骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

左顯鋒，范建楠,，莫愁，羅嘉熠

1貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng)550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科

上世紀(jì)九十年代，國(guó)際骨性關(guān)節(jié)炎專題會(huì)議對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎作出重新定義，骨性關(guān)節(jié)炎是指在力學(xué)和生物學(xué)因素的共同作用下，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯(lián)失衡的結(jié)果[1]。骨性關(guān)節(jié)炎的病理特征為關(guān)節(jié)軟骨局灶性缺如、骨贅形成、軟骨下骨改變及關(guān)節(jié)滑膜增生，其中，軟骨的異常改變是當(dāng)今研究的主要方向，不過(guò)目前對(duì)于該病的發(fā)病機(jī)制以及主要病因暫時(shí)沒(méi)有明確的報(bào)道[2]。軟骨細(xì)胞的主要功能是將機(jī)體軟骨的完整程度進(jìn)行良好維持，并使關(guān)節(jié)軟骨能夠獲得充分的負(fù)重能力[3]。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡在骨性關(guān)節(jié)炎患者的病程進(jìn)展中扮演重要角色，其與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有著緊密的聯(lián)系?，F(xiàn)從骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的基本概念、特征、誘發(fā)因素、凋亡途徑及其調(diào)節(jié)等方面進(jìn)行綜述。

1 骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的基本概述

有學(xué)者在1972年首次對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行描述，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的死亡方式有一定的區(qū)別，前者被稱為程序性細(xì)胞死亡[4]。研究認(rèn)為，在細(xì)胞中事先就存在導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的程序，在程序沒(méi)有被觸發(fā)時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)正常，若程序在各種因素影響下被觸發(fā)，則細(xì)胞凋亡隨即開(kāi)始。相關(guān)研究報(bào)道顯示，在骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中存在著軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡情況[5]。采用熒光激活細(xì)胞分類法對(duì)人類正常關(guān)節(jié)軟骨及骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：人類正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡占比約為5%，而骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存在20%左右的凋亡現(xiàn)象。在對(duì)家兔模型進(jìn)行研究對(duì)比時(shí)也發(fā)現(xiàn)了同樣現(xiàn)象，骨性關(guān)節(jié)炎模型對(duì)象的軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量及占比顯著增加，約為正常關(guān)節(jié)軟骨的5倍[6]。雖然現(xiàn)存理論說(shuō)明了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡與骨性關(guān)節(jié)炎之間有關(guān)聯(lián)性，但難以確定關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的根本原理及機(jī)制。多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為以下幾個(gè)環(huán)節(jié)可能對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，即：體內(nèi)信號(hào)傳遞系統(tǒng)、誘導(dǎo)因子、細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)因子以及蛋白水解鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等[7]。Fas配體、腫瘤壞死因子等軟骨細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體相結(jié)合，結(jié)合后對(duì)早期信號(hào)傳遞分子進(jìn)行聚集，鏈?zhǔn)椒磻?yīng)酶系統(tǒng)從而被激活，在依次激活的過(guò)程中，不斷放大死亡信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程[8]。

2 骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的特征

對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行連續(xù)切片觀察發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞的凋亡表現(xiàn)為病灶性，而非散在分布[9]。患者軟骨表面會(huì)受到細(xì)胞核固縮以及細(xì)胞破損的影響而出現(xiàn)數(shù)量較多的腔隙，且形態(tài)與基質(zhì)小泡樣及溶酶體空腔隙類似。骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨中層以及表層為出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的主要位置。雖然正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)凋亡，但大多位于表層，而且不會(huì)輕易被檢出[10]。

