腸道黏蛋白的重要組成部分，在調節(jié)營養(yǎng)代謝、大分子生物合成和腸道平衡方面起著重要作用[16]。異亮氨酸在整個機體的生理功能中起著生長、免疫、蛋白質代謝、脂肪酸代謝和葡萄糖運輸?shù)裙δ?，其還可以改善免疫功能[17]。異亮氨酸對葡萄糖和脂質代謝有顯著影響，低水平的異亮氨酸會降低禽類的體重，相反，高水平的異亮氨酸可以改善畜禽的脂質和葡萄糖代謝，減少脂肪積累[18-20]。前人報道和本試驗結果均表明，適宜水平的蘇氨酸和異亮氨酸可提高畜禽的生長性能，異亮氨酸和蘇氨酸提高皖西白鵝生長性能的可能機制是與盲腸微生物組成和組織結構變化有關，后文將進行深入討論。另外，基于此2種氨基酸在鵝體內代謝特點研究較少，下一步可探究蘇氨酸和異亮氨酸在鵝體內的消化代謝特點及其生物學功能。

3.2 蘇氨酸和異亮氨酸對皖西白鵝盲腸組織形態(tài)和細胞因子含量的影響

與哺乳動物不同，禽類盲腸結構具有皺襞和絨毛。鵝是草食性的家禽，盲腸是其消化纖維并吸收的主要部位。因此，盲腸的組織結構和盲腸內微生物對鵝的生長和健康有重要的作用。腸道的絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度是衡量腸道消化吸收的重要指標[18-21]。Tang等[16]發(fā)現(xiàn)額外補充蘇氨酸會增加空腸絨毛高度與隱窩深度的比率。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，飲水中添加2.5 mg/mL異亮氨酸顯著提高了小腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，顯著降低了隱窩深度[22]。但是關于氨基酸對水禽尤其鵝的盲腸結構和功能影響的研究較為缺乏。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加異亮氨酸提高了60日齡皖西白鵝盲腸絨毛高度，飼糧中添加蘇氨酸對鵝盲腸絨毛高度和隱窩深度影響不顯著。盲腸屬于消化道后端，絨毛比前段的短，盲腸主要依靠微生物消化，所以盲腸菌群是其消化能力的體現(xiàn)。

Azzam等[23]發(fā)現(xiàn)補充蘇氨酸顯著增加了蛋雞回腸IgM、IgG和SIgA含量。Dong等[24]發(fā)現(xiàn)飼糧中添加1.0、2.0、3.0和4.0 g/kg的異亮氨酸對血清IgM、IgG和SIgA含量無顯著影響，對回腸SIgA、TNF-α、IL-2含量無顯著影響。本試驗發(fā)現(xiàn)，各組之間盲腸IgG、IgA、IgM、SIgA、IL-2含量無顯著差異，與對照組相比，蘇氨酸組和異亮氨酸組的盲腸TNF-α含量顯著下降，蘇氨酸組的盲腸IL-2、IFN-γ含量顯著增加。TNF-α是腸道黏膜免疫中的促炎因子，過多會造成不必要的炎癥反應，使血管通透性增加、細胞損傷，影響動物的健康；IL-2、IL-4在抗腫瘤調節(jié)起到了至關重要的作用。蘇氨酸組盲腸IFN-γ含量顯著增加，與Wils-Plotz等[25]研究結果相反，Wils-Plotz等[25]發(fā)現(xiàn)添加高蘇氨酸組的感染球蟲病肉雞盲腸扁桃體IFN-γ基因的表達最低。IFN-γ是一種病毒抑制性細胞因子[26]，IFN-γ含量高說明體內病毒含量也高。IFN-γ主要是由自然殺傷(NK)細胞和T淋巴細胞產生的[27]，在NK和T淋巴細胞中白細胞介素-12(IL-12)和白細胞介素-18(IL-18)結合會進一步增加IFN-γ的產生[28]，而IL-2有刺激NK和T淋巴細胞增殖的作用，本試驗的蘇氨酸組盲腸IFN-γ含量顯著高于對照組，可能與蘇氨酸組盲腸IL-2含量顯著升高有關。這說明皖西白鵝額外添加蘇氨酸和異亮氨酸對皖西白鵝免疫功能有一定影響。

3.3 蘇氨酸和異亮氨酸對皖西白鵝盲腸微生物區(qū)系的影響

鵝能消化利用纖維素主要依賴于腸道微生物[29]。多樣性高的腸道微生物宿主可能更健康[30]。多種因素可以影響鵝盲腸微生物，在養(yǎng)殖水體中添加光合細菌可以顯著改變揚州鵝腸道菌群結構[31]。在門水平上，厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門是鵝的主要腸道菌群，強制喂食加糖飼糧可以使天府肉鵝空腸厚壁菌門相對豐度增加，盲腸擬桿菌門相對豐度增加[32]；在基礎飼糧添加5%木薯葉處理對海南本地鵝盲腸中的微生物群落有顯著影響[33]。

鵝利用纖維素是腸道中的微生物分泌消化酶，特別是纖維素酶，其盲腸的纖維素酶活性最高[34]。類桿菌屬、瘤胃球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和假單胞菌屬是重要的纖維素分解細菌[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸組和異亮氨酸組的盲腸瘤胃球菌科未分類菌屬相對豐度較對照組都有提高，同時蘇氨酸組的盲腸消化球菌屬相對豐度顯著高于對照組，說明飼喂蘇氨酸和異亮氨酸可以提高纖維素的消化能力。飼糧中添加蘇氨酸和異亮氨酸后皖西白鵝的生長性能提高可能與盲腸內菌群變化有關，蘇氨酸和異亮氨酸都增加了盲腸內厚壁菌門、擬桿菌屬和顫螺旋菌屬相對豐度。首先，厚壁菌門與從飼料中獲取能量和養(yǎng)分吸收(如不溶性纖維降解)的能力有關[36]；其次，擬桿菌屬能促進腸道食糜分解，提高其利用率，提高免疫能力，維持腸道維生態(tài)平衡[37]；再次，顫螺旋菌能將糖、淀粉等發(fā)酵轉化為短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸作為腸上皮細胞的首選能量，能抑制腸炎保護腸上皮細胞，對腸道健康具有重要作用[38]。盲腸微生物菌群的變化也影響盲腸組織結構的改變，包括絨毛生長和隱窩深度變化，另外，由于微生物組成改變造成細菌對盲腸上皮刺激改變，因此盲腸的免疫功能相關因子表達水平也受到影響。

4 結 論

① 飼糧中添加2.0 g/kg蘇氨酸或2.5 g/kg異亮氨酸均可一定程度提高皖西白鵝生長性能，異亮氨酸對60日齡盲腸組織結構的影響較大，蘇氨酸對90日齡盲腸組織結構的影響較大。

② 飼糧中添加2.5 g/kg異亮氨酸增加了皖西白鵝盲腸軟壁菌門相對豐度，飼糧中添加2.0 g/kg蘇氨酸增加了皖西白鵝盲腸顫螺旋菌屬、消化球菌屬和S24_7科未分類菌屬相對豐度。