酮咯酸通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子2信號(hào)通路抑制卵巢癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

馮艷坤，陳治軍

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是一種嚴(yán)重威脅世界女性生命的惡性腫瘤，其死亡率居女性癌癥之首［1］。卵巢癌具有高復(fù)發(fā)率、高侵襲性及易耐藥的特性，以至于其預(yù)后極差［2-4］。因此，開發(fā)新的治療藥物意義重大。非甾體類抗炎藥物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）目前在一些國(guó)家作為止痛劑用于原發(fā)性癌癥的手術(shù)，酮咯酸為其中之一［5］。胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）信號(hào)通路在很多腫瘤中均表現(xiàn)出活性異常升高，包括卵巢癌［6-7］。研究表明，酮咯酸可以減少乳腺癌的復(fù)發(fā)，其在卵巢癌中具發(fā)揮抑制癌癥惡化的作用，但是其具體的作用機(jī)制與IGF2信號(hào)通路之間的關(guān)系尚缺乏理論依據(jù)。本研究于2019年8月至2020年3月以卵巢癌細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察酮咯酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲及卵巢癌腫瘤的影響，其揭示其機(jī)制與酮咯酸抑制IGF2信號(hào)通路活性有關(guān)，將可為酮咯酸在卵巢癌治療中的應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌細(xì)胞SKOV3購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（american type culture collection，ATCC）；無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)BALB∕C裸鼠（18～20 g）30只，購(gòu)自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)生物有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK（湘）2016-0002，本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則；酮咯酸注射液購(gòu)自輝瑞公司；IGF2信號(hào)通路特異性抑制劑Linsitinib購(gòu)自MCE；杜氏細(xì)胞培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清均購(gòu)自杭州四季青；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒購(gòu)自GLPBIO；Transwell小室購(gòu)自corning；LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購(gòu)自上海安普公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒購(gòu)自北京Leagene；電化學(xué)發(fā)光（electronics components laboratory，ECL）試劑盒和RIPA蛋白裂解液購(gòu)自碧云天；兔抗人IGF2、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（Insulinlike growth factor 1 receptor，IGF1R）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體及兔抗鼠IGF2、IGF1R和GAPDH多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞SKOV3使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組SKOV3細(xì)胞分為正常對(duì)照組（NC組）、不同濃度（0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L）酮咯酸組。NC組細(xì)胞正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；酮咯酸組細(xì)胞分別用含0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L酮咯酸培養(yǎng)48 h。將二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解的1 μmol的Linsitinib處理的SKOV3細(xì)胞標(biāo)記為L(zhǎng)insitinib組，含等量DMSO的培養(yǎng)基處理的SKOV3細(xì)胞標(biāo)記為DMSO組。用脂質(zhì) 體法 將pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-IGF2轉(zhuǎn)染 至SKOV3細(xì)胞，并用1.00 g∕L的酮咯酸處理48 h，分別標(biāo)記為酮咯酸+pcDNA 3.1組、酮咯酸+pcDNA 3.1-IGF2組。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞抑制率調(diào)整細(xì)胞至105個(gè)∕毫升，接種到96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入CCK-8溶液20 μL，490 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度（optical density，OD）值。細(xì)胞存活率（%）=（1-OD實(shí)驗(yàn)組∕OD對(duì)照組）×100%。

1.2.4 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲收集細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后取100 μL加入小室上室內(nèi)。在小室下室加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL。將小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出后用棉簽輕輕拭去上室下表面的細(xì)胞，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行甲醇固定和結(jié)晶紫染色，最后在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)。

