• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-409-3p通過抑制PIK3CA介導的自噬增強耐藥卵巢癌細胞對順鉑的敏感性*

    2023-01-05 03:01:46廖鳳兒
    中國病理生理雜志 2022年12期
    關鍵詞:螢光瘤體卵巢癌

    廖鳳兒,陶 瑩,駱 婕,李 筠,郭 琴

    (廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣東 廣州 510062)

    卵巢癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤[1]。手術切除及術后輔以紫杉醇或鉑類藥物為主的化療是標準的卵巢癌治療方法[2]?;熌退幮詴萍s化療效果,并且這種耐藥性往往也存在交叉性耐藥,此時更換或聯(lián)合其他種類化療藥物也難以使病人獲益[3-4]。因此,尋找能使得卵巢癌耐藥細胞重新恢復化療敏感性的方法具有重要意義。

    既往研究報道,微小RNA(microRNA,miRNA,miR)在腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移及化療耐藥等生物學行為的調控中發(fā)揮著關鍵作用[5-6]。miR-409-3p已被發(fā)現(xiàn)可抑制胃癌、肝癌和乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生和進展[7-9]。另外,miR-409-3p可通過靶向beclin-1逆轉結直腸癌細胞的奧沙利鉑耐藥性[10]。然而,miR-409-3p在卵巢癌中對順鉑敏感性的影響仍不清楚。因此,本研究探討miR-409-3p對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響,并分析可能的機制。

    材料和方法

    1 材料

    卵巢癌細胞株SKOV3和A2780(武漢普諾賽生命科技有限公司);耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP和A2780/DDP(上海信裕生物技術有限公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);青霉素/鏈霉素和DMEM培養(yǎng)液(Thermo Fisher Scientific);順鉑(純度99.95%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);雷帕霉素(rapamycin,Rap;純度>99%,Selleck);WST-1比色法細胞活力定量試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司);Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司);Cyto-ID細胞自噬檢測試劑盒(Enzo Life Sciences);Hiperfect轉染試劑、RNeasy試劑盒、Omniscript RT試劑盒和Taq PCR Master Mix試劑盒(Qiagen);野生型(wild-type,WT)和突變型(mutant,MUT)磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA)3′UTR螢光素酶表達載體、miR-NC及miR-409-3p mimics由上海生工生物工程有限公司構建;si-NC、si-PIK3CA、pcDNA-NC、pcDNA-PIK3CA、攜帶miR-NC的慢病毒(lentivirus,LV)載 體(LV-miR-NC)、LV-miR-409-3p mimics和LVPIK3CA由廣州銳博生物科技有限公司構建;beclin-1和SQSTM1抗體(Cell Signaling Technology);LC3和PIK3CA抗體(Arigo Biolaboratories);GAPDH抗體和HRP標記的羊抗兔IgG(上海碧云天生物技術有限公司)。

    2 方法

    2.1 臨床樣本收集選取接收腫瘤切除術且在術后給予以鉑類藥物為主的標準流程化療方案的II~III期卵巢癌患者。收集受試者的切除癌組織與癌旁組織(約距癌浸潤邊緣2 cm,并經(jīng)病理驗證為非腫瘤組織)。其中,在化療后6個月內(nèi)復發(fā)的受試者的癌組織定義為化療耐藥組織,6個月未復發(fā)的受試者的癌組織定義為化療敏感組織。本研究共納入16例化療敏感癌組織和10例化療耐藥癌組織,同時納入對應的癌旁非腫瘤組織。將組織樣品快速冷凍并儲存在-80℃,備用。本研究通過廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準,采集樣本的受試者均簽署書面知情同意。

    2.2 細胞培養(yǎng)SKOV3和A2780細胞種植在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞種植在含有20 mg/L順鉑、10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

