黃芩素通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)和病理性血管生成*

杜紅麗，張晨宇，趙 清

［1河南中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院（鄭州人民醫(yī)院）風(fēng)濕免疫科，河南鄭州450053；2河南大學(xué)淮河醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南開封475099］

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜組織炎癥、病理性血管大量生成、滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)畸形為特征的慢性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失，嚴(yán)重影響人們的健康和生活質(zhì)量［1-2］。目前盡管有多種藥物可用于RA的治療，包括糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥（雷公藤多苷）、甲氨蝶呤、抗B淋巴細(xì)胞藥物及抗細(xì)胞因子等，但由于其副作用大或成本高，給患者帶來巨大負(fù)擔(dān)，延誤疾病治療［3-4］。因此，開發(fā)高效、低成本、副作用小的新型抗RA藥物具有重要意義。黃芩素（baicalein，BA）是從黃芩中提取的黃酮類化合物，其具有抗炎和抗過敏的作用［5］。據(jù)報(bào)道，BA可抑制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展［6］。而BA對(duì)RA大鼠炎癥反應(yīng)和病理性血管生成的影響尚未見報(bào)道。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通路的激活對(duì)于病理性血管生成至關(guān)重要［7］。據(jù)報(bào)道，抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路可減弱RA大鼠病理性血管生成［2］。而BA能否通過調(diào)控HIF-1α/VEGF信號(hào)通路影響RA大鼠炎癥反應(yīng)和病理性血管生成尚不可知。因此，本研究主要探究BA對(duì)RA大鼠的炎癥反應(yīng)和病理性血管生成的影響及其作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

72只體質(zhì)量為310～330 g的8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠購自廣州銳格生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2021-0059。飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境，濕度控制在（55±5）%，溫度為（24±2）℃，24 h晝夜燈光控制，自由攝食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到本院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 主要試劑

BA（規(guī)格20 mg）購自北京普非生物科技有限公司；雷公藤多苷片（Tripterygium wilfordiipolyglycoside tablet，TWP；國藥準(zhǔn)字z34021048）購自宿州億帆藥業(yè)有限公司；HIF-1α激動(dòng)劑二甲基草酰甘氨酸（dimethyloxallyl glycine，DMOG）購自MedChemExpress；牛II型膠原蛋白購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；完全弗氏佐劑乳劑購自上海瓦蘭生物科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司；兔源VEGF、VEGF受體2（又稱激酶插入域受體，kinase insert domain receptor，KDR）、HIF-1α和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗均購自Abcam。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物分組及給藥處理按照隨機(jī)數(shù)字表法將72只大鼠分為對(duì)照（control）組、模型（model）組、低劑量BA（BA-L）組、高劑量BA（BA-H）組、TWP組和BAH+DMOG組，每組12只。除control組外，其它組大鼠均構(gòu)建RA模型［8］。簡言之，第1天通過右后足掌皮內(nèi)注射0.1 mL II型膠原蛋白-完全弗氏佐劑乳劑對(duì)大鼠進(jìn)行初次免疫，第7天通過尾根部再次注射同劑量造模劑對(duì)大鼠加強(qiáng)免疫。若大鼠出現(xiàn)后肢足趾紅腫，踝關(guān)節(jié)體積增大，則為造模成功。第2次免疫24 h后開始給藥處理：BA-L組［9］大鼠灌胃10 mg/kg BA且腹腔注射等體積的生理鹽水；BA-H組［9］大鼠灌胃30 mg/kg BA且腹腔注射等體積的生理鹽水；TWP組［10］大鼠灌胃6.25 mg/kg TWP且腹腔注射等體積的生理鹽水；BA-H+DMOG組［11］大鼠灌胃30 mg/kg BA且腹腔注射40 mg/kg DMOG；control組和model組大鼠灌胃等體積的生理鹽水且腹腔注射等體積的生理鹽水。每天給藥一次，持續(xù)4周。

3.2 標(biāo)本收集第2次免疫（給藥第0天）開始，每隔7 d測量大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化；檢測結(jié)束后，處死大鼠，每組選取4只大鼠，收集大鼠脾臟和胸腺組織用于脾臟和胸腺指數(shù)的檢測；每組選取4只大鼠，收集大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，用于HE染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)；每組取剩余的4只大鼠，收集大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，用于ELISA和Western blot。

3.3 足趾腫脹度的檢測采用水容積法，從第2次免疫（給藥第0天）開始，每隔7天測量大鼠右后足容積，即為大鼠足趾腫脹度。

3.4 關(guān)節(jié)炎指數(shù)的檢測第2次免疫（給藥第0天）開始，采取5級(jí)評(píng)分法［12］每隔7 d測量大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化：0分為關(guān)節(jié)無紅腫；1分為趾關(guān)節(jié)紅腫；2分為足趾和趾關(guān)節(jié)腫脹；3分為踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分為踝關(guān)節(jié)和所有關(guān)節(jié)腫脹、變形。大鼠所有關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和則為每只大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)值。

