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      益氣活血方對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬突觸可塑性的影響*

      2023-01-05 03:02:12李佩佩王又聞王麗娜胡建鵬
      中國(guó)病理生理雜志 2022年12期
      關(guān)鍵詞:可塑性腦缺血海馬

      李佩佩,時(shí) 瀟,王 瑞,王又聞,王麗娜,胡建鵬△

      (1安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安微 合肥 230012;2安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,安微 合肥 230012;3上海中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,上海 201203)

      缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是致死率、致殘率極高的腦血管疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì),有接近65%左右幸存的患者伴有不同程度的神經(jīng)功能障礙,嚴(yán)重影響到患者的生存質(zhì)量[1-3]。目前,最有效的治療方法是快速恢復(fù)血液供應(yīng),但血管再通引起的腦缺血再灌注損傷(reperfusion injury,RI)可進(jìn)一步加重腦損傷和神經(jīng)功能障礙[4]。研究證實(shí)[5],腦缺血后引起學(xué)習(xí)和記憶等神經(jīng)功能障礙與神經(jīng)元丟失、突觸數(shù)量及結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān),如何激活并誘導(dǎo)神經(jīng)元突觸可塑性的修復(fù)機(jī)制,是當(dāng)前神經(jīng)功能恢復(fù)研究的重點(diǎn)問(wèn)題。

      中醫(yī)藥對(duì)于腦卒中有良好的治療和預(yù)防作用,可通過(guò)改善神經(jīng)元微環(huán)境,誘導(dǎo)突觸的結(jié)構(gòu)和功能再建,發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)的作用[6-7]。益氣活血方(Yiqi-Huoxue decoction,YQHXD;腦絡(luò)欣通)是基于“氣血-腦髓”相關(guān)理論對(duì)缺血性中風(fēng)進(jìn)行辨證施治的特色方劑,我們的前期研究證實(shí)該方具有抗炎、抗氧化、保護(hù)血腦屏障和促進(jìn)血管新生等多種藥理作用[8-11],但對(duì)改善學(xué)習(xí)記憶功能以及突觸可塑性變化的研究較少。突觸可塑性相關(guān)蛋白是突觸可塑性的物質(zhì)基礎(chǔ)[12],突觸小泡蛋白(synaptophysin,SYN)和突觸后致密物95(postsynaptic density 95,PSD95)分別參與了突觸前和突觸后的重塑、傳遞過(guò)程,是突觸重建的重要標(biāo)志物[13]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)系統(tǒng)中分布最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,可通過(guò)調(diào)節(jié)下游不同信號(hào)級(jí)聯(lián)分子調(diào)控大腦不同區(qū)域的突觸結(jié)構(gòu)和功能,并認(rèn)為與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān),對(duì)腦缺血損傷組織發(fā)揮著內(nèi)源性保護(hù)作用[14]。本研究通過(guò)益氣活血方干預(yù)大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型大鼠,觀察海馬區(qū)突觸數(shù)目、形態(tài)結(jié)構(gòu)和突觸可塑性相關(guān)蛋白BDNF、SYN和PSD95的變化,旨在探討益氣活血方對(duì)腦缺血RI大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和突觸可塑性的影響,以期為臨床益氣活血方治療IS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      材料和方法

      1 實(shí)驗(yàn)材料

      1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠60只,9~10周齡,體質(zhì)量280~320 g,購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué),動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(皖)2017-001。飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,康為IR60獨(dú)立送風(fēng)隔離飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng),室內(nèi)溫度(22±1)℃、相對(duì)濕度(45±5)%,光暗周期12 h。大鼠分籠喂養(yǎng),自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范(動(dòng)物倫理編號(hào):AHUCM-rats-2022028)。

      1.2 藥物腦絡(luò)欣通濃縮液由黃芪、川芎、三七、當(dāng)歸、紅花、天麻和蜈蚣組成,飲片購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)專家鑒定。煎煮方式[15]:將所有藥材放入砂罐中,量筒量取8倍純凈水(640 mL),浸泡約30 min;然后加熱煮沸10 min,轉(zhuǎn)小火熬煮1 h,過(guò)濾得到藥渣與煎出液;繼續(xù)向砂罐中加入6.4倍純凈水(512 mL),加熱煮沸后保持小火微沸1 h,過(guò)濾合并兩次煎煮液,經(jīng)布氏漏斗過(guò)濾,再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至1 mL(含生藥1.08 g),于4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

