迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞生長性能、血清生化指標、抗氧化能力和腸道形態(tài)的影響

賀文祥 鄧菊嬰* 黃 慧 孟田田 賀建華 周應(yīng)軍 鄒勝文 肖定福**

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2.湖南今漢藥業(yè)有限公司，長沙410014；3.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長沙410013；4.湖南文鳳禽業(yè)有限公司，婁底417700)

大腸桿菌是導(dǎo)致畜禽許多疾病的病原菌之一，其使畜禽生產(chǎn)性能降低，且對抗生素的耐藥性不斷增加[1]。因此，一些替代抗生素的植物提取物的探索、開發(fā)與利用開始興起，給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來了新的突破點。迷迭香具有許多活性成分，是很多酚類抗氧化劑的提取來源，具有抗氧化、抗炎、抗血糖等作用[2-4]。目前關(guān)于迷迭香及其提取物對家禽以及其他畜禽生產(chǎn)性能影響的研究較少，大多為人類疾病治療等藥物性研究[5-6]。本團隊前期探究了迷迭香提取物對蛋雞生產(chǎn)性能的影響，發(fā)現(xiàn)200～400 mg/kg的迷迭香提取物對其有積極作用[7]。為了探究迷迭香提取物對肉雞的影響，本試驗以黃羽肉雞為試驗對象，探究迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞生長性能、抗氧化能力、腸道健康等方面的影響，為迷迭香提取物作為新型、綠色、潛在替抗飼料添加劑的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用的植物添加劑迷迭香提取物的主要成分為迷迭香酸(≥5%)、熊果酸(≥3%)、葉綠素(≥4%)和黃酮類物質(zhì)(主要是橙皮苷)(≥16%)。攻毒采用大腸桿菌K88，濃度為1.0×109CFU/mL。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗選取健康狀況良好、其他條件相近的7日齡黃羽肉雞144羽(全母)，隨機分為3組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)8只雞。對照組(CON組)和大腸桿菌攻毒組(EC組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，迷迭香提取物+大腸桿菌攻毒組(ECRE組)在基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg迷迭香提取物。試驗期為28 d(8～35日齡)。在29～35日齡進行為期7 d的攻毒試驗。

大腸桿菌攻毒試驗：借鑒Wang等[8]的攻毒方法，考慮到攻毒日齡的不同，在試驗前用大腸桿菌K88進行攻毒預(yù)試驗，即選取非試驗用雞，通過口腔灌喂2 mL濃度分別為1.0×107、1.0×108和1.0×109CFU/mL的大腸桿菌K88，觀察每日攻毒肉雞的健康狀況和腹瀉情況，確定最合適濃度為1.0×109CFU/mL。最終確立的灌喂攻毒操作為：29日齡開始，CON組每只雞灌服2 mL無菌生理鹽水，EC組和ECRE組每只雞灌服2 mL濃度為1.0×109CFU/mL的大腸桿菌K88菌液，連續(xù)灌服7 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧

本試驗所用基礎(chǔ)飼糧參照《黃羽肉雞營養(yǎng)需要量》(NY/T 647—2020)進行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 飼養(yǎng)管理

整個試驗期采用3層籠養(yǎng)的方式飼養(yǎng)，每籠8只雞，每1籠為1個重復(fù)，保持每個組的飼養(yǎng)環(huán)境條件相同。雞舍定期消毒和清潔，保持通風，雞舍溫度保持在(24±2) ℃，雞只自由采食和飲水。雞舍固定光照時間：在肉雞1～3日齡時每天光照時間為24 h，4日齡以后每天光照時間控制在18 h。

1.5 測定指標

1.5.1 生長性能和腹瀉率

于肉雞8、29和35日齡空腹12 h(停料不停水)后稱重，每天計錄各組每個重復(fù)的采食量，從而計算出8～28日齡及29～35日齡階段的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。試驗期間，每天觀察雞健康狀況。大腸桿菌攻毒期間(29～35日齡時)，正常雞的糞便為柱狀螺旋圓錐形，顏色淺灰綠色，在雞糞表面附有白色帶狀尿酸鹽，柔軟蓬松；當雞腹瀉時，表現(xiàn)多樣，有白色、紅色、綠色等稀便。參照趙憲臣[9]的方法，通過觀察肉雞肛門的骯臟度及糞盤中拉稀糞便占比，記錄每天每組雞腹瀉情況，計算每天的腹瀉率，最終取7 d腹瀉率平均值進行統(tǒng)計分析。