細(xì)胞的遷移和侵襲檢測(cè)均按照以上操作方法進(jìn)行，不同之處在于檢測(cè)侵襲所選用的小室膜上表面鋪有基質(zhì)膠，需要在37℃溫箱進(jìn)行凝固。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中IGF2、IGF1R的蛋白表達(dá)收集細(xì)胞或研磨好的腫瘤組織，用細(xì)胞裂解液對(duì)其裂解，結(jié)束后，用沸水浴法對(duì)蛋白進(jìn)行變性，12 000 rpm，離心5 min，取上清液，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。將準(zhǔn)備好的雙層電泳膠中的梳子輕輕拔出，小心將樣品打入梳子孔，避免產(chǎn)生氣泡。打開電泳槽電源先進(jìn)性穩(wěn)流電泳，再進(jìn)行穩(wěn)壓電泳。結(jié)束后，在轉(zhuǎn)膜儀上進(jìn)行低溫轉(zhuǎn)膜，然后進(jìn)行脫脂奶粉封閉2 h。最后將稀釋好的兔抗人IGF2（1∶1 000）、IGF1R（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗進(jìn)行4℃孵育24 h。洗膜3次，在用稀釋好的山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，結(jié)束后洗膜。顯影曝光，用ECL顯影試劑盒在暗室中進(jìn)行顯影、曝光和定影。最后用Quantity One凝膠分析軟件對(duì)膠片進(jìn)行處理，測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)取0.2 mL濃度為1×106個(gè)∕毫升的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，接種至裸鼠右前肢，SPF環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)。接種后1周后，出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤。然后把SPF裸鼠分為NC組和酮咯酸組，每組10只。酮咯酸組裸鼠灌胃5 mg∕kg酮咯酸，NC組裸鼠灌胃等量生理鹽水，每3天灌胃1次。每周1次，測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)直徑a（mm）和最短直徑b（mm），腫瘤體積V=a×b2×0.52計(jì)算腫瘤體積（mm3），取平均值。第21天時(shí)處死裸鼠，小心剝離腫瘤組織，稱量瘤體質(zhì)量。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)組織中IGF2、IGF1R蛋白表達(dá)，其中IGF2、IGF1R稀釋度均為1∶1 000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)中所用數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間多重比較采用one-way ANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酮咯酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用NC組、不同劑量（0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L）酮咯酸組細(xì)胞抑制率分別為（0.02±0.00）%、（6.99±0.06）%、（23.31±2.11）%、（51.39±6.91）%、（76.14±4.36）%，五組間比較差異顯著（F=639.34，P＜0.001）。與NC組相比，不同劑量（0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L）酮咯酸組SKOV3細(xì)胞抑制率均顯著升高（P＜0.001），且具有劑量依賴性。由于1.0 g∕L的酮咯酸對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制率接近50%，故選用1.0 g∕L酮咯酸用于后續(xù)研究。

2.2 酮咯酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響NC組、酮咯酸組細(xì)胞遷移數(shù)分別為（103±9）個(gè)、（54±5）個(gè)，侵襲數(shù)分別為（76±6）個(gè)、（41±4）個(gè)。與NC組相比，酮咯酸組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著降低（t=14.27、14.56；均P＜0.001），見圖1。

2.3 酮咯酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞中IGF2信號(hào)通路的影響NC組、酮咯酸組細(xì)胞中IGF2蛋白表達(dá)分別為1.01±0.06、0.31±0.03，IGF1R蛋白表達(dá)分別為0.99±0.08、0.26±0.02。與NC組相比，酮咯酸組細(xì)胞中IGF2和IGF1R蛋白表達(dá)均顯著降低（t=31.30、26.55；均P＜0.001）。見圖2。

圖2 酮咯酸對(duì)SKOV3細(xì)胞中IGF2和IGF1R蛋白表達(dá)的影響

2.4 IGF2抑制劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響與NC組或DMSO組相比，Linsitinib組細(xì)胞中IGF2和IGF1R蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.001），細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著降低（P＜0.001），而NC組與DMSO組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3，4；表1。

圖3 IGF2抑制劑對(duì)SKOV3細(xì)胞中IGF2和IGF1R蛋白表達(dá)影響

表1 IGF2抑制劑對(duì)SKOV3細(xì)胞中IGF2、IGF1R蛋白表達(dá)及遷移和侵襲的影響

表1 IGF2抑制劑對(duì)SKOV3細(xì)胞中IGF2、IGF1R蛋白表達(dá)及遷移和侵襲的影響

注：IGF2為胰島素樣生長(zhǎng)因子2蛋白，IGF1R為胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體蛋白。①與NC組或DMSO組比較，P＜0.05。