      1.3 主要試劑與儀器主要試劑:戊巴比妥鈉鹽(Sigma);戊二醛(Ted Pella);環(huán)氧丙烷(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司);抗PSD95、SYN和BDNF抗體(Affinity);GAPDH抗體(杭州賢至生物有限公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(武漢博士德生物工程有限公司);RIPA裂解液和BCA試劑盒(碧云天生物科技有限公司)。主要儀器:激光多普勒儀(PeriFlux5001);Morris水迷宮和圖像自動(dòng)采集分析系統(tǒng)(Videomot2,TSE systems GmbH Bad Homburg);BT100-2J型蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器(保定蘭格恒流泵有限公司);TB-718生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(泰維電子設(shè)備有限 公 司);CM1900超薄切片機(jī)(Leica);JEM-1400Flash透射電鏡(日本電子株式會(huì)社);BX-51光學(xué)顯微鏡(Olympus)。

      2 方法

      2.1 大鼠MCAO/R模型的制備及判定大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁食12 h,自由飲水。0.3%戊巴比妥鈉溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物,參照Longa法[16]并加以改良制備大鼠右側(cè)MCAO/R模型。手術(shù)過(guò)程中全程采用激光多普勒儀監(jiān)測(cè)大鼠缺血區(qū)(顱骨冠狀線后方1 mm,矢狀線右側(cè)5 mm交匯處)血流量,見(jiàn)圖1。插入線栓后血流量下降約70%以上,阻斷2 h后,緩慢拔出線栓約5 mm,恢復(fù)至初始血流量的60%~70%,視為模型制備成功[17]。假手術(shù)組大鼠僅分離血管,不插入線栓。術(shù)中室溫保持在24~25℃,并用保溫墊保持大鼠體溫恒定在37℃。

      Figure 1.The regional cerebral blood flow(rCBF)traces were recorded by laser Doppler flowmetry during the MCAO/R procedure.圖1大鼠手術(shù)過(guò)程激光多普勒儀監(jiān)測(cè)缺血側(cè)血流量

      2.2 動(dòng)物分組及給藥實(shí)驗(yàn)大鼠編號(hào)、稱重、隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)組和YQHXD低、中、高劑量組(low-,medium-and high-dose YQHXD,YQHXD-low,-medium and-high)組,每組12只。YQHXD生藥共80 g,參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[18]中人與大鼠體表面積折算值計(jì)算等效劑量,低、中、高劑量分別為4.2、8.4和16.8 g·kg-1·d-1,分別于造模后每天上午9:00及下午4:00各灌胃1次。sham組和I/R組以等體積生理鹽水采用相同方法、時(shí)間灌胃,治療持續(xù)14 d。

      2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分參照Z(yǔ)ea Longa標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法[16]對(duì)術(shù)后3、7和14 d模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分,具體內(nèi)容:0分:無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失癥狀;1分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢;2分:爬行時(shí)向損傷對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:爬行時(shí)身體向損傷對(duì)側(cè)傾倒;4分:意識(shí)喪失,不能自主行走者。得分越高,神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

      2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)治療結(jié)束后采用Morris水迷宮評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)與記憶功能,整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。(1)定位航行實(shí)驗(yàn):進(jìn)行連續(xù)5 d的訓(xùn)練,每天于同一時(shí)間接受4次訓(xùn)練,每次訓(xùn)練間隔15 min。由工作人員將大鼠依次順時(shí)針從水池4個(gè)象限面向池壁輕輕放入水中,測(cè)試時(shí)間設(shè)為60 s,觀察并記錄大鼠在測(cè)試規(guī)定時(shí)間內(nèi)找到目標(biāo)平臺(tái)所需的時(shí)間,即逃避潛伏期(escape latency)。訓(xùn)練過(guò)程中,若大鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺(tái),則用棒將其牽引至目標(biāo)平臺(tái),使其停留15 s,則將此次潛伏期記錄為60 s,再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。大鼠學(xué)習(xí)能力用第5天大鼠4次潛伏期均值判定。(2)空間探索實(shí)驗(yàn):空間探索實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)最后1 d進(jìn)行。撤除安全平臺(tái),將平臺(tái)對(duì)角象限設(shè)為入水點(diǎn),通過(guò)自由攝像系統(tǒng)記錄大鼠60 s內(nèi)游泳軌跡以及大鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)等作為測(cè)定大鼠空間定位能力的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行雙盲操作。

