依普利酮抑制慢性腎臟病妊娠大鼠梗阻對側腎臟血管新生并減輕腎間質纖維化*

周文平，許暢，牛潔琪，熊云昭，何珍，徐賀朋，張孟娟，王洪雙，王香婷，許慶友，王箏△

（1河北中醫(yī)學院研究生學院，2河北省中西醫(yī)結合肝腎病證研究重點實驗室，3河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結合學院，4河北中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，河北 石家莊 050091）

近年來，慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的發(fā)病率顯著增加，不同國家和地區(qū)發(fā)病率為10%～15%［1］。在高收入國家，CKD影響多達6%的育齡婦女和3%的孕婦［2］。CKD與妊娠的關系是雙向的，妊娠期腎臟特殊的生理變化可能會導致潛在的腎功能障礙的進展，同時腎臟疾病及其治療可能會影響妊娠結局［3］。延緩CKD進展并改善孕產(chǎn)結局是目前亟待解決的難題。然而目前對CKD妊娠的研究大多側重于臨床結局回顧性研究［4-6］。而CKD妊娠不良妊娠結局的發(fā)病機制鮮有報道，具體的作用機制尚不明確，改善妊娠加重的慢性腎臟病的有效療法有限。因此我們關注妊娠加重慢性腎臟病的生理病理機制。

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種CKD發(fā)展為終末期腎病的常見途徑［7］。以往的研究證實醛固酮（aldosterone，ALD）受體阻斷劑可通過阻斷醛固酮活化，抑制細胞增殖，延緩單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）妊娠大鼠梗阻對側腎臟RIF進展［8-9］。同時有研究顯示依普利酮（eplerenone，EPL）通過抑制UUO大鼠梗阻對側腎臟病理性血管新生，延緩腎臟纖維化的進程［10］?；谇捌趯嶒灮A，本研究以UUO合并妊娠實驗動物為模型，以醛固酮活化-炎癥損傷-低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/Slit2/Robo1信號通路-血管新生-RIF為研究途徑，并給予EPL治療，初步探討腎臟血管新生在妊娠加重CKD中的作用及EPL對腎臟的保護機制。

材料和方法

1 動物

SPF級健康雌性未經(jīng)產(chǎn)Wistar大鼠60只，雄性Wistar大鼠20只，5～6周齡，體重160～180 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。許可證號為SCXK（京）2016-0006。實驗動物被飼養(yǎng)于（22±2）℃的溫度和12 h的光-暗循環(huán)的房間，自由獲得食物和水，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

2 主要試劑

EPL：由輝瑞制藥公司生產(chǎn)，ResearchDiets進行飼料加工（根據(jù)大鼠的藥物用量100 mg·kg-1·d-1與進食量1.25 g/kg按比例加入飼料中［11］）；抗鹽皮質激素受體（mineralocorticoid receptor，MR）抗體（Proteintech）；抗核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗體（Abcam）；抗CD34抗體（Novus）；抗CD105抗體（Abcam）；抗HIF-1α抗體（Immunoway）；抗Slit2抗體（Novus）；抗Robo1抗體（Bio-Techne）；抗GAPDH抗體（Servicebio）；ALD試劑盒，孕酮（progesterone）試劑盒和雌二醇（estradiol）試劑盒（Cayman Chemical）；免疫組化通用SP試劑盒（中杉金橋生物公司）。