3.5 胸腺和脾臟指數(shù)的檢測分別取大鼠胸腺和脾臟組織，除去脂肪并用濾紙吸干表面液體，再稱量質(zhì)量，胸腺（脾臟）指數(shù)=胸腺（脾臟）質(zhì)量/體質(zhì)量。

3.6 HE染色檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理損傷將大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織在4%多聚甲醛中固定過夜，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片后，進(jìn)行HE染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察踝關(guān)節(jié)滑膜組織學(xué)變化。

3.7 ELISA法檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平。

3.8 免疫組化檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF和KDR表達(dá)取3.6中的石蠟切片，經(jīng)脫蠟、3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶、封閉后，加入Ⅰ抗（VEGF抗體，1∶500；KDR抗體，1∶200）于4℃過夜孵育，次日加Ⅱ抗反應(yīng)1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。光學(xué)顯微鏡觀察滑膜組織中呈棕黃處即為陽性表達(dá)，ImageJ軟件用于評(píng)估積分吸光度和陽性表達(dá)面積，平均吸光度=積分吸光度/陽性表達(dá)面積。

3.9 Western blot檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)RIPA裂解液提取踝關(guān)節(jié)滑膜組織勻漿中的總蛋白，經(jīng)定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜分別與Ⅰ抗（HIF-1α和GAPDH抗體，1∶2 000；VEGF抗體，1∶1 000）在4℃下過夜孵育，再在37℃下與Ⅱ抗（1∶2 000）共同孵育1 h。加入ECL試劑觀察蛋白條帶，Quantity One軟件評(píng)估蛋白灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間的差異比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BA對(duì)各組大鼠足趾腫脹度的影響

與control組比較，model組大鼠在0、7、14、21和28 d的足趾腫脹度均顯著升高（P＜0.05）；與model組比較，BA-L、BA-H和TWP組大鼠在7、14、21和28 d的足趾腫脹度均顯著降低（P＜0.05）；與BA-L組比較，BA-H和TWP組大鼠足趾腫脹度顯著降低（P＜0.05）；與BA-H組比較，TWP組大鼠足趾腫脹度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而BA-H+DMOG組則顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 黃芩素對(duì)各組大鼠足趾腫脹度的影響Table 1.The effect of baicalein（BA）on the toe swelling of the rats in each group（mL.Mean±SD.n=12）

2 BA對(duì)各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

與control組比較，model組大鼠在0、7、14、21和28 d的關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；與model組比較，BA-L、BA-H和TWP組大鼠在7、14、21和28 d的關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；與BA-L組比較，BA-H和TWP組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與BA-H組比較，TWP組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而BA-H+DMOG組則顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 黃芩素對(duì)各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響Table 2.Effect of baicalein（BA）on the arthritis index of rats in each group（Mean±SD.n=12）

3 BA對(duì)各組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

與control組比較，model組大鼠胸腺和脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與model組比較，BA-L、BA-H和TWP組大鼠胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與BA-L組比較，BA-H和TWP組大鼠胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與BA-H組比較，TWP組大鼠胸腺和脾臟指數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而BA-H+DMOG組則顯著升高（P＜0.05），見表3。

表3 黃芩素對(duì)各組大鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響Table 3.Effect of baicalein（BA）on the thymus and spleen indexes of rats in each group（mg/g.Mean±SD.n=4）

4 BA對(duì)各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理損傷的影響

HE染色結(jié)果顯示，control組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)正常，無增生現(xiàn)象；model組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生，且有大量炎癥細(xì)胞浸潤；BA-L、BA-H和TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理損傷有所減輕，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤；與BA-H組比較，BA-H+DMOG組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理損傷加劇，呈現(xiàn)嚴(yán)重的滑膜增生及炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1。

5 BA對(duì)各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平的影響

與control組比較，model組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平顯著升高（P＜0.05）；與model組比較，BA-L、BA-H和TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平顯著降低（P＜0.05）；與BA-L組比較，BA-H和TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平顯著降低（P＜0.05）；與BA-H組比較，TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而BA-H+DMOG組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平顯著升高（P＜0.05），見表4。

Figure 1.Pathological changes of the ankle joint synovial tissue of the rats in each group（HE staining，scale bar=100 μm）.Black arrows represented inflammatory cell infiltration.BA：baicalein；TWP：Tripterygium wilfordii polyglycoside tablet；DMOG：dimethyloxallyl glycine.圖1 HE染色檢測各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化

表4 黃芩素對(duì)各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平的影響Table 4.Effect of baicalein（BA）on the levels of TNF-α and IL-6 in the ankle joint synovial tissue of rats in each group（ng/L.Mean±SD.n=4）

6 BA對(duì)各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中病理性血管生成相關(guān)因子VEGF和KDR表達(dá)的影響

與control組比較，model組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF和KDR陽性表達(dá)顯著增多（P＜0.05）；與model組比較，BA-L、BA-H和TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF和KDR陽性表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與BA-L組比較，BA-H和TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF和KDR陽性表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與BA-H組比較，TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF和KDR陽性表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而BA-H+DMOG組則顯著增多（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.Immunohistochemical detection of VEGF and KDR expression in rat ankle joint synovium.Brown yellow and brown were positive expression.The scale bar=100 μm.BA：baicalein；TWP：Tripterygium wilfordii polyglycoside tablet；DMOG：dimethyloxallyl glycine.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs BA-L group；▲P＜0.05 vs BA-H group.圖2黃芩素對(duì)各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF和KDR陽性表達(dá)的影響

