白藜蘆醇通過調(diào)控微小RNA-574-3p對(duì)高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞增殖、炎癥水平及氧化應(yīng)激的影響研究

劉立棟，徐臘梅，高潔，李潔，邵英，田雄濤，劉曉宇

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，是終末期腎臟疾病的主要原因之一［1］。目前，DN在糖尿病病人中占全球并發(fā)癥的30%以上［2］，吸引了許多研究人員的目光。DN的特征是腎小球中細(xì)胞外基質(zhì)成分的過量產(chǎn)生和積累，最終可能導(dǎo)致腎小球硬化［3］。眾所周知，腎小球系膜細(xì)胞（mesangial cells，MC）在維持腎小球完整性方面起著重要作用，并負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的積累［4］。先前的研究表明，高葡萄糖誘導(dǎo)的MC增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積累是DN中最重要的病理變化，隨著DN進(jìn)程中氧化應(yīng)激的長(zhǎng)期激活和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，可能進(jìn)一步加重DN［5］。根據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇能以劑量依賴性方式降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠胰島素抵抗，并改善DN大鼠的腎臟功能和脂質(zhì)代謝［6］。白藜蘆醇可以減輕糖尿病小鼠的蛋白尿，降低丙二醛含量，同時(shí)增加錳超氧化物歧化酶（manganese-superoxide dismutase，Mn-SOD），抑制腎小球足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，從而改善糖尿病小鼠的足細(xì)胞損傷［7］。白藜蘆醇通過自噬增加轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)微小RNA（MicroRNA，miRNA）-18a-5p表達(dá)，改善DN［8］。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在人的DN中起著重要作用［9］。其中miR-574-3p在DN病人中的表達(dá)下調(diào)［10］。然而白藜蘆醇在DN中的功能機(jī)制是否涉及miR-574-3p仍未可知。因此，本研究旨在2019年1月1日至2020年6月1日調(diào)查白藜蘆醇對(duì)暴露于高葡萄糖的大鼠腎小球系膜細(xì)胞（rat mesangial cells，RMC）的增殖、遷移、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，并初步探索白藜蘆醇的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、細(xì)胞與試劑白藜蘆醇（美國(guó)Sigma公司），RMC（武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心），Lipofectamine 2000、TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司），miScript RT試劑盒和miScript PCR系統(tǒng)（上海Qiagen公司），anti-miR-574-3p、anti-miR-NC（上海GenePharma公司），噻唑基藍(lán)四唑溴化物（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT；上海生工生物公司），白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（英國(guó)Abcam公司），丙二醛、乳酸脫氫酶（lactate dehydrofenase，LDH）檢測(cè)試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理將RMC在含有5.3 mmoL∕L葡萄糖和10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中于37℃，5%二氧化碳和95%空氣中培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)RMC，并根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行分組，共八組：（1）白藜蘆醇作用實(shí)驗(yàn)：正常對(duì)照組（NG，葡萄糖濃度為5.3 mmoL），高糖組（HG，葡萄糖濃度為30 mmoL［11］），HG+低劑量組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為5 μmoL），HG+中劑量組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為10 μmoL），HG+高劑量組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為20 μmoL［12］）。（2）白藜蘆醇機(jī)制實(shí)驗(yàn)：HG+中劑量組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為10 μmoL），HG+中劑量+anti-miR-NC組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為10 μmoL，轉(zhuǎn)染anti-miR-NC），HG+中劑量+anti-miR-574-3p組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為10 μmoL，轉(zhuǎn)染anti-miR-574-3p）。其中，葡萄糖和白藜蘆醇的作用時(shí)間為48 h。RMC轉(zhuǎn)染時(shí)，依照Lipofectamine 2000制造商（美國(guó)Invitrogen）的說明步驟，將anti-miR-574-3p及anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染RMC，24 h后用葡萄糖和白藜蘆醇繼續(xù)處理48 h，即為HG+中劑量+anti-miR-574-3p組和HG+中劑量+anti-miR-NC組。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖RMC以5×103細(xì)胞∕孔的密度接種在96孔板中，并在完全DMEM中培養(yǎng)。當(dāng)RMC匯合率為70%～80%時(shí)，根據(jù)“1.2”中八組進(jìn)行分組及實(shí)驗(yàn)處理，處理結(jié)束后，將10 μL MTT溶液（5 g∕L）添加到每個(gè)孔中，然后孵育4 h。丟棄MTT溶液后，將DMSO加入每個(gè)孔中，并在室溫下孵育10 min。最后，用酶標(biāo)儀在490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度OD值。