3 動物分組及模型制備

60只5～6周齡未經(jīng)產(chǎn)雌性Wistar大鼠隨機分為假手術（sham）組、假手術+妊娠組（pregnancy組）、模型（model）組和EPL組，共4組，每組15只。model組和EPL組大鼠采用UUO手術造成腎臟損傷［12］；sham組和pregnancy組大鼠僅將輸尿管游離但不結扎離斷。UUO術后次日，EPL組大鼠給予EPL（100 mg·kg-1·d-1）治療，其余3組自由飲食飲水，每天1次，連續(xù)給藥至妊娠第19天。UUO術后第8周在顯微鏡下觀察梗阻對側腎臟組織病理切片，若符合RIF病理改變（炎癥細胞浸潤及膠原成分沉積），說明UUO造模成功。UUO術后第9周開始，對pregnancy組、model組及EPL組大鼠進行陰道涂片并監(jiān)測其動情周期，將處于動情前期或動情期的雌鼠與雄鼠按1∶1比例合籠，并將觀察到陰道栓之日確定為妊娠的第1天。妊娠雌鼠單獨飼養(yǎng)，腎損傷妊娠大鼠模型制備成功。妊娠第19天，對母鼠行安樂死手術，取母鼠股動脈血清，摘取梗阻對側腎臟。采用ELISA法測定醛固酮、孕酮和雌二醇含量。一部分腎臟置于4%多聚甲醛中進行病理、免疫組化和免疫熒光檢測，另一部分置于-80℃冰箱中以備進行ELISA、RT-qPCR和Western blot實驗。UUO造模以及后期有部分大鼠因手術、感染等原因死亡。整個實驗過程中，pregnancy組見栓未孕2只，model組見栓未孕4只，因流產(chǎn)死亡1只，EPL組見栓未孕2只，死亡2只，model組成功造模10只，因此其他3組隨機取10只進行統(tǒng)計分析。

4 實驗方法

4.1 腎臟病理學腎臟標本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，二甲苯脫蠟30 min（2次），梯度濃度乙醇進行脫水，進行HE染色、Masson染色和天狼星紅（Sirius red）染色。HE染色觀察腎組織病理變化，藍染的部位是細胞核；間質纖維化區(qū)域采用Masson和Sirius red染色觀察膠原纖維，Masson染色膠原纖維染色為藍色，Sirius red染色膠原纖維為紅色。

4.2 ELISA檢測醛固酮、孕酮和雌二醇含量將股動脈血清在4℃、3 000×g離心10 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清醛固酮、孕酮和雌二醇含量。將10%的腎臟組織勻漿在4℃、3 000×g離心10 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明檢測腎臟組織醛固酮含量。

4.3 Western blot檢測HIF-1α、Slit2和Robo1的蛋白表達取腎組織100 mg加入含蛋白酶抑制劑的裂解液400 μL，勻漿取上清，檢測蛋白濃度，根據(jù)檢測指標以20～50 μg蛋白樣品進行電泳并轉膜，快速封閉液封閉15～20 min，然后將膜與抗HIF-1α（1∶1 000）、Slit2（1∶1 000）和Robo1（1∶500）抗體，在4℃下孵育過夜，同時用GAPDH（1∶2 000）作為內參照。第2天，將膜與熒光素偶聯(lián)的Ⅱ抗（1∶15 000）在室溫下孵育1 h，用Odyssey雙色紅外激光成像掃描儀（LICOR），相同的實驗條件下重復3次，并用ImageJ 1.50的內部加載控制進行定量。

4.4 免疫組化檢測腎組織中MR、NF-κB、HIF-1α、Slit2和Robo1蛋白表達采用SABC法檢測，切片，梯度脫水，抗原修復，加Ⅰ抗［MR（1∶100）、NF-κB（1∶100）、HIF-1α（1∶300）、Slit2（1∶100）和Robo1（1∶200）］，4℃孵育過夜；加入Ⅱ抗，PBS清洗，滴加SABC復合物，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。以鏡下出現(xiàn)棕黃色為陽性表達，用ImageJ軟件連續(xù)6個高功率場對每個腎的陽性細胞和染色面積進行定量，以每視圖陽性區(qū)域百分比表示。

4.5 免疫熒光染色檢測血管內皮標志物CD34和CD105表達將石蠟切片常規(guī)脫蠟、復水，加入含3%H2O2的去離子水，恒溫水浴箱內孵育10 min；PBS洗凈后加入0.01 mol/L枸椽酸緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復；滴加10%山羊血清，室溫孵育1 h；傾倒多余的山羊血清，勿洗，加入Ⅰ抗（濃度均為1：100）4℃過夜；PBS清洗，加入Ⅱ抗（避光）37℃恒溫水浴箱內孵育1 h；滴加DAPI液（避光）室溫孵育10 min；滴加抗熒光衰減封片劑（避光）封片。激光共聚焦顯微鏡（Leica，SP8）觀測以上指標的表達。

