GDF9在PCOS患者成熟卵泡中的表達(dá)及其與內(nèi)分泌激素的相關(guān)性*

蔡晶晶，吳金香，羅湘閩

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，福建 泉州 362000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡婦女最常見的內(nèi)分泌疾病，表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、卵巢多囊樣改變、且多伴有持續(xù)性高黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）及高雄激素等典型特征［1］。PCOS患者卵母細(xì)胞發(fā)育潛能低下被認(rèn)為是生育力下降的風(fēng)險(xiǎn)因素，卵泡發(fā)育異常和成熟障礙是其重要特征，但其病因及發(fā)病機(jī)制仍然不清。以往研究多集中在下丘腦-垂體-卵巢軸對卵泡形成的整個(gè)階段的同步化協(xié)調(diào)和反饋?zhàn)饔?，包括血清卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、LH、LH/FSH和抗繆勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）反映性軸在PCOS卵泡發(fā)育異常機(jī)制中的作用。最近有更多的研究證實(shí)卵母細(xì)胞自分泌、旁分泌形成的卵泡微環(huán)境對卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的生長發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵作用。卵泡微環(huán)境是影響卵母細(xì)胞發(fā)育的重要因素，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間具有雙向聯(lián)系，可進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)及信號的交換，其含有各種生物化學(xué)成分、細(xì)胞因子和氧化/抗氧化產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)促進(jìn)卵泡生長，控制卵巢功能的各個(gè)方面發(fā)揮重要作用［2］。優(yōu)化卵泡微環(huán)境可以提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，調(diào)控優(yōu)勢卵泡的形成，改善婦女的妊娠結(jié)局［3］。研究表明GDF9是重要的卵泡發(fā)育調(diào)控因子，在卵泡發(fā)育階段調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞的生長、分化和功能，并在卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟、排卵、以及黃體功能發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而影響卵巢功能［4-5］。

以往文獻(xiàn)表明GDF9的生物學(xué)功能主要是通過Smad2/3信號通路作用于卵丘細(xì)胞引起卵丘的生長分化和卵丘復(fù)合物的擴(kuò)展［4-5］。也有研究報(bào)道在PCOS卵巢中，GDF9表達(dá)水平降低抑制著卵泡的生長，可能與激素水平有關(guān)［6-8］。Dewailly等［9］系統(tǒng)闡述了PCOS卵巢內(nèi)分泌紊亂的三角模式，并影響著卵泡的發(fā)育，但由于PCOS病因不清，不能局限于內(nèi)分泌因素，這個(gè)模式不能完全解釋PCOS產(chǎn)生的病理生理機(jī)制，需要更多探討PCOS卵泡生長發(fā)育的其他環(huán)境的影響，認(rèn)為內(nèi)分泌激素和卵源性因子的相互聯(lián)系也發(fā)揮著重要作用。然而，GDF9表達(dá)與內(nèi)分泌激素在PCOS卵泡發(fā)育的相互關(guān)系鮮見詳細(xì)報(bào)道和明確解釋。

卵泡液是卵母細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境［10］，參與調(diào)控生殖功能的重要體液。而卵丘細(xì)胞可以通過縫隙連接和卵母細(xì)胞進(jìn)行信號傳遞［11］，將卵母細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和RNA等物質(zhì)運(yùn)輸?shù)铰雅菀褐?，豐富了卵泡微環(huán)境的營養(yǎng)物質(zhì)從而提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)收集進(jìn)行體外受精（in vitrofertilizaion，IVF）周期患者的卵泡液和卵丘細(xì)胞以研究PCOS患者成熟卵泡GDF9表達(dá)水平，分析PCOS卵巢內(nèi)卵泡微環(huán)境GDF9表達(dá)情況，以及GDF9水平和PCOS內(nèi)分泌激素之間相關(guān)性在卵泡發(fā)育中的作用，為PCOS發(fā)病機(jī)制提供更多的理論依據(jù)。

材料和方法

1 一般資料

選擇2019年12月～2022年8月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的接受IVF/ICSI治療的115例患者，其中PCOS患者61例和卵巢功能正常的患者54例（對照組）。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書（編號：2019-222）。PCOS的診斷根據(jù)2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)［12］。對照組患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)規(guī)律，正常排卵，超聲顯示卵巢形態(tài)正常，為同期輸卵管因素的不孕患者。同時(shí)排除合并卵巢功能早衰、內(nèi)異癥、高泌乳素血癥、甲狀腺功能異常等；曾接受過卵巢手術(shù)或放化療者。