每天腹瀉率(%)=100×每天每組雞腹瀉數(shù)/每組雞總數(shù)。

1.5.2 血清生化指標

于35日齡空腹12 h后在每組的每個重復(fù)中隨機選取1只健康的肉雞，頸靜脈采血，離心機分離血清，-80 ℃保存，進行后續(xù)的血清生化指標和抗氧化指標的測定。血清生化指標具體測定操作按試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書的方法實施，采用邁瑞B(yǎng)S200全自動生化分析儀(邁瑞醫(yī)療，深圳)檢測血清中甘油三酯(TG，單試劑GPO-PAP法)、總膽固醇(TC，單試劑GPO-PAP法)、總蛋白(TP，考馬斯亮藍法)、葡萄糖(GLU，己糖激酶法)、白蛋白(ALB，溴甲酚綠法)、尿素(UREA，脲酶法)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C，雙試劑直接法)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C，雙試劑直接法)含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，賴氏法)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，賴氏法)、乳酸脫氫酶(LDH，微板法)、堿性磷酸酶(ALP，微量酶標法)活性。

1.5.3 血清抗氧化指標

用上述保存的血清進行抗氧化指標的測定，具體操作按試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書的方法實施，采用酶標儀或分光光度計測定血清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化物酶(POD)、一氧化氮合成酶(NOS)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性以及總抗氧化能力(T-AOC)與一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量。

1.5.4 器官指數(shù)

將放血后的肉雞屠宰和剖解，分出胸腺、脾臟、法氏囊和肝臟等器官，用濾紙擦去血漬，去除脂肪后稱重，用于計算器官指數(shù)。

1.5.5 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

解剖肉雞打開腹腔，每只雞盡量控制在相同位置采取空腸、回腸腸段各1～2 cm，用鑷子夾取樣品腸段，用0.9%生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，然后固定于4%多聚甲醛溶液中。將腸道組織樣品從固定液中取出，經(jīng)過修整、脫水、透明、浸蠟包埋、脫蠟染色制作腸道組織切片，并根據(jù)切片和染色效果選取切片，利用中性樹脂進行封片。選擇空腸和回腸組織形態(tài)完整、走向清晰的6個視野切片，使用顯微鏡圖像處理軟件(Image-Pro Plus 6.0)測量其絨毛高度(VH)和對應(yīng)的隱窩深度(CD)，并計算絨隱比(絨毛高度與隱窩深度的比值)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗原始數(shù)據(jù)用Excel 2010預(yù)處理，采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0通過一般線性模型進行單因素方差分析，利用Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果均以“平均值±標準差”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞生長性能和腹瀉的影響

由表2可知，飼糧中添加迷迭香提取物對8～28日齡肉雞的平均日采食量、平均日增重和料重比均無顯著影響(P>0.05)，對8～35日齡(全期)肉雞的平均日采食量、平均日增重和料重比也均無顯著影響(P>0.05)。29～35日齡，與CON組相比，EC組肉雞平均日采食量和平均日增重顯著降低(P<0.05)，腹瀉率顯著升高(P<0.05)；而與EC組相比，ECRE組肉雞的平均日增重顯著升高(P<0.05)，料重比顯著降低(P<0.05)，腹瀉率也顯著降低(P<0.05)，平均日采食量2組之間沒有顯著差異(P>0.05)；甚至與CON組相比，ECRE組肉雞的料重比也顯著降低(P<0.05)。

2.2 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞器官指數(shù)的影響

由表3可知，與CON組相比，大腸桿菌攻毒顯著降低了肉雞的脾臟指數(shù)(P<0.05)，顯著升高了肝臟指數(shù)(P<0.05)；與EC組相比，飼糧中添加迷迭香提取物顯著降低了大腸桿菌攻毒肉雞的肝臟指數(shù)(P<0.05)，對胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)沒有顯著影響(P>0.05)。