7 BA對(duì)各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α/VEGF通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與control組比較，model組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與model組比較，BA-L、BA-H和TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與BA-L組比較，BA-H和TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與BA-H組比較，TWP組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而BA-H+DMOG組則顯著升高（P＜0.05），見圖3。

討 論

RA是一種慢性系統(tǒng)性疾病，其中病理性血管生成可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤到關(guān)節(jié)中，導(dǎo)致滑膜炎癥、增生和進(jìn)行性骨破壞［13］。近年來，盡管RA的抗風(fēng)濕新藥顯著延緩了RA進(jìn)展并改善了RA患者的生活質(zhì)量，但是新藥所引發(fā)的不良事件增多，如肝腎毒性、嚴(yán)重感染和腫瘤的發(fā)生等［14］。因此，開發(fā)新的治療RA的藥物刻不容緩。本研究采用II型膠原蛋白-完全弗氏佐劑法誘導(dǎo)RA大鼠模型，結(jié)果顯示，與control組比較，model組大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著升高，大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理損傷嚴(yán)重，提示RA大鼠模型構(gòu)建成功。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體的免疫狀態(tài)［10］；IL-6和TNF-α作為重要的促炎因子，在RA大鼠血清中含量顯著升高［15］。本研究顯示，與control組比較，model組大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和IL-6水平均顯著升高，表明RA大鼠免疫系統(tǒng)被激活，進(jìn)而在滑膜組織中釋放大量炎癥因子，導(dǎo)致滑膜炎癥的發(fā)生。VEGF是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的重要因子，可促進(jìn)血管生成；而KDR作為VEGF上具有高親和力的酪氨酸受體，在VEGF誘導(dǎo)的血管新生及增強(qiáng)血管通透性中起關(guān)鍵作用［16］。本研究顯示，與control組比較，model組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF和KDR陽性表達(dá)增多，表明RA大鼠病理性血管大量生成。以上結(jié)果表明，RA大鼠存在炎癥反應(yīng)及病理性血管大量生成。

Figure 3.Effect of baicalein（BA）on the protein expression of HIF-1α and VEGF in the ankle joint synovial tissue of rats in each group.TWP：Tripterygium wilfordii polyglycoside tablet；DMOG：dimethyloxallyl glycine.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs BA-L group；▲P＜0.05 vs BA-H group.圖3黃芩素對(duì)各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的影響

BA是黃芩根的天然產(chǎn)物，具有許多有益的藥理活性，包括抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等［17］。據(jù)報(bào)道，BA可減弱過敏性鼻炎大鼠的炎癥反應(yīng)［18］，還可抑制胃癌細(xì)胞血管生成［19］。以上研究表明BA具有抑制炎癥反應(yīng)及病理性血管生成的作用。本研究結(jié)果與之一致。本研究顯示，BA可抑制RA大鼠炎癥反應(yīng)及病理性血管生成，且BA劑量越高，該抑制作用越明顯，而BA-H組與TWP組比較，對(duì)應(yīng)指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明BA可能通過抑制炎癥反應(yīng)及病理性血管生成來延緩RA進(jìn)展。

HIF-1α在正常氧氣條件下迅速降解，但在缺氧條件下可大量合成并誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，然后VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的活化以誘導(dǎo)炎癥，從而在RA中促進(jìn)病理性血管生成和關(guān)節(jié)炎癥［13］。相關(guān)研究顯示，抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路可減弱氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變大鼠血管生成［20］，還可減輕急性肺損傷大鼠肺部炎癥［21］。本研究結(jié)果與之一致。本研究顯示，BA可抑制RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)，且BA劑量越高，對(duì)蛋白的抑制作用越明顯。雷公藤多苷作為雷公藤的提取物，具有抗炎作用，已有研究報(bào)道雷公藤多苷可以改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者Th17和Treg細(xì)胞數(shù)目失衡［22］。因此，本研究選用TWP作為陽性藥物，且BA-H組與TWP組比較，HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測BA可能通過抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路抑制RA大鼠炎癥反應(yīng)及病理性血管生成。為了驗(yàn)證該猜想，本研究在BA-H的基礎(chǔ)上再以HIF-1α激動(dòng)劑DMOG干預(yù)RA大鼠，結(jié)果顯示，DMOG減弱了BA-H對(duì)RA大鼠炎癥反應(yīng)及病理性血管生成的抑制作用，證實(shí)上述猜想之正確，即BA可能通過抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路抑制RA大鼠炎癥反應(yīng)及病理性血管生成。

綜上所述，BA可能通過抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路抑制RA大鼠炎癥反應(yīng)及病理性血管生成。BA可能成為治療RA的潛在藥物。