組別NC組DMSO組Linsitinib F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 IGF2 0.98±0.05 1.00±0.07 0.28±0.02①582.00＜0.001 IGF1R 0.99±0.06 1.02±0.08 0.29±0.02①442.99＜0.001遷移98±9 99±7 63±6①68.36＜0.001侵襲73±6 75±6 51±5①49.36＜0.001

2.5 過(guò)表達(dá)IGF2逆轉(zhuǎn)了酮咯酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用與酮咯酸組或酮咯酸+pcDNA 3.1組相比，酮咯酸+pcDNA 3.1-IGF2組細(xì)胞中IGF2和IGF1R蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著升高（P＜0.05），而酮咯酸組與酮咯酸+pcDNA 3.1組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5，6；表2。

圖5 過(guò)表達(dá)IGF2逆轉(zhuǎn)了酮咯酸對(duì)SKOV3細(xì)胞中IGF2、IGF1R蛋白表達(dá)及遷移和侵襲的影響

表2 過(guò)表達(dá)IGF2逆轉(zhuǎn)了酮咯酸對(duì)SKOV3細(xì)胞中IGF2、IGF1R蛋白表達(dá)及遷移和侵襲的影響∕s

表2 過(guò)表達(dá)IGF2逆轉(zhuǎn)了酮咯酸對(duì)SKOV3細(xì)胞中IGF2、IGF1R蛋白表達(dá)及遷移和侵襲的影響∕s

注：IGF2為胰島素樣生長(zhǎng)因子2蛋白，IGF1R為胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體蛋白。①與酮咯酸對(duì)+空載體組比較，P＜0.05。

組別酮咯酸酮咯酸+pcDNA 3.1酮咯酸+pcDNA 3.1-IGF2 F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 IGF2 0.31±0.03 0.33±0.04 1.28±0.13①427.69＜0.001 IGF1R 0.26±0.02 0.27±0.03 1.19±0.12①490.53＜0.001遷移52±5 53±5 87±7①108.27＜0.001侵襲44±4 42±4 75±6①135.92＜0.001

2.6 酮咯酸對(duì)裸鼠成瘤及IGF2信號(hào)通路的影響與NC組相比，酮咯酸組裸鼠腫瘤的質(zhì)量和體積均顯著降低（P＜0.001），腫瘤組織中IGF2和IGF1R蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.001）。見圖7，表3。

圖7 酮咯酸對(duì)裸鼠腫瘤組織中IGF2和IGF1R蛋白表達(dá)的影響

表3 酮咯酸對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)和IGF2和IGF1R蛋白表達(dá)的影響∕

表3 酮咯酸對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)和IGF2和IGF1R蛋白表達(dá)的影響∕

注：IGF2為胰島素樣生長(zhǎng)因子2蛋白，IGF1R為胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體蛋白。①與NC組比較，P＜0.05。

組別NC組酮咯酸t(yī)值P值重復(fù)次數(shù)10 10腫瘤灶質(zhì)量1.01±0.07 0.53±0.05①17.65＜0.001腫瘤灶體積1.00±0.04 0.55±0.05①22.22＜0.001 IGF2 0.99±0.08 0.46±0.04①18.74＜0.001 IGF1R 0.97±0.09 0.52±0.05①13.82＜0.001