表2 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞生長性能和腹瀉的影響

表3 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞器官指數(shù)的影響

2.3 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞血清生化指標的影響

由表4可知，與CON組相比，大腸桿菌攻毒使肉雞血清中UREA含量和LDH活性顯著升高(P<0.05)，GLU含量顯著降低(P<0.05)；與EC組比，飼糧中添加迷迭香提取物使大腸桿菌攻毒肉雞血清中GLU含量和AST活性顯著升高(P<0.05)，UREA含量和LDH活性雖無顯著變化(P>0.05)，但分別下降0.4 mmol/L和161.91 U/L。大腸桿菌攻毒及在飼糧中添加迷迭香提取物對肉雞血清中TP、ALB、TG、TC、HDL-C和LDL-C含量與ALT、ALP活性均無顯著影響(P>0.05)。

2.4 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞血清抗氧化指標的影響

由表5可知，與CON組相比，大腸桿菌攻毒顯著降低了肉雞血清中GSH-Px、CAT活性(P<0.05)，而顯著升高了血清中NO含量(P<0.05)；與EC組相比，飼糧中添加迷迭香提取物使大腸桿菌攻毒肉雞血清中GSH-Px、CAT活性與T-AOC顯著升高(P<0.05)；且與CON組相比，ECRE組肉雞血清中T-AOC顯著升高(P<0.05)。大腸桿菌攻毒以及在飼糧中添加迷迭香提取物對肉雞血清中SOD、POD、NOS活性及MDA含量均沒有顯著影響(P>0.05)。

2.5 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表6可知，與CON組相比，大腸桿菌攻毒使得肉雞的回腸隱窩深度顯著升高(P<0.05)，回腸絨隱比顯著降低(P<0.05)；與EC組相比，飼糧中添加迷迭香提取物使得大腸桿菌攻毒回腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著升高(P<0.05)。大腸桿菌攻毒以及在飼糧中添加迷迭香提取物對肉雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和回腸絨毛高度均無顯著影響(P>0.05)?？漳c、回腸切片如圖1所示。

表4 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞血清生化指標的影響

表5 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞血清抗氧化指標的影響

表6 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖1 肉雞空腸、回腸組織切片(HE染色)

3 討 論

3.1 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞生長性能的影響

大腸桿菌產(chǎn)生的腸毒素會導(dǎo)致動物腹瀉，從而降低動物的生長性能[10]。研究表明，迷迭香提取物有緩解動物大腸桿菌的感染損傷，降低腹瀉率的作用[11-12]。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。本試驗中400 mg/kg的迷迭香提取物降低了肉雞腹瀉率，這可能與其活性成分的抗菌作用有關(guān)。研究表明，迷迭香酸能通過破壞細菌細胞和其細胞蛋白[13]，或誘導(dǎo)機體自噬途徑發(fā)揮巨噬細胞殺菌活性[3]，有效抑制大腸桿菌等有害菌的增殖。熊果酸會增加大腸桿菌細胞內(nèi)的電子傳遞鏈活性引起氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)細菌死亡[14]。除了降低腹瀉率外，本試驗結(jié)果還顯示迷迭香提取物在降低料重比上也有顯著作用。有研究指出，迷迭香精油能顯著提高新西蘭兔的飼料利用率[15]。Yesilbag等[16]試驗也發(fā)現(xiàn)，雖然飼糧中添加迷迭香、迷迭香揮發(fā)油對肉雞的采食量沒有顯著影響，但對飼料轉(zhuǎn)化率和肉雞體重具有積極作用。迷迭香提取物能降低料重比、提高飼料利用率可能與消化酶的分泌有關(guān)。植物提取物可以促進消化酶的分泌，從而提高不同營養(yǎng)物質(zhì)的消化率[17]。Youssef等[18]試驗表明，含有迷迭香的精油能改善肉雞腸道發(fā)育和增加蛋白酶的活性，從而提高蛋白質(zhì)的消化率和膳食營養(yǎng)素的吸收，進而促進其生長性能的提高。

綜上所述，大腸桿菌攻毒對肉雞生長性能有負面影響，而迷迭香提取物能增加大腸桿菌攻毒肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率、降低腹瀉率，在一定程度上改善大腸桿菌攻毒肉雞的生長性能。