1.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移收集“1.2”分組的八組RMC在無血清DMEM中懸浮，將1×105個(gè)RMC接種到Transwell上室，同時(shí)將含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基放入下室。培養(yǎng)24 h后，將殘留在上膜上的細(xì)胞丟棄，固定貼壁于膜下的細(xì)胞，用0.5%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下對(duì)3個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行了計(jì)數(shù)，其平均值作為細(xì)胞遷移數(shù)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（western blotting）檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21蛋白表達(dá)使用蛋白質(zhì)提取試劑盒從“1.2”分組的八組RMC中提取總蛋白質(zhì)。然后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。使用抗Cyclin D1抗體（1∶1 000），抗p21抗體（1∶1 000），抗β-actin抗體（1∶1 000）與膜4℃孵育12 h。隨后在室溫下將膜與結(jié)合HRP的二抗（1∶3 000稀釋）孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑可視化印跡。

1.6 ELISA檢測(cè)炎性因子IL-1β、TNF-α水平收集“1.2”分組的八組RMC培養(yǎng)上清液，使用商購(gòu)的英國(guó)Abcam公司的ELISA分析試劑盒，根據(jù)制造商的說明檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-1β和TNF-α水平。

1.7 試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激因子丙二醛、LDH水平收集“1.2”分組的八組RMC培養(yǎng)上清液，根據(jù)上海碧云天生物技術(shù)研究所的丙二醛、LDH檢測(cè)試劑盒的說明步驟，通過比色法測(cè)定丙二醛、LDH水平。

1.8 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)miR-574-3p表達(dá)“1.2”分組的八組RMC的RNA在TRIzol試劑中，嚴(yán)格按照美國(guó)Invitrogen制造商的方案進(jìn)行分離。使用miScript RT試劑盒和miScript PCR系統(tǒng)根據(jù)上海Qiagen公司的方案進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)如下：miR-574-3p正向引物序列為5’-GAGGGACAGGCCTCCTTACTC-3’，反向引物序列為5’-GCTTGTGTCCGAAGGAACGGCC-3’；U6正向引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列為5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’。擴(kuò)增條件如下：93℃變性30 s，64℃退火30 s，73℃延伸40 s，總共34個(gè)循環(huán)，和72℃延伸8 min。使用ABI 7500熒光定量操作系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析和比較。所有樣品均一式三份運(yùn)行，并使用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-574-3p相對(duì)于U6的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)表示為xˉ±s。多組定量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析的方法，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)的方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC細(xì)胞增殖和遷移的影響MTT、蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組RMC細(xì)胞活性增強(qiáng)，Cyclin D1蛋白表達(dá)量升高，p21蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與HG組相比，HG+低劑量組、HG+中劑量組和HG+高劑量組RMC細(xì)胞活性均逐漸減弱，Cyclin D1蛋白表達(dá)量降低，p21蛋白表達(dá)量升高，細(xì)胞遷移數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1，2；表1。

圖1 各處理組RMC細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和p21表達(dá)變化

表1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC細(xì)胞增殖和遷移的影響∕xˉ±s

2.2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC炎癥、氧化應(yīng)激和miR-574-3p表達(dá)的影響ELISA、試劑盒的結(jié)果表明，與NG組相比，HG組RMC炎性因子IL-1β、TNF-α水平增加，氧化應(yīng)激因子丙二醛、LDH水平同樣增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與HG組相比，HG+低劑量組、HG+中劑量組和HG+高劑量組RMC的IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平均逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。qRT-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，HG組RMC中miR-574-3p表達(dá)量低于NG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HG+低劑量組、HG+中劑量組和HG+高劑量組RMC的miR-574-3p表達(dá)量均高于HG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC炎癥及氧化應(yīng)激和miR-574-3p表達(dá)的影響