3 骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的誘發(fā)因素

3.1 生物化學(xué)因素 常見(jiàn)的生物化學(xué)因素主要包括藥物、毒素及重金屬等，這些因素均能使機(jī)體關(guān)節(jié)軟骨受到程度不一的影響[11]。例如，硝普鈉作為一氧化氮供體中的一種，會(huì)通過(guò)生產(chǎn)外源性一氧化氮，進(jìn)而引起軟骨細(xì)胞產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象，最終誘導(dǎo)產(chǎn)生疾病。再如，T-2毒素的毒性較強(qiáng)，極小的劑量即可對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞造成損傷，主要表現(xiàn)為促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡及變性，抑制軟骨細(xì)胞的增殖[12]。

3.2 物理因素 該因素在所有誘發(fā)因素中占據(jù)了較高的比重，占據(jù)著主導(dǎo)地位。常見(jiàn)的物理因素有紫外線輻射、熱休克和機(jī)械力學(xué)作用等[13]，上述因素均會(huì)致使患者軟骨細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。對(duì)于機(jī)械外力影響因素來(lái)講，機(jī)體還會(huì)受到組織被動(dòng)作用時(shí)間長(zhǎng)短及外力大小變化等因素的影響，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡的程度[14]。

3.3 年齡 長(zhǎng)期以來(lái)，骨性關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是一種退行性疾病。觀察表明，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制是多方面的，老齡化是其發(fā)展的關(guān)鍵因素。隨年齡增大，關(guān)節(jié)也會(huì)呈現(xiàn)出程度不同的勞損問(wèn)題，繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變、細(xì)胞凋亡逐步加重，引發(fā)原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎[15]。

3.4 氧化應(yīng)激 作為一種生物活性因子，活性氧簇可在機(jī)體病理狀態(tài)或一些生理狀態(tài)下產(chǎn)生[16]。過(guò)氧化氫產(chǎn)生后，一方面對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)進(jìn)行過(guò)氧化，另一方面可以調(diào)節(jié)其凋亡相關(guān)的基因，從而對(duì)機(jī)體軟骨細(xì)胞的增殖形成抑制，同時(shí)促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，最終破壞軟骨組織[17]。

4 骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的途徑

骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡主要包括兩種途徑[18]，一種為一氧化氮途徑，另一種為Fas途徑。

4.1 一氧化氮途徑 一氧化氮屬于細(xì)胞毒性物質(zhì)的一種，最早發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)八十年代。一氧化氮具有高度彌散性以及反應(yīng)性，廣泛存在于生物體中，可以形成無(wú)機(jī)小分子，繼而產(chǎn)生較強(qiáng)的殺傷效果[19]。一氧化氮主要通過(guò)以下兩種途徑對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎患者產(chǎn)生關(guān)節(jié)軟骨損傷作用。其一，一氧化氮在高濃度狀態(tài)下，可以對(duì)檸檬酸循環(huán)、線粒體電荷傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生的酶進(jìn)行抑制；其二，超氧化陰離子與一氧化氮作用后可產(chǎn)生過(guò)氧化亞硝基陰離子，最終形成具有較強(qiáng)毒性的自由基[20-21]。此外，還有一些臨床研究發(fā)現(xiàn)，外源性或內(nèi)源性一氧化氮都會(huì)以線粒體途徑作為介導(dǎo)，對(duì)患者機(jī)體的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)。軟骨細(xì)胞在通過(guò)一氧化氮、內(nèi)源性供體磷酸酯、活性氧及細(xì)胞色素C等因子干預(yù)后，其Caspases-3活性升高、DNA裂解加快，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[22]。研究顯示，在臨床中治療骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)，將L-單甲基精氨酸作為一氧化氮合酶抑制劑使用，可以使患者的一氧化氮等細(xì)胞凋亡標(biāo)志物表達(dá)降低[23]?？梢?jiàn)，在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡途徑中，一氧化氮途徑可能是誘導(dǎo)其凋亡的重要途徑之一。