2 方法

2.1 激素水平檢測采集患者月經(jīng)后第3～5天的空腹靜脈血，離心分離血清。采用Abbott I 2000化學(xué)發(fā)光分析儀檢測基礎(chǔ)內(nèi)分泌值：睪酮（testosterone，T）、FSH、LH、雌二醇（estrodiol，E2）和催乳素（prolactin，PRL）。采用ELISA法檢測AMH水平，試劑盒購自貝克曼二代公司。

2.2 人卵泡液和卵丘細(xì)胞的收集根據(jù)患者不孕原因、年齡、卵泡刺激素水平和腔卵泡計(jì)數(shù)等臨床資料，主要采用早卵泡期長效長方案和拮抗劑方案，進(jìn)行促排卵。給予促性腺激素釋放激素激動劑（博福益普生公司）和重組FSH（雪佛蘭公司）刺激卵巢后，當(dāng)至少3枚卵泡直徑達(dá)到17 mm左右，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（珠海麗珠制藥廠）5 000～10 000 U，36 h后超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。由于卵母細(xì)胞可用于胚胎培養(yǎng)和移植，所以留取相應(yīng)的卵泡液和卵丘細(xì)胞來分析GDF9的表達(dá)。從穿刺獲得的第一個(gè)直徑大于17 mm的卵泡中撿取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物，收集廢棄的卵泡液。卵泡液樣品置于水平離心機(jī)，4℃、300×g離心10 min；取1 mL上清液轉(zhuǎn)移到冷凍管中，保存在-80℃冰箱，用于后續(xù)的GDF9蛋白濃度測定。獲取的每個(gè)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物用16號顯微解剖針［13］機(jī)械去除分離部分卵丘細(xì)胞，經(jīng)PBS漂洗后均勻涂布于防脫載玻片上制成卵丘細(xì)胞涂片，用于免疫組織化學(xué)染色檢測卵丘細(xì)胞的GDF9表達(dá)水平。

2.3 人類卵泡液GDF9濃度的測定將卵泡液用PBS 1∶5比例稀釋，然后按照生產(chǎn)說明書使用人GDF9 ELISA試劑盒（Elabscience）進(jìn)行測定。在自動96孔微孔板閱讀器下讀取450 nm波長的吸光度（A）。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算卵泡液GDF9濃度。

2.4 免疫組織化學(xué)染色根據(jù)操作說明書（博士德生物科技有限公司），采用免疫組化染色法檢測GDF9在卵丘細(xì)胞的分布。用4%多聚甲醛固定卵丘細(xì)胞涂片15 min，然后用3%過氧化氫浸泡以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加山羊血清阻斷非特異性結(jié)合1 h。用兔抗GDF9Ⅰ抗（Abcam；1∶100）4℃孵育過夜，用PBS沖洗3次，室溫下與生物素標(biāo)記的兔抗Ⅱ抗孵育30 min。最后，與過氧化物酶底物DAB在室溫下孵育，直到達(dá)到所需的染色強(qiáng)度，用蘇木素輕度染色，覆蓋蓋玻片。涂片通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳染色時(shí)間和抗體滴度?？瞻淄科捎貌缓窨沟穆亚鸺?xì)胞涂片進(jìn)行孵育。用顯微鏡（Leica MZ16FA）對染色結(jié)果進(jìn)行檢測和拍照留取圖片。使用ImageJ 6.0軟件對圖片染色進(jìn)行半定量分析，每張圖片隨機(jī)選取3～5個(gè)視野，測定平均吸光度（A）。

3 觀察指標(biāo)

對比PCOS組和對照組卵泡液GDF9濃度和卵丘細(xì)胞GDF9表達(dá)水平。分析成熟卵泡卵泡液GDF9與患者血清T、FSH、LH、LH/FSH和AMH的相關(guān)性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)的正態(tài)性。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù)）［median（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，使用多變量偏相關(guān)分析非正態(tài)變量間的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組患者基本資料的比較

本研究納入標(biāo)準(zhǔn)的患者共115例，其中對照組54例，PCOS組61例。兩組患者間基礎(chǔ)T、基礎(chǔ)AFC、基礎(chǔ)AMH、基礎(chǔ)LH和LH/FSH比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），兩組患者間年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、E2、PRL和促排卵Gn總量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者基本資料的比較Table 1.Comparison of general data between the two groups［Mean±SD or median（P25，P75）］