3 討論

酮咯酸在癌癥治療中可用于控制癌癥相關(guān)的疼痛，并在癌癥手術(shù)期間和手術(shù)后用作止痛劑［8-9］。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，酮咯酸在癌癥中的新功能也不斷被發(fā)現(xiàn)。Desmedt等［10］在研究中發(fā)現(xiàn)，酮咯酸治療可以明顯的降低原發(fā)性乳腺癌治療后的復(fù)發(fā)率，這是酮咯酸在乳腺癌治療中發(fā)現(xiàn)的新功能，為酮咯酸的功能開發(fā)提供參考。在卵巢癌的系列研究中報(bào)道，酮咯酸可通過(guò)直接作用于細(xì)胞分裂 控 制 蛋 白42（cell division control protein 42，Cdc42）和Ras相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物（Substrates of Ras-associated C3 botulinum toxin，Rac1）參與卵巢癌細(xì)胞的遷移侵襲能力的調(diào)控［11-12］。最近，Hudson等［13］闡明，反式手性的酮咯酸在疼痛控制中具有功效，順勢(shì)手性的酮咯酸可能夠通過(guò)Rac1、Cdc42在癌癥中發(fā)揮益處，二者在卵巢癌中具有不同的作用靶點(diǎn)。

基于以上研究成果，我們推測(cè)酮咯酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞和腫瘤生長(zhǎng)應(yīng)該具有一定的調(diào)控作用。本研究檢測(cè)了酮咯酸處理的卵巢癌細(xì)胞的抑制率發(fā)現(xiàn)，酮咯酸可呈濃度依賴性抑制卵巢癌細(xì)胞，且可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲；重要的是，酮咯酸還可以抑制體內(nèi)裸鼠成瘤的生長(zhǎng)，這說(shuō)明酮咯酸在卵巢癌中確實(shí)具有抑制癌癥進(jìn)一步惡化的功能，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［14］。深入研究，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)酮咯酸處理的卵巢癌細(xì)胞中IGF2信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白IGF2、IGF1R的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，酮咯酸可下調(diào)IGF2、IGF1R表達(dá)，抑制IGF2信號(hào)通路的活性，猜測(cè)IGF2信號(hào)通路可能參與酮咯酸在卵巢癌中的功能。

IGF2信號(hào)通路具有多種生長(zhǎng)因子受體，包括胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）、胰島素受體（insulin receptor，IR），這些受體在與它們各自的胰島素生長(zhǎng)因子配體IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ結(jié)合后被激活，并在腫瘤的發(fā)展、存活和化學(xué)治療中起重要作用［15-17］。在許多臨床前研究中，抗IGF-1R∕IR靶向策略被證明可有效減少卵巢癌的生長(zhǎng)［18］。Tian等［19］在研究中發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)IGF2信號(hào)通路通過(guò)右美托咪定的介導(dǎo)對(duì)卵巢癌大鼠免疫功能及癌細(xì)胞侵襲遷移產(chǎn)生影響。Gao等［20］在卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)IGF2能夠促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)一步惡性化發(fā)展。由此可見，IGF2信號(hào)通路在卵巢癌中的功能已得到肯定，推測(cè)其與酮咯酸的功能之間應(yīng)該也存在一定聯(lián)系。

本研究檢測(cè)了酮咯酸處理的卵巢癌細(xì)胞中IGF2信號(hào)通路的活性發(fā)現(xiàn)，酮咯酸可抑制該通路的活化，這也說(shuō)明了酮咯酸在卵巢癌中發(fā)揮抗癌作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制IGF2信號(hào)通路能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而激活I(lǐng)GF2信號(hào)通路則能夠逆轉(zhuǎn)酮咯酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移侵襲抑制作用，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明了不僅酮咯酸能夠抑制IGF2信號(hào)通路的活性，相反，IGF2信號(hào)通路也可以反向逆轉(zhuǎn)酮咯酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用。為了更充分的揭示酮咯酸在卵巢癌中與IGF2信號(hào)通路之間的作用關(guān)系，我們又進(jìn)行了體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酮咯酸不僅可抑制裸鼠體內(nèi)卵巢癌腫瘤的生長(zhǎng)，還可抑制IGF2信號(hào)通路的活性。

綜上所述，酮咯酸可抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移侵襲和腫瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制與失活I(lǐng)GF2信號(hào)通路相關(guān)，為酮咯酸用于卵巢癌的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

（本文圖1，4，6見插圖1-7）