表2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC炎癥及氧化應(yīng)激和miR-574-3p表達(dá)的影響

注：IL為白細(xì)胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，LDH為乳酸脫氫酶。①與NG相比，P＜0.05。②與HG相比，P＜0.05。

2.3 抑制miR-574-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC細(xì)胞增殖和遷移的影響qRT-PCR、MTT、western blotting的結(jié)果顯示，HG+中劑量+antimiR-574-3p組RMC的miR-574-3p表達(dá)量比HG+中劑量組低，細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移數(shù)、Cyclin D1蛋白表達(dá)量比HG+中劑量+anti-miR-NC組高，并且p21蛋白表達(dá)量比HG+中劑量組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但上述指標(biāo)在HG+中劑量組與HG+中劑量+anti-miR-NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3，4；表3。

表3 抑制miR-574-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC細(xì)胞增殖和遷移的影響

表3 抑制miR-574-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC細(xì)胞增殖和遷移的影響

注：p21為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A，OD為光密度，p21為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A，Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1。①與HG+中劑量組比較，P＜0.05。

圖3 各處理組RMC細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和p21表達(dá)變化

2.4 抑制miR-574-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC炎癥及氧化應(yīng)激的影響ELISA、試劑盒的結(jié)果表明，與HG+中劑量組相比，HG+中劑量+anti-miR-574-3p組RMC中IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平在HG+中劑量組與HG+中劑量+anti-miR-NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 抑制miR-574-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC炎癥及氧化應(yīng)激的影響

表4 抑制miR-574-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC炎癥及氧化應(yīng)激的影響

注：IL為白細(xì)胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，LDH為乳酸脫氫酶。①與HG+中劑量組相比，P＜0.05。

組別HG+中劑量HG+中劑量+anti-miR-NC HG+中劑量+anti-miR-574-3p F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9炎性因子IL-1β∕（μg∕L）41.78±1.79 43.56±1.57 63.33±1.15①51.21＜0.001 TNF-α∕（μg∕L）24.00±1.08 24.78±0.78 42.33±1.55①77.50＜0.001氧化應(yīng)激因子丙二醛∕（μmoL∕g）35.89±1.28 35.78±0.76 51.56±1.52①54.48＜0.001 LDH∕（U∕L）52.33±2.17 53.33±1.64 82.22±1.75①82.82＜0.001

3 討論

DN是導(dǎo)致末期腎臟疾病的最常見原因之一，可導(dǎo)致糖尿病病人死亡。腎小球MC是一種腎臟固有細(xì)胞，越來越多的證據(jù)表明，MC異常增殖和遷移在腎小球損傷引起的腎小球性腎炎的發(fā)病機(jī)理中起作用［13］，并且它們與DN的發(fā)生和發(fā)展高度相關(guān)［14］。MC增殖的增加被認(rèn)為是DN的重要特征［15］。已有報(bào)道證實(shí)，高糖刺激可增強(qiáng)MC的增殖［14-15］。過度的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是DN發(fā)病的關(guān)鍵致病因素［16］。DN早期某些炎性因子如TNF-α，IL-1β，IL-6的分泌失調(diào)，促進(jìn)DN的發(fā)展［17］。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致DN發(fā)生的另一個(gè)重要因素。過度的氧化應(yīng)激會(huì)激活凋亡信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，這在DN的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用［15］。已有文獻(xiàn)證明，高糖處理可誘導(dǎo)MC中氧化應(yīng)激因子（如SOD、丙二醛）和炎性細(xì)胞因子（如TNF-α，IL-1β和IL-6）的產(chǎn)生［18］。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和炎癥將是保護(hù)MC免受高糖損傷的重要方法，并可能增進(jìn)對(duì)DN的發(fā)病機(jī)制和治療方法的了解。本研究利用高糖損傷RMC，觀察到高糖使RMC的細(xì)胞活性和遷移能力增強(qiáng)，并刺激炎性因子IL-1β、TNFα和氧化應(yīng)激因子丙二醛、LDH的產(chǎn)生，與前述報(bào)道相符，表明成功建立高糖損傷RMC模型。