2 兩組患者成熟卵泡卵泡液GDF9蛋白濃度比較

PCOS組患者成熟卵泡卵泡液GDF9蛋白濃度是（6.83±0.53）μg/L，低于對照組的（11.05±0.82）μg/L（P＜0.01），見圖1。

3 兩組患者成熟卵泡卵丘細(xì)胞GDF9蛋白水平

PCOS組和對照組的卵丘細(xì)胞免疫組化染色顯示，兩組患者卵丘細(xì)胞中均存在有GDF9蛋白陽性表達(dá)，可見在細(xì)胞質(zhì)棕色染色。PCOS組卵丘細(xì)胞GDF9蛋白陽性染色平均吸光度值為0.18±0.01，明顯低于對照組的0.28±0.01（P＜0.01），見圖2。

4 成熟卵泡卵泡液中GDF9濃度與血清T、FSH、LH、LH/FSH和AMH水平的相關(guān)性

對PCOS組成熟卵泡卵泡液中GDF9濃度與血清T、FSH、LH、LH/FSH和AMH的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，PCOS組成熟卵泡卵泡液GDF9濃度與T（r=0.303，P＜0.05）和FSH（r=0.309，P＜0.05）呈正相關(guān)；與LH（r=-0.290，P＜0.05）、LH/FSH（r=-0.418，P＜0.01）和AMH（r=-0.281，P＜0.05）呈負(fù)相關(guān)，見圖3。而在正常對照組中，GDF9與T、FSH、LH、LH/FSH和AMH無顯著相關(guān)性（P＞0.05），見圖4。

Figure 1.The expression of GDF9 in follicular fluid from the PCOS patients（n=61）and controls（n=54）.Mean±SD.**P＜0.01 vs control group.圖1兩組患者成熟卵泡卵泡液GDF9蛋白濃度

Figure 2.The expression of GDF9 in cumulus cells（×400）of PCOS patients（n=61）and controls（n=54）.Mean±SD.**P＜0.01 vs control group.圖2兩組患者成熟卵泡卵丘細(xì)胞GDF9蛋白表達(dá)水平

討 論

在卵泡發(fā)育的各個(gè)階段，從初級卵泡到次級卵泡的轉(zhuǎn)化，都可以檢測到GDF9的表達(dá)，在成熟卵泡表達(dá)水平最高，卵母細(xì)胞通過GDF9的合成和分泌調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增殖和分化［14-16］。所以本研究收集直徑≥14 mm卵泡的卵泡液和卵丘細(xì)胞，即成熟卵泡的卵泡液和卵丘細(xì)胞，以分析PCOS患者中卵泡成熟階段GDF9表達(dá)水平，對卵母細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行預(yù)測評估。本研究結(jié)果顯示，PCOS組卵泡液GDF9的含量低于對照組，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵丘細(xì)胞的GDF9表達(dá)與卵泡液GDF9表達(dá)是一致的。魏麗娜等［8］的研究顯示刺激周期PCOS組成熟卵母細(xì)胞和正常卵巢對照組比較，卵母細(xì)胞GDF9 mRNA表達(dá)水平明顯降低。隨后她們用免疫組化驗(yàn)證GDF9在PCOS婦女的卵巢組織中的表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)組織中GDF9表達(dá)也是呈低水平狀態(tài)［7］。另有國外學(xué)者研究顯示在行控制性促排卵的PCOS患者，卵丘細(xì)胞GDF9的mRNA表達(dá)降低［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和這些已報(bào)道研究一致，用不同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步驗(yàn)證了控制性卵巢刺激可以促進(jìn)正常排卵婦女卵泡GDF9的表達(dá)，但對于PCOS患者的成熟卵泡GDF9表達(dá)仍未能達(dá)到正常水平。近年，GDF9在誘導(dǎo)卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟和排卵發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用不斷被認(rèn)知［7，18-19］。PCOS患者中低表達(dá)的GDF9導(dǎo)致卵泡發(fā)育的促進(jìn)作用受到抑制，可能會引起卵母細(xì)胞的質(zhì)量低下。PCOS患者雖然經(jīng)過外源性Gn促排刺激以及LH峰的扳機(jī)作用，卵母細(xì)胞發(fā)生核成熟并排出第一極體，但減弱的GDF9表達(dá)水平可能會引起胞質(zhì)發(fā)育不成熟，核質(zhì)發(fā)育不平衡，減弱本身的減數(shù)分裂能力、抑制正確的受精和形成的早期胚胎發(fā)育能力［20-21］。