4.2 Fas途徑 Fas屬于I型跨膜糖蛋白，位于細(xì)胞膜上，也被叫做Apo-1或者CD95，是腫瘤壞死因子或神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體中的一種。在人類軟骨細(xì)胞中，F(xiàn)as基因主要分布排列在第10號(hào)染色體。Fas途徑是一條公認(rèn)的細(xì)胞程序性死亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，且在很多細(xì)胞中都存在Fas表達(dá)[24]。Fas配體(FasL)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子家族成員,在外周淋巴組織中表達(dá),并可在T細(xì)胞激活過(guò)程中被誘導(dǎo)表達(dá)。FasL與Fas結(jié)合，會(huì)誘導(dǎo)出酪氨酸與絲氨酸/蘇氨的酸磷酸化反應(yīng)，使細(xì)胞中鈣離子水平升高、細(xì)胞Caspases-3活性升高、DNA裂解加快，促使軟骨細(xì)胞凋亡[25]。體外研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as及FasL的表達(dá)還受細(xì)胞密度的調(diào)節(jié)，低密度區(qū)細(xì)胞不僅Fas表達(dá)較高密度區(qū)細(xì)胞高，且Fas的激活也是高密度區(qū)細(xì)胞的1.5倍[26]。

5 骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)癌基因表達(dá)

5.1 c-myc 該基因在人體主要分布在第8號(hào)染色體，共包括3個(gè)外顯子，其蛋白質(zhì)由439個(gè)氨基酸組成，主要在細(xì)胞核內(nèi)存在。軟骨細(xì)胞處于正常狀態(tài)時(shí)，其細(xì)胞核中并沒(méi)有c-myc的表達(dá)，但處于凋亡狀態(tài)時(shí)，其細(xì)胞核中便會(huì)出現(xiàn)c-myc的陽(yáng)性表達(dá)[27]。有學(xué)者采用免疫組化、電鏡以及ELISA等將骨性關(guān)節(jié)炎與正常人的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，軟骨退變與其細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)，并且c-myc參與軟骨細(xì)胞的整個(gè)凋亡過(guò)程[28]。軟骨細(xì)胞因c-myc產(chǎn)生凋亡的主要原因是正常細(xì)胞周期失去了本該擁有的平衡狀態(tài)。

5.2 Bcl-2 該基因?qū)儆谝环N原癌基因，被發(fā)現(xiàn)于濾泡性淋巴瘤細(xì)胞的染色體易位處，能抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞壽命有一定的延長(zhǎng)作用。Bcl-2在機(jī)體中過(guò)表達(dá)會(huì)對(duì)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生一定的抑制作用[29]。有學(xué)者對(duì)健康成年人及骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的表達(dá)低于健康成年人[30]。這間接反映了機(jī)體對(duì)于細(xì)胞凋亡的自我調(diào)控，即可合理上調(diào)Bcl-2表達(dá)狀態(tài)，來(lái)促成對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)，進(jìn)一步避免其出現(xiàn)凋亡的情況。另有研究發(fā)現(xiàn)，缺乏Ⅱ型膠原的轉(zhuǎn)基因鼠軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的過(guò)凋亡狀態(tài)，同時(shí)其Bcl-2表達(dá)降低[31-32]。以上研究表明，細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)與骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)。其他凋亡抑制因子是否參與其中，在Bcl-2家族中是否存在對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響的其他成員，這些問(wèn)題暫無(wú)明確定論，還需進(jìn)一步探究。

5.3 p53 該基因主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，分為突變型及野生型。p53基因在健康關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)陰性，但在病態(tài)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性[33]。在機(jī)體細(xì)胞中，p53是重要的調(diào)節(jié)因子，能夠提供誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及限制細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)，且屬于關(guān)鍵信號(hào)。有動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，膝骨性關(guān)節(jié)炎兔較正常兔p53 mRNA水平以及細(xì)胞凋亡數(shù)量高，表明p53在促使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡中意義重大[34]。p53導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制主要包括兩個(gè)方面：一方面，p53可以對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)，致使細(xì)胞凋亡；另一方面，p53可以通過(guò)間接或直接的方式對(duì)細(xì)胞DNA的復(fù)制過(guò)程加以抑制。