      2.5 HE染色及光鏡觀察灌胃兩周結(jié)束后各組隨機(jī)取4只大鼠,0.3%戊巴比妥鈉溶液麻醉后,剪開(kāi)大鼠胸腔暴露心臟,將灌注針經(jīng)心臟左心室插入主動(dòng)脈并固定,快速注入0.9%生理鹽水,同時(shí)用眼科剪剪破右心耳,待右心房流出清亮液體,換成預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液緩緩灌注200~250 mL,直至肝臟和肺臟均變?yōu)榘咨_(kāi)顱取腦組織用甲醛固定液浸泡2~3 d后進(jìn)行包埋、切片、脫臘,常規(guī)HE染色,封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察缺血側(cè)海馬CA1區(qū)及齒狀回(dentate gyrus,DG)病理改變。

      2.6 電鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)的變化治療結(jié)束后,各組隨機(jī)選取5只大鼠進(jìn)行心臟灌注,步驟方法2.5,灌注結(jié)束后取大鼠腦缺血區(qū)海馬組織約1 mm×1 mm×1 mm放入2.5%戊二醛進(jìn)行固定,再經(jīng)PBS清洗、鋨酸固定、梯度脫水、包埋、加熱聚合、切片、醋酸鈾及硝酸鉛染色等過(guò)程制得樣本,用透射電鏡觀察照相,每張銅網(wǎng)由左上角至右下角斜線上下移動(dòng),連續(xù)拍攝10張圖片,底片放大5萬(wàn)倍印相。參照Bertoni-Freddari等[19]方格點(diǎn)計(jì)數(shù)法、Güldner等[20]多點(diǎn)平均法以及Nano Measurer圖片分析軟件計(jì)算突觸的數(shù)密度(numerical density)和突觸后致密物(postsynaptic density,PSD)厚度(nm)。

      2.7 Western blot檢測(cè)SYN、PSD95和BDNF的蛋白表達(dá)治療結(jié)束后,各組剩余大鼠行深度麻醉后迅速于冰上斷頭取腦,立即剝離出病灶側(cè)海馬組織置于2 mL EP管中裂解并進(jìn)行蛋白濃度定量,水浴蛋白變性后制備12%分離膠及5%濃縮膠,取等量20 μg(10 μL)蛋白上樣,先后采用恒壓80 V、120 V進(jìn)行電泳,此過(guò)程需1.5 h,電泳分離后PVDF轉(zhuǎn)膜(200 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)移2 h);5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h,然后分別與Ⅰ抗[SYN(1∶1 000),PSD95(1∶1 000),BDNF(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)]在4℃下孵育過(guò)夜;次日TBST充分洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶50 000),室溫?fù)u床孵育2 h;用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影后觀察,用IPP軟件定量分析膠片灰度值,以與GAPDH灰度值比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

      3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié) 果

      1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

      與sham組比較,I/R組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.01),YQHXD各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較I/R組大鼠降低,以YQHXD-medium組在給藥3和14 d后改善神經(jīng)功能最為顯著(P<0.05),其他組無(wú)顯著差異;給藥3、7和14 d各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分逐漸降低,且不同劑量組用藥14 d行為學(xué)評(píng)分均顯著優(yōu)于3 d(P<0.05),但用藥7 d與14 d的差異無(wú)顯著性,見(jiàn)表1。

      表1 YQHXD對(duì)各組大鼠不同時(shí)間神經(jīng)功能缺損的影響Table 1.Effects of YQHXD on neurological deficits in different groups of rats at different time points(Mean±SD.n=12)

      2 水迷宮測(cè)試結(jié)果

      2.1 各組大鼠逃避潛伏期結(jié)果由圖2B可知,隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng),每組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均縮短,提示各組大鼠均有一定的學(xué)習(xí)能力。由表2可知,第5天時(shí),與sham組相比,I/R組的平均潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01);與I/R組相比,YQHXD不同劑量組的平均潛伏期時(shí)間均顯著降低(P<0.01),但各劑量組之間差異不顯著(P>0.05),結(jié)果未呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

      2.2 各組大鼠定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表2可知,與sham組比較,I/R組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05);與I/R組比較,YQHXD不同劑量組的穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加,其中YQHXD-high和YQHXD-medium組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各劑量組之間差異不顯著。