近期有文獻(xiàn)報(bào)道首次用ELISA方法定量檢測無促排刺激卵巢中的小竇卵泡GDF9濃度［22］，但國內(nèi)目前尚缺乏此類的數(shù)據(jù)分析。本研究也應(yīng)用ELISA方法觀察到GDF9濃度在PCOS患者個(gè)體間差異較大，甚至部分患者的GDF9表達(dá)水平并不比正常對照低，與此文獻(xiàn)報(bào)道的一致。這可能與PCOS疾病的臨床特點(diǎn)和高度異質(zhì)性有關(guān)系，說明有些溫和的PCOS表型可能有不同的致病途徑，它們的生殖能力和卵母細(xì)胞質(zhì)量并不比正常婦女差，治療也應(yīng)該個(gè)體化處理［23］。PCOS不僅影響女性生殖功能，而且是一種多系統(tǒng)、復(fù)雜的慢性疾病。患者之間個(gè)體差異大，具有不同的臨床表現(xiàn)，涉及輕微癥狀到伴有嚴(yán)重的代謝紊亂疾病，如肥胖、高胰島素血癥、胰島素抵抗以及持續(xù)的低度慢性炎癥。這些并發(fā)癥或多或少伴隨著PCOS疾病的發(fā)生，增加PCOS的嚴(yán)重性，而且影響著PCOS的生殖能力和卵母細(xì)胞的質(zhì)量［5］。所以本研究通過定量檢測多樣本的GDF9濃度，在評估PCOS患者群體生殖能力方面，更能體現(xiàn)PCOS臨床的多變性和特異性。

Figure 3.Correlations of GDF9 concentration in follicular fluid of mature follicles and serum T，F(xiàn)SH，LH，LH/FSH and AMH levels in PCOS patients.圖3 PCOS組成熟卵泡卵泡液GDF9濃度與血清FSH、LH、LH/FSH和AMH水平的相關(guān)性

Figure 4.Correlations of GDF9 concentration in follicular fluid of mature follicles and serum T，F(xiàn)SH，LH，LH/FSH and AMH levels in control patients.圖4對照組成熟卵泡卵泡液GDF9濃度與血清T、FSH、LH、LH/FSH和AMH水平的相關(guān)性

卵母細(xì)胞的生長發(fā)育受到內(nèi)分泌環(huán)境和卵泡微環(huán)境的共同調(diào)控，深入了解這一復(fù)雜的卵泡生長環(huán)境的相互作用為探索PCOS的發(fā)生發(fā)展提供更多的理論依據(jù)。PCOS患者內(nèi)分泌紊亂是其主要特征之一［24-26］。有研究指出卵源性因子的表達(dá)受到內(nèi)分泌激素的調(diào)控，過度分泌的AMH可能直接抑制或者阻斷FSH對卵源性因子的產(chǎn)生，使PCOS患者卵母細(xì)胞中卵源性因子的表達(dá)處于較低水平［9］。也有文獻(xiàn)報(bào)道，GDF9在原始卵泡階段就開始表達(dá)，通過非性腺激素依賴途徑調(diào)控卵泡生長發(fā)育的微環(huán)境，卵泡的生長狀況必定會影響各種內(nèi)分泌激素產(chǎn)生和受體的表達(dá)［27］?？傊?，PCOS出現(xiàn)多指標(biāo)的異常表達(dá)，但因果關(guān)系尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液GDF9水平與T和FSH呈正相關(guān)；與LH、LH/FSH和AMH呈負(fù)相關(guān)，而在對照組中不存在任何相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)中兩組結(jié)果對比表明PCOS患者GDF9的產(chǎn)生與T、FSH、LH、LH/FSH和AMH表達(dá)可能存在某種相互調(diào)節(jié)或相互作用的機(jī)制，如果這種正常的平衡狀態(tài)被某種因素打破就可能發(fā)生的一系列連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致各種生物指標(biāo)的異常表達(dá)［28］。雖然有文獻(xiàn)表明雄激素水平過高可抑制卵泡發(fā)育［29］，但也有研究顯示雄激素在卵泡發(fā)生的早期和排卵前階段是必不可少的［30］。本研究中PCOS患者的GDF9表達(dá)水平與睪酮成正相關(guān)，它們可能在PCOS原始卵泡階段就開始共同決定著卵泡的命運(yùn)。

本文從卵源性因子的角度以及內(nèi)分泌激素水平探索PCOS患者在控制性卵巢刺激排卵周期的卵泡生長調(diào)節(jié)過程，確定兩者之間的相關(guān)性，進(jìn)一步研究影響PCOS卵母細(xì)胞質(zhì)量和PCOS患者生育力的因素和內(nèi)在聯(lián)系，或許將GDF9與T、FSH、LH、LH/FSH、AMH聯(lián)合檢測，以監(jiān)測控制性卵巢刺激促排卵中卵泡的生長情況，為指導(dǎo)PCOS患者的IVF臨床治療提供更多的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)依據(jù)，為PCOS的治療提供新思路。