4.6 RT-qPCR檢測MR、NF-κB、CD34和CD105的表達使用RNA提取液（Servicebio）從全組織標本中分離總RNA。以cDNA為模板，用2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX，Servicebio）進行實時熒光定量PCR。采用ABI 7500 FAST系統(tǒng)（Applied Biosystems）檢測MR、NF-κB、CD34、CD105和GAPDH的mRNA水平。用2-ΔΔCt法分析其相對表達水平。所有引物均由Servicebio提供，序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示連續(xù)變量。符合正態(tài)性和方差齊性檢驗數(shù)據(jù)選擇單因素方差分析及LSD法比較組間差異，不符合正態(tài)檢驗條件的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠腎臟病理形態(tài)學變化

HE染色結果顯示，model組大鼠梗阻對側腎小管擴張明顯，尤其是遠端小管，可見細胞水腫，脫落甚至壞死，小管間質見大量炎癥細胞浸潤；EPL組大鼠腎臟病理損傷有所減輕。Masson和Sirius red染色結果顯示，與sham組和pregnancy組相比，model組大鼠梗阻對側腎臟膠原沉積增加，EPL組膠原沉積較model組減輕。Masson染色定量分析結果顯示，model組膠原體積分數(shù)顯著高于sham組和pregnancy組，EPL組膠原體積分數(shù)顯著低于model組（P＜0.01）。見圖1。

Figure 1.The pathomorphological changes of the contralateral kidney of the rats in each group（scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=6.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖1各組大鼠梗阻對側腎臟病理形態(tài)變化

2 各組大鼠孕產(chǎn)情況

ELISA結果顯示，與sham組相比，妊娠各組大鼠血清孕酮和雌二醇含量升高（P＜0.05）；與pregnancy組相比，model組孕酮和雌二醇含量顯著降低（P＜0.01），EPL組孕酮和雌二醇含量較model組升高（P＜0.05），見圖2。大鼠孕產(chǎn)情況結果顯示，與pregnancy組相比，model組大鼠見栓懷孕率下降，畸胎死胎率升高，EPL組見栓懷孕率較model組升高，各組孕鼠平均產(chǎn)仔數(shù)無顯著差異，見表2。

表2 各組大鼠孕產(chǎn)情況Table 2.Pregnancy-and parturition-related conditions in rats

3 醛固酮、MR和NF-κB的蛋白及mRNA檢測

ELISA結果顯示，與sham組相比，pregnancy組血清及腎組織醛固酮含量上升（P＜0.05），而model組兩者的含量較pregnancy組顯著升高（P＜0.01），EPL組的含量較model組顯著降低（P＜0.01），見圖2。RT-qPCR結果顯示，與sham組和pregnancy組相比，model組MR和NF-κB mRNA表達顯著上調（P＜0.01），而EPL治療后可顯著下調其表達（P＜0.01），見圖2。免疫組化結果顯示，MR和NF-κB在sham組和pregnancy組僅有少量表達；而在model組表達顯著增多，主要表達于遠端腎小管上皮細胞細胞核中；與model組相比，EPL組兩者表達顯著減少（P＜0.01），見圖3。

4 HIF-1α/Slit2/Robo1信號通路相關蛋白檢測

免疫組化結果顯示，HIF-1α、Slit2和Robo1在model組表達明顯增多，HIF-1α主要表達于遠端腎小管上皮的細胞核，Slit2和Robo1主要表達于遠端擴張腎小管上皮的細胞核及細胞質，而EPL可以下調其表達（P＜0.01），見圖4。

Western blot結 果顯示，sham組 及pregnancy組HIF-1α、Slit2和Robo1蛋白低表達，model組三者表達上調，而EPL組較model組顯著降低（P＜0.01），見圖5。

5 血管內皮細胞標志物檢測

免疫熒光染色結果顯示，sham組和pregnancy組大鼠腎組織可見少量CD34和CD105陽性表達；model組二者表達增多，主要表達于腎小管間質，呈彌漫分布；EPL組二者表達有所減少，見圖6A。RTqPCR結果顯示，model組CD34和CD105表達顯著上調（P＜0.01），而EPL可以顯著 下 調 其 表 達（P＜0.01），見圖6B。