中藥已在許多研究中廣泛用于治療和控制糖尿病及其并發(fā)癥，例如DN，并且可能提供DN機(jī)制的見解，并成為藥物的有益補(bǔ)充劑DN的治療［19-20］。白藜蘆醇是一種天然植物多酚，具有抗氧化，抗炎、抗糖尿病、保肝、神經(jīng)保護(hù)和抗癌的特性［21］。先前的研究還表明，白藜蘆醇可以減弱DN的進(jìn)展，例如白藜蘆醇通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)腎小管細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的DN細(xì)胞凋亡［22］。白藜蘆醇可以抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，而有效地減輕了DN的腎臟損害［23］。白藜蘆醇可能通過激活A(yù)MPK，降低4E-BP1和S6磷酸化，發(fā)揮抗增殖、抗肥大作用，從而抑制DN的發(fā)生發(fā)展［12］。但是，其作用機(jī)制仍不清楚。與先前報(bào)道［24］的結(jié)果一致，本研究觀察到，白藜蘆醇一方面可緩解高糖誘導(dǎo)的RMC增殖，并觀察到Cyclin D1蛋白的下調(diào)與p21蛋白的上調(diào)。另一方面，白藜蘆醇減輕高糖誘導(dǎo)的RMC細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平。這些結(jié)果表明，白藜蘆醇抑制了高糖刺激的RMC的增殖、遷移、氧化應(yīng)激和炎癥，與前人報(bào)道的白藜蘆醇改善DN的效果［22-23］相吻合。

資料顯示，白藜蘆醇通過miR-30d-5p∕SIRT1∕NF-κB軸保護(hù)H9c2細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的凋亡［25］。白藜蘆醇通過下調(diào)miR-34a，顯著降低卵清蛋白誘發(fā)的哮喘小鼠血清和支氣管肺泡液中的IL-5，IL-13和TGF-β，減輕肺部過敏性哮喘和相關(guān)炎癥［26］。本研究假設(shè)白藜蘆醇保護(hù)高糖損傷RMC的作用與miR-574-3p有 關(guān)。miR-574-3p是 卵 巢 癌［27］、食 道癌［28］、結(jié)直腸癌［29］等腫瘤的抑制劑，被報(bào)道在慢性中風(fēng)的病人［30］中表達(dá)下調(diào)，可能作為疾病的可診斷或治療靶點(diǎn)的miRNA。本研究以高糖損傷RMC模型，檢測(cè)到高糖使RMC中miR-574-3p的表達(dá)顯著下調(diào)，這與前人報(bào)道的miR-574-3p在DN病人［9］中低表達(dá)的結(jié)果吻合，提示miR-574-3p可能是DN進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子。而白藜蘆醇能夠顯著提高高糖誘導(dǎo)后RMC中miR-574-3p的表達(dá)，并且，抑制miR-574-3p表達(dá)后，白藜蘆醇抑制高糖誘導(dǎo)的RMC細(xì)胞增殖、遷移、炎癥及氧化應(yīng)激的影響被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，miR-574-3p的上調(diào)可能是白藜蘆醇保護(hù)MC免受高糖損傷的作用機(jī)制之一。

總之，本研究表明，不同濃度的白藜蘆醇可以抑制高糖誘導(dǎo)的RMC增殖、遷移、炎癥和氧化應(yīng)激，機(jī)制與上調(diào)miR-574-3p表達(dá)有關(guān)。表明白藜蘆醇可能成為DN治療的有價(jià)值的藥物。鑒于本研究體外實(shí)驗(yàn)的局限性，有必要在將來進(jìn)行進(jìn)一步研究，以了解miR-574-3p在DN中的詳細(xì)作用。

（本文圖2，4見插圖1-1）

圖2 各處理組腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞遷移情況（結(jié)晶紫染色×200） 圖4 抑制miR-574-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC細(xì)胞遷移的影響（結(jié)晶紫染色×200）