3.2 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞器官指數(shù)的影響

脾臟、胸腺與法氏囊是家禽重要的免疫器官，免疫器官指數(shù)的大小能夠反映家禽免疫功能情況[19]。Rostami等[20]試驗發(fā)現(xiàn)，迷迭香與維生素E相互作用顯著提高了肉雞胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，從而提高了機體免疫能力。Farouk等[11]試驗則發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染肉雞后使其肝臟、腎臟、腸道、脾臟、法氏囊和胸腺組織受損，而迷迭香能改善部分組織的損傷。與以上結(jié)果一致，本試驗結(jié)果也表明，迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞的脾臟損傷的改善有積極作用。迷迭香提取物能提高家禽的免疫功能，可能與其活性物質(zhì)促進免疫細胞的分泌有關(guān)。研究顯示，熊果酸能通過激活細胞免疫降低脾臟和肝臟的損傷[21]。

家禽肝臟在代謝以及機體解毒過程中起著重要的作用[22-23]。Bao等[24]試驗表明，大腸桿菌會引起雞的肝臟損傷，使得其肝臟指數(shù)顯著增加。而有研究顯示，迷迭香對肝臟有保護作用，對大鼠肝病有預(yù)防和治療作用[25]。本試驗結(jié)果也證實在飼糧中添加迷迭香提取物能有效減少大腸桿菌攻毒導(dǎo)致的肉雞肝臟指數(shù)升高。迷迭香其提取物中的多種活性成分都具有護肝作用。迷迭香酸被發(fā)現(xiàn)能通過發(fā)揮抗菌作用以減少家禽免疫損傷[26]、調(diào)節(jié)淋巴細胞亞群的比例以增強家禽免疫器官及肝臟的功能[27]。熊果酸被發(fā)現(xiàn)對肝臟再生有積極作用，對部分肝臟切除的大鼠灌喂熊果酸，其血漿中肝細胞生長因子的水平上升[28]。綜合上述研究結(jié)果推測，迷迭香提取物中的活性成分可能通過緩解機體大腸桿菌感染毒性反應(yīng)、調(diào)節(jié)機體代謝等改善大腸桿菌攻毒肉雞的肝臟指數(shù)。

綜上可知，大腸桿菌攻毒對肉雞器官指數(shù)造成影響，而迷迭香提取物能通過提高其脾臟指數(shù)和緩解肝臟損傷改善大腸桿菌攻毒對肉雞造成的不利影響。

3.3 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞血清生化指標的影響

血清中TP、ALB、UREA含量可反映機體中的氮代謝情況，也是肝臟功能損傷的標志物[29-31]。研究表明，大腸桿菌攻毒導(dǎo)致大鼠血清中TP、ALB、UREA含量顯著升高[32]。而本試驗結(jié)果與前人結(jié)果相似，大腸桿菌攻毒對肉雞血清TP含量沒有顯著影響，但顯著提高了肉雞血清中UREA含量，且對血清中ALB含量有提高的趨勢。本試驗結(jié)果來看，迷迭香提取物一定程度降低了大腸桿菌攻毒肉雞血清中UREA含量，這與Hassanen等[33]的研究結(jié)果類似，其研究得出，迷迭香粉能使大鼠血清的UREA含量下降。

此外，大腸桿菌會使雞血清中其他肝臟損傷標志物如ALT、AST活性增加[24]。據(jù)研究報道，迷迭香精油能通過誘導(dǎo)肝臟損傷大鼠血清中AST、ALT活性降低而發(fā)揮護肝作用[34]，Yu等[35]也證實，迷迭香酸有降低血液中ALT、AST活性的作用。但Jameel[36]研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的迷迭香葉對雞血清中AST與ALT活性的影響不同，一定劑量下的迷迭香葉甚至有升高AST、ALT活性的可能性。本試驗結(jié)果與Jameel[36]的研究結(jié)果類似，迷迭香提取物使得大腸桿菌攻毒肉雞血清中AST活性增加，但與CON組相比無顯著差異，結(jié)合前面肝臟指數(shù)的結(jié)果，表明迷迭香提取物沒有對肝臟造成明顯損傷。