      表2 YQHXD對(duì)各組大鼠水迷宮行為學(xué)的影響Table 2.Effects of YQHXD on the behavior of water maze of rats in each group(Mean±SD.n=5)

      3 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織病理學(xué)改變

      如圖3可見(jiàn)各組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)及DG區(qū)病理情況改變,結(jié)果顯示sham組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層及DG區(qū)顆粒細(xì)胞層結(jié)構(gòu)致密,排列整齊,細(xì)胞形態(tài)正常,細(xì)胞數(shù)量多,染色正常,分布均勻,未見(jiàn)明顯壞死或變性的神經(jīng)元;I/R組CA1區(qū)及DG區(qū)可見(jiàn)明顯壞死部分,細(xì)胞形態(tài)異常,細(xì)胞體積縮小,結(jié)構(gòu)疏松、排列紊亂,同時(shí)存在細(xì)胞核固縮深染;與I/R組相比,YQHXD-low組大鼠海馬病理?yè)p傷有所改善,以CA1區(qū)改善較為明顯,但DG區(qū)細(xì)胞排列較紊亂、部分細(xì)胞核仍存在固縮深染;與I/R組及YQHXD-low組相比,YQHXD-medium和YQHXD-high組可見(jiàn)缺血區(qū)海馬組織CA1區(qū)及DG區(qū)病理程度明顯減輕,細(xì)胞形態(tài)明顯改善,結(jié)構(gòu)排列較為整齊,細(xì)胞深染和皺縮情況也較少。

      4 各組大鼠缺血側(cè)海馬突觸超微結(jié)構(gòu)變化

      Figure 2.YQHXD attenuated the cognitive learning dysfunction induced by I/R in rats.A:rat swimming track map in water maze;B:escape latency of all rats for 5 consecutive days.Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs I/R group.圖2各組大鼠水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      通過(guò)電鏡觀察可見(jiàn)sham組突觸數(shù)量較多,突觸前后膜結(jié)構(gòu)清晰、輪廓完整,突觸前區(qū)可見(jiàn)分布均勻圓形大小的突觸小泡、數(shù)目較多,突觸后膜致密帶豐富,在突觸前后區(qū)可見(jiàn)豐富的線粒體;與sham組相比,I/R組突觸前后膜模糊不清,細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)散亂,前膜小泡分布散亂稀疏,線粒體腫脹、嵴變短、部分崩解,伴有巨大空泡樣,突觸數(shù)密度顯著減少(P<0.01),PSD厚度也顯著變?。≒<0.01);與I/R組相比,YQHXD-medium和YQHXD-high組治療14 d后,突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)改善明顯,突觸間隙變寬、前后膜結(jié)構(gòu)較清晰完整,前膜內(nèi)囊泡數(shù)量增多,突觸數(shù)密度顯著增多(P<0.05或P<0.01),PSD厚度顯著增厚(P<0.05或P<0.01);YQHXD-low組突觸超微結(jié)構(gòu)較I/R組有所改善,突觸數(shù)密度增多,PSD厚度增厚,但與I/R組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與sham組相比,治療組仍伴有少量突觸結(jié)構(gòu)不清晰和少量空泡樣。見(jiàn)圖4、5。

      5 YQHXD對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬組織SYN、PSD95和BDNF蛋白表達(dá)的影響

      Western blot結(jié)果見(jiàn)圖6。與sham組比較,I/R組大鼠海馬組織中SYN、PSD95和BDNF蛋白的表達(dá)量均顯著下降(P<0.01);與I/R組比較,給藥14 d后,YQHXD-high組海馬中SYN和PSD95蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.01),BDNF蛋白表達(dá)量升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);YQHXD-low和YQHXD-medium組各蛋白表達(dá)量上升,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

      討 論

      隨著世界老齡化進(jìn)程的不斷加快,缺血性腦卒中的發(fā)病率越來(lái)越高,已成為人們致死致殘的主要因素,并常伴發(fā)不同程度的學(xué)習(xí)和記憶等神經(jīng)功能障礙,給患者帶來(lái)巨大的痛苦。目前認(rèn)為,腦缺血引起皮層、海馬和紋狀體等缺血敏感區(qū)域的神經(jīng)元變性壞死,影響到神經(jīng)環(huán)路之間的信息傳遞,是腦缺血大鼠記憶和學(xué)習(xí)等能力下降的主要原因[21]。突觸是神經(jīng)元與效應(yīng)細(xì)胞之間接觸并傳導(dǎo)信息的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),突觸數(shù)量及結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)保證神經(jīng)元獲得、加工、貯存及傳遞信息起著關(guān)鍵的作用[22]。在環(huán)境受損時(shí),突觸具有發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)與傳遞效能變化的能力,即突觸可塑性,是學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)。研究證實(shí),增強(qiáng)腦缺血大鼠神經(jīng)元的突觸可塑性可以促進(jìn)神經(jīng)功能重建,減輕學(xué)習(xí)記憶障礙及肢體運(yùn)動(dòng)障礙[23-24]。