討 論

Figure 2.Serum progesterone and estradiol levels，serum and renal tissue aldosterone levels，and the mRNA expression of MR and NF-κB in UUO pregnant rats.Mean±SD.n=10.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs pregnancy group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖2各組大鼠血清孕酮和雌二醇水平、血清和腎組織醛固酮水平及腎組織MR和NF-κB的mRNA表達

Figure 3.The expression of MR and NF-κB detected by immunohistochemical staining（scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=6.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖3免疫組織化學染色檢測MR和NF-κB的表達

Figure 4.Immunohistochemical detection of HIF-1α，Slit2 and Robo1 protein expression in the contralateral kidneys of the rats in each group（scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=6.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖4免疫組織化學染色檢測各組大鼠梗阻對側腎臟HIF-1α、Slit2和Robo1蛋白表達

Figure 5.Western blot detection of HIF-1α，Slit2 and Robo1 protein expression in contralateral renal tissue of UUO pregnant rats.Mean±SD.n=3.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖5 Western blot檢測UUO妊娠大鼠梗阻對側腎組織HIF-1α、Slit2和Robo1的蛋白表達

慢性腎臟病近年來患病率顯著增加，伴隨計劃生育政策的放開，慢性腎臟病患者妊娠率也在上升。CKD并非是妊娠絕對禁忌，但CKD患者屬于妊娠高危人群，其妊娠面臨著重大挑戰(zhàn)［13］。CKD患者的妊娠結局取決于腎臟損害的程度、是否存在高血壓、蛋白尿、感染和先兆子癇等［14］。CKD患者妊娠期的病理狀態(tài)主要表現(xiàn)為高灌注、高濾過和高凝狀態(tài)，這種病理狀態(tài)使原有腎臟疾病加重，嚴重威脅到孕婦和胎兒的生命安全［15-16］。CKD患者有生育需求且符合妊娠條件者，需在孕前、孕期及產(chǎn)后充分評估原發(fā)病及病情活動指標，腎功能，尿蛋白以及是否出現(xiàn)合并癥等。可見，妊娠加重CKD是腎內科、婦產(chǎn)等領域共同的課題，學科交叉研究較少，目前大多聚焦于慢性腎臟病妊娠臨床結局，而對其生理病理機制報導較少。本研究則關注妊娠加重慢性腎臟病的可能發(fā)病機制，闡明腎臟血管新生在妊娠加重CKD中的作用，為臨床治療提供理論依據(jù)。

已有的研究證實，妊娠加重CKD和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotension-aldosterone system，RAAS）密切聯(lián)系，尤其是RAAS下游的醛固酮［17］。妊娠期醛固酮水平受雌、孕激素影響較大。醛固酮介導的水鈉潴留和孕酮利尿排鈉的作用相互制約，保持水鈉平衡。但在妊娠晚期及病理狀態(tài)下，醛固酮的作用可能超過孕酮的作用，導致高血壓、水腫和蛋白尿等妊娠中毒癥狀的出現(xiàn)。醛固酮不僅對血流動力學有調控作用，亦可引起炎癥損傷、氧化應激和膠原沉積等多種病理反應［18］。已有證據(jù)支持醛固酮可能作為生長因子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和細胞因子介導的胎盤和腎臟損傷的中介作用［19］。

Figure 6.The expression of CD34 and CD105 in the contralateral renal tissue of UUO pregnant rats detected by immunofluorescence staining（A；scale bar=250 μm）and RT-qPCR（B）.Mean±SD.n=10.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖6免疫熒光法及RT-qPCR法檢測UUO妊娠大鼠梗阻對側腎組織CD34和CD105的表達

RIF是各種慢性腎臟病進展為終末期腎功能衰竭的主要病理特征之一，主要表現(xiàn)為臟器萎縮、細胞外基質沉積和細胞增生［20］。由于UUO模型與臨床阻塞性疾病的病理過程相似，可在短時間內引起RIF，而不會引起明顯的腎小球病變［21］。動物實驗證實UUO可激活RAAS系統(tǒng)，產(chǎn)生ROS和NF-κB，促進大鼠RIF［22］。因此，認為UUO為研究慢性腎臟病RIF的首選模型。本實驗結果顯示UUO術后8周炎癥細胞浸潤及大量膠原成分沉積，符合RIF的病理改變，在UUO術后9周雌雄大鼠1∶1合籠，復制腎損傷妊娠大鼠模型。HE、Masson和天狼星紅結果表明腎損傷妊娠大鼠模型可導致腎臟病理損傷和纖維化，而EPL可以減輕腎間質炎癥細胞浸潤和膠原沉積，減輕RIF。