血清GLU的含量能反映機體血糖的變化情況，當家禽機體受損時，其血清GLU含量會降低。Jiang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖攻毒蛋雞其血清GLU含量降低。血清中GLU含量可能與能量的攝入有關(guān)，飼糧能量水平升高其血清中GLU含量升高[38]。而大腸桿菌使機體能量攝入降低，迷迭香精油或提取物可能通過提高機體能量攝入，緩解大腸桿菌引起的血清GLU含量降低[16]。本試驗結(jié)果與之一致，大腸桿菌攻毒使得肉雞血清中GLU含量下降，而迷迭香提取物使得大腸桿菌攻毒肉雞血清GLU含量上升。

LDH是厭氧代謝途徑的重要酶，在肝臟功能受損時LDH活性會升高[39]。Tang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，純化的迷迭香提取物能降低熱應(yīng)激肉雞的血清LDH活性。El-Demerdash等[41]也表示，雜酚油誘導(dǎo)大鼠肝臟中毒，使其LDH活性升高，而迷迭香能使其恢復(fù)到接近正常水平。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，肉雞血清中LDH活性在大腸桿菌攻毒的作用下顯著升高，而在飼糧中添加迷迭香提取物使得大腸桿菌攻毒肉雞中血清LDH活性有降低趨勢，即迷迭香提取物能在一定程度上改善大腸桿菌攻毒導(dǎo)致的肉雞肝臟損傷。經(jīng)分析，其發(fā)揮作用的主要成分可能是迷迭香酸，前人報道，迷迭香酸在改善乙醇誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷時，血清中LDH活性降低[42]。

綜上可知，大腸桿菌改變了肉雞血清部分生化指標，而迷迭香提取物在一定程度上調(diào)節(jié)了肉雞血清生化指標，從而緩解了大腸桿菌對肉雞的不利影響。

3.4 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞抗氧化能力的影響

綜上可知，大腸桿菌造成了肉雞機體一定程度上的氧化損傷，而迷迭香提取物主要通過增強體內(nèi)抗氧化酶的活性來提高大腸桿菌攻毒肉雞的抗氧化能力。

3.5 迷迭香提取物對大腸桿菌攻毒肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)在不同物種之間存在差異，作為重要的消化器官，腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)與家禽的營養(yǎng)吸收息息相關(guān)[51]。研究表明，腸道絨毛高度增加，隱窩深度變淺，絨隱比越大，其腸道的消化與吸收能力越強[52]。絨毛高度增加，腸道吸收養(yǎng)分的表面積越大，而隱窩深度代表細胞的生成率，隱窩深度越淺，其細胞成熟度越好，分泌功能越強[53]。大腸桿菌會破壞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。Liu等[54]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染仔豬，使得回腸的絨毛高度和絨隱比都降低；Zhang等[55]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染肉雞，使得其14 d的空腸絨毛高度降低，7、14和21 d的空腸隱窩深度增加。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，大腸桿菌攻毒對肉雞空腸結(jié)構(gòu)形態(tài)無顯著影響，但顯著增加了回腸隱窩深度，降低了回腸絨隱比。迷迭香提取物及其活性成分具有改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用。Yang等[12]在飼糧中添加100、200或400 mg/kg迷迭香提取物飼喂斷奶仔豬，發(fā)現(xiàn)其空腸和回腸的絨毛高度增加、隱窩深度降低以及絨隱比增加。用橙皮苷飼喂蛋雞能提高其回腸的絨毛高度與絨隱比，并能降低十二指腸、空腸和回腸的隱窩深度[56]。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，迷迭香提取物能通過改善回腸隱窩深度和絨隱比來改善肉雞的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。

綜上可知，大腸桿菌改變了肉雞回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，而迷迭香提取物可能通過抗氧化作用，在一定程度上改善大腸桿菌攻毒肉雞的回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，進而改善生長性能。

4 結(jié) 論

大腸桿菌攻毒對肉雞的生長性能有負面影響，而迷迭香提取物主要通過增加其飼料轉(zhuǎn)化率、降低腹瀉率等改善大腸桿菌攻毒黃羽肉雞的生長性能；此外，迷迭香提取物還可以通過改善大腸桿菌攻毒肉雞的器官指數(shù)、調(diào)節(jié)血清生化指標、提高機體抗氧化能力和改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)來緩解大腸桿菌攻毒對肉雞機體產(chǎn)生的負面影響。