      中醫(yī)認(rèn)為腦為髓海、為元神之府,氣血是腦髓充足、腦神充養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ);中風(fēng)誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡以及神經(jīng)回路破壞,導(dǎo)致感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)或高級(jí)腦功能受損,出現(xiàn)一系列神機(jī)失用的病理變化,其修復(fù)依賴于氣血的充足。基于“腦髓-氣血”理論創(chuàng)制的益氣活血方(腦絡(luò)欣通)在臨床廣泛應(yīng)用于中風(fēng)的辨治,方中黃芪功專補(bǔ)氣,使氣旺活血生血;當(dāng)歸補(bǔ)血活血,使祛瘀而不傷正;川芎、三七、紅花共奏行氣活血通絡(luò)之功;天麻、蜈蚣熄風(fēng)通經(jīng)活絡(luò),使血行脈通則藥達(dá)腦髓。前期研究結(jié)果表明,YQHXD對(duì)缺血性腦損傷的恢復(fù)起著積極的作用,對(duì)減輕神經(jīng)功能缺損也有良好的療效[25-26]。在本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中,模型大鼠均呈現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損和學(xué)習(xí)記憶功能障礙,經(jīng)過(guò)不同劑量YQHXD的治療后,MCAO/R大鼠神經(jīng)功能缺損情況得到改善,模型大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期顯著縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)增加,證實(shí)了YQHXD對(duì)腦缺血/IR大鼠神經(jīng)功能損傷的治療作用,亦能提高模型大鼠的空間記憶與學(xué)習(xí)能力。

      Figure 3.The changes of hippocampal structure in rats on day 14 after MCAO/R.A:CA1 area;B:DG area.The scale bar=100 μm.圖3 HE染色比較各組大鼠海馬組織CA1區(qū)和DG區(qū)病理形態(tài)

      Figure 4.Transmission electron microscopy results of rat hippocampal synapse morphology and structure in each group 14 d after MCAO/R.The scale bars=200 nm.圖4各組突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)電鏡結(jié)果

      Figure 5.The results of quantitative analysis of synapses in the hippocampus of rats in each group.A:numerical density of synapses in rats cerebral ischemic hippocampus area in different groups;B:the thickness of postsynaptic density(PSD)in the rats of each group.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs I/R group.圖5各組大鼠海馬突觸數(shù)密度及突觸后致密物厚度分析結(jié)果

      Figure 6.Relative protein levels of SYN,PSD95 and BDNF in the hippocampus of rats 14 d after MCAO/R.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs sham group;##P<0.01 vs I/R group.圖6各組大鼠海馬組織SYN、PSD95和BDNF蛋白水平

      海馬是參與學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)活動(dòng)的重要腦區(qū),缺血損傷大鼠海馬區(qū)會(huì)發(fā)生神經(jīng)元遲發(fā)型變性壞死、數(shù)量減少和胞體萎縮等病理改變,以及突觸結(jié)構(gòu)完整性破壞與數(shù)量密度減少等反應(yīng)[27-29]。我們?cè)贖E染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到缺血后海馬CA1區(qū)及DG區(qū)均出現(xiàn)不同程度的病理?yè)p傷,包括錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)排列紊亂、水腫及細(xì)胞核固縮深染等;YQHXD不同劑量治療14 d后,海馬CA1區(qū)及DG區(qū)細(xì)胞排列逐漸整齊,核皺縮深染等組織病理改變有所減輕,提示YQHXD可以減輕海馬區(qū)病理改變,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