6 核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路在骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡中的調(diào)節(jié)作用

NF-κB是1986年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，屬于一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，特異性結(jié)合免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子區(qū)域。它最初被認(rèn)為是B細(xì)胞分化和行使功能的調(diào)節(jié)因子，但后來(lái)被發(fā)現(xiàn)是各種細(xì)胞中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子[35]。NF-κB家族包括p65(RelA)、c-Rel、RelB、NF-κB1(p105/p50)和NF-κB2(p100/p52)，它們能兩兩結(jié)合形成同二聚體和各種異二聚體。其中，p65/p50異源二聚體最常見(jiàn)。NF-κB信號(hào)途徑的激活分為兩類，即“經(jīng)典”和“替代”途徑。經(jīng)典的NF-κB途徑由IKKβ調(diào)節(jié)，IKKβ由炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β或LPS激活；而選擇性NF-κB途徑則由一組TNFR超家族成員激活，包括CD40、淋巴毒素-β受體(LTβR)和NF-κB受體激活劑(RANK)[36]。

miRNA被認(rèn)為是新的炎癥調(diào)節(jié)因子，其中miR-93因其在凋亡和炎癥抑制方面的作用而備受關(guān)注。miR-93高表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡并減弱炎癥反應(yīng)[37]，miR-93靶向NF-κB p50亞單位促進(jìn)軟骨細(xì)胞存活及生長(zhǎng)。TLR4是NF-κB信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子[38]，被確定為軟骨細(xì)胞中miR-93的直接靶點(diǎn)，并受miR-93負(fù)調(diào)控。該受體是病原體識(shí)別受體之一，因其具有識(shí)別骨性關(guān)節(jié)炎中微生物或宿主衍生配體的能力而在骨性關(guān)節(jié)炎中受到關(guān)注。NF-κB在炎癥損傷的誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。在脂多糖(LPS)的刺激下，NF-κB從IκB分離并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核并調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡和破壞，最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，miR-93過(guò)表達(dá)在體外和體內(nèi)顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化[39]。綜合表明，miR-93通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和軟骨細(xì)胞凋亡。

NF-κB在軟骨細(xì)胞存活和凋亡中具有雙相作用。NF-κB可防止TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這種作用與誘導(dǎo)抗凋亡基因有關(guān)[40]。在軟骨細(xì)胞中，TNF-α誘導(dǎo)的凋亡也因NF-κB抑制而減少，NF-κB亞單位p65的Nkx3.2依賴性激活可增強(qiáng)ATDC5細(xì)胞的軟骨細(xì)胞存活并減少凋亡。同時(shí)，NF-κB也具有促凋亡功能。一些激活NF-κB的因子，如TCF4、SAM68和RIPK1，被發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的凋亡。此外[41]，NF-κB靶基因HIF-2α可加速Fas介導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡。

NF-κB可以直接或者間接誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶和其他骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)因子的表達(dá)，從而協(xié)調(diào)異常的軟骨細(xì)胞分解代謝途徑[42]。了解NF-κB激活在軟骨分解代謝途徑中的分子機(jī)制，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎的一些潛在治療靶點(diǎn)。

7 總結(jié)

目前，骨性關(guān)節(jié)炎有著年輕化發(fā)展的趨勢(shì)。生化、物理及年齡等均是骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的誘發(fā)因素；導(dǎo)致軟骨細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的途徑主要包括一氧化氮和Fas途徑，也與c-myc、Bcl-2及p53等相關(guān)癌基因的表達(dá)有關(guān)；NF-κB信號(hào)通路與新識(shí)別的基因或通路之間的相互作用也與軟骨細(xì)胞凋亡存在著內(nèi)在聯(lián)系。這些為臨床治療骨性關(guān)節(jié)炎提供了一定的理論支持。