血管新生也稱為血管生成，是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管，與血管內皮細胞的激活、增殖和遷移密切相關。腎臟正常的血管生成發(fā)生在胚胎發(fā)育和組織修復過程中，病理狀態(tài)下對腫瘤、眼科疾病等血管新生的機制研究較多。最新研究表明血管新生在慢性疾病進展中還參與臟器纖維化的形成，如心臟病、腎臟病進展中檢測到血管的異常新生［23］。新生的血管給炎癥細胞侵入病灶提供了新的通道，從而加重了炎癥反應和局部組織過度修復，最終導致成纖維細胞增殖及膠原纖維大量沉積［24］?？梢?，大量炎癥因子分泌可導致異常的、不可控的病理性腎微血管的新生，造成纖維性修復，加劇RIF進程。

血管新生的檢測采用血管內皮細胞進行標記，CD34和CD105均是常用的血管內皮細胞標志物，本實驗采用免疫熒光檢測CD34和CD105表達，結果顯示model組大鼠兩者表達顯著增多，主要位于腎間質血管內皮細胞，說明腎臟血管新生參與妊娠加重CKD腎臟損傷。

有研究表明CKD進展中腎纖維化和炎癥損傷與低氧的關系密切［25］。醛固酮通過激活內皮細胞和平滑肌細胞上的鹽皮質激素受體，增加氧化應激、促進炎癥、加速血管僵硬、重塑和鈣化，改變血管生成，從而促進血管疾病的發(fā)生［26］。醛固酮被激活后，可誘導NF-κB活化，進而促進多種細胞因子、生長因子和趨化因子等多種物質的表達，參與炎癥反應和纖維化等病理過程［27］。由于腎血流量大，能量消耗大，對缺血缺氧比較敏感，HIF-1α表達增加。NF-κB是低氧時炎癥基因表達所必需的，且HIF-1α和NF-κB信號之間高度依賴［28］。HIF-1α和Slit2的轉錄因子SIM（single-minded）的組成均有一個bHLH單元和一個PAS單元組成，即CME單元，序列的相似性為HIF-1α啟動Slit2的表達提供了依據(jù)［29］。Slit2通過上調血管內皮細胞上Robo1受體數(shù)量和激活血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）來活化內皮細胞，參與病理條件下的血管再生［30］。本實驗結果顯示model組大鼠醛固酮含量增多，MR、NF-κB、HIF-1α、Slit2和Robo1等表達上調，說明醛固酮與MR結合后，可誘導腎臟和炎癥損害和缺氧，進一步通過HIF-1α/Slit2/Robo1信號通促進血管內皮細胞增殖遷移而參與腎臟血管新生。

針對血管新生的機制，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制劑目前主要應用于腫瘤和視網(wǎng)膜病變的治療，但有報道指出其在臨床上會出現(xiàn)高血壓、蛋白尿及腎功能損傷等不良反應［31］。因此，血管新生的治療藥物需要通過長期動物實驗及臨床驗證，密切關注其不良影響及靶器官的損傷。根據(jù)妊娠加重CKD激活RAAS參與RIF的機制，阻斷RAAS可能是控制疾病的關鍵。然而有報道顯示，妊娠早期使用血管緊張素轉化酶抑制劑/血管緊張素受體阻斷劑類藥物是胎兒發(fā)生并發(fā)癥的危險因素，部分患者還出現(xiàn)“醛固酮逃逸”［32-33］?？紤]醛固酮在CKD妊娠進展中的重要作用，MR阻斷劑的選擇尤為重要。相比較第一代藥物螺內酯，第二代的EPL與性激素受體親和力較低，故可以有效地避免性激素的不良反應［34］。故本實驗將EPL選作治療藥物。本研究結果表明，EPL可以抑制醛固酮與MR的結合，減輕梗阻對側腎臟炎癥損傷及病理性血管新生，從而減RIF進展和改善孕產(chǎn)結局，這些結果表明EPL在CKD妊娠中具有重要作用。