      突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的可塑性是功能可塑性的物質(zhì)基礎(chǔ),其表現(xiàn)包括新突觸形成,突觸前后膜、PSD厚度及突觸囊泡的變化等[13]。突觸數(shù)密度表示單位體積內(nèi)突觸的數(shù)量,單位體積內(nèi)數(shù)密度越大,突觸數(shù)量越多;PSD是突觸后膜胞質(zhì)面的一層均勻致密物,包含有多種蛋白質(zhì),二者均是突觸可塑性形態(tài)學(xué)定量資料的可靠參數(shù)[30]。電鏡結(jié)果顯示,與sham組相比,I/R組突觸結(jié)構(gòu)破壞,前后膜模糊不清,突觸小泡數(shù)量稀疏,突觸數(shù)密度和PSD厚度顯著減少;用藥14 d后,YQHXD-medium、high組明顯改善突觸形態(tài)結(jié)構(gòu),突觸前后膜結(jié)構(gòu)較清晰完整,前膜內(nèi)囊泡分布較密集均勻,突觸數(shù)密度和PSD厚度也顯著增多;YQHXD-low組突觸超微結(jié)構(gòu)有所改善,突觸數(shù)密度增多,PSD厚度增厚,但與I/R組及YQHXD-medium、high組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此結(jié)果說(shuō)明YQHXD可修復(fù)腦組織海馬區(qū)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu),增加突觸數(shù)目和PSD厚度,從而提高大腦神經(jīng)元的突觸可塑性。

      SYN是分布在突觸前囊泡膜上主要的鈣結(jié)合酸性糖蛋白,與神經(jīng)遞質(zhì)的包裝、儲(chǔ)存、調(diào)節(jié)及釋放密切聯(lián)系,其密度和分布可間接反映突觸數(shù)量和分布情況;PSD95是PSD上的腳手架蛋白,可以通過(guò)不同結(jié)構(gòu)域募集NMDA受體及其下游多種特異的信號(hào)分子維系突觸的連接狀態(tài),同時(shí)對(duì)突觸后興奮性信號(hào)進(jìn)行整合,與突觸重塑密切相關(guān)[13]。大量研究發(fā)現(xiàn)[31-32],腦缺血導(dǎo)致SYN和PSD95蛋白表達(dá)顯著下降,通過(guò)藥物及針刺等干預(yù),可上調(diào)SYN和PSD95水平,促進(jìn)腦缺血后突觸可塑性。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以調(diào)控學(xué)習(xí)記憶以及神經(jīng)元生存的相關(guān)蛋白表達(dá),參與到中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的調(diào)節(jié)[33]。有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明BDNF-/-小鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量大量減少,對(duì)學(xué)習(xí)和記憶功能產(chǎn)生影響[34-35]。此外,還有研究表明海馬BDNF的水平提高可以促進(jìn)SYN和PSD95表達(dá),從而調(diào)節(jié)突觸可塑性。我們的研究結(jié)果顯示,I/R組大鼠缺血缺氧再灌注14 d后BDNF、SYN和PSD95蛋白表達(dá)較sham組顯著降低;經(jīng)YQHXD不同劑量組治療后,BDNF、SYN和PSD95蛋白水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì);與I/R組相比,YQHXD-high組海馬中SYN和PSD95蛋白表達(dá)量顯著增多;BDNF蛋白表達(dá)量升高,無(wú)顯著差異。同時(shí),突觸相關(guān)蛋白SYN和PSD95的表達(dá)與BDNF保持一致的變化,結(jié)合既往研究結(jié)果推測(cè)YQHXD可能通過(guò)上調(diào)BDNF的表達(dá),促進(jìn)SYN和PSD95的表達(dá)。雖然研究結(jié)果表明YQHXD-medium和YQHXD-high組BDNF蛋 白 水平高于低劑量組,但三組均低于sham組,說(shuō)明YQHXD干預(yù)14 d能增加模型大鼠內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá),但恢復(fù)不到正常水平。

      綜上所述,益氣活血方可提高M(jìn)CAO/R模型大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力,減輕海馬區(qū)神經(jīng)元病理?yè)p傷,修復(fù)突觸超微結(jié)構(gòu),提高突觸數(shù)密度和PSD厚度,降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分,其機(jī)制可能與促進(jìn)海馬區(qū)BDNF、SYN和PSD95突觸蛋白表達(dá)、提高神經(jīng)元突觸可塑性有關(guān)。本研究通過(guò)動(dòng)物模型為YQHXD從內(nèi)源性保護(hù)途徑治療IS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),未來(lái)可從神經(jīng)可塑性調(diào)控通路方面做進(jìn)一步探索。

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