    2.3 RT-qPCR檢測miR-409-3p表達使用RNeasy試劑盒從組織和細胞中提取總RNA。利用Omniscript RT試劑盒逆轉錄為cDNA。然后根據(jù)Taq PCR Master Mix試劑盒說明書步驟,以cDNA為模板進行RT-qPCR分析。miR-409-3p的上游引物序列為5′-GCGAATGTTGCTCGGTGA-3′,下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;內(nèi)參照U6的上游引物序列為5′-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物序列為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。RT-qPCR循環(huán)條件為:95℃20 s,然后40個循環(huán)(95℃15 s,58℃1 min)。采用2-ΔΔCt法分析miR-409-3p相對表達量。

    2.4 靶基因預測與驗證用starBase在線數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測PIK3CA為miR-409-3p的潛在靶基因之一。根據(jù)預測結合的序列構建WT和MUT PIK3CA 3′UTR螢光素酶表達載體,然后根據(jù)雙螢光素酶報告基因試劑盒指示步驟,將其分別與miR-409-3p mimic和miR-NC轉入細胞,轉染48 h后,用PBS洗2次,加入底物,用發(fā)光儀測定發(fā)光強度,并計算相對螢光素酶活性。

    2.5 細胞轉染與藥物處理分別取對數(shù)生長期的SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞,按照說明書指示步驟,用Hiperfect轉染試劑分別將miR-NC或miR-409-3p mimics、si-NC或si-PIK3CA、pcDNA-NC或pcDNAPIK3CA轉入細胞,培養(yǎng)48 h。用(或不用)終濃度100 nmol/L的Rap處理上 述 細胞30 min后,收集 細胞,用于后續(xù)實驗。

    2.6 細胞活力檢測細胞均以10000細胞/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板,并分別給予2.5、5、10、20、40和80 mg/L的順鉑中培養(yǎng)2 d。參照WST-1比色法定量試劑盒說明書步驟,采用酶標儀在450 nm處的吸光度值。

    2.7 細胞凋亡檢測細胞均以3.5×105個細胞/孔的密度接種于6個孔板上,并給予20 mg/L順鉑培養(yǎng)2 d。按照說明書指示步驟,在避光條件下,用Annexin V-FITC和PI試劑孵育細胞15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

    2.8 Cyto-ID染色取處理后的細胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中并待細胞貼壁后,按照說明書指示步驟,用Cyto-ID綠色染料標記自噬小泡,然后用Hoechst 33342標記細胞核,用激光共聚焦顯微鏡觀察并獲取Cyto-ID陽性斑點圖像,并用Adobe Photoshop CC軟件計數(shù)每個細胞中Cyto-ID陽性斑點數(shù),每個視野至少計數(shù)20個細胞。

    2.9 Western blot取人組織和細胞樣品,在4℃下用RIPA裂解萃取蛋白質。蛋白質定量后,用快速蛋白免疫轉印系統(tǒng)進行轉印。將其轉印于PVDF膜的蛋白用5%脫脂奶粉封閉1 h后,按抗體說明書的稀釋比例,分別孵育beclin-1、SQSTM1、LC3、PIK3CA和GAPDH抗體,4℃過夜。TBST洗5 min×3次,孵育HRP-羊抗兔IgG二抗,室溫1 h。通過增強的化學發(fā)光試劑顯影。以GAPDH為內(nèi)部參照,利用Image J軟件分析蛋白相對表達量。

    2.10 裸鼠荷瘤實驗此實驗由威斯騰生物醫(yī)藥科技有限公司完成。分別將穩(wěn)轉LV-miR-NC、LV-miR-409-3p mimics及LV-miR-409-3p mimics+PIK3CA(共轉染)的SKOV3/DDP細胞用PBS制備成1×1010L-1的細胞懸液,取150 μL接種至BALB/c裸鼠右腋皮下。小鼠分別給予或未給予腹腔注射順鉑(5 mg/kg,每周3次,持續(xù)4周)和/或Rap(2 mg/kg,每天1次,持續(xù)4周),每周用游標卡尺測量瘤體長徑和短徑,并計算瘤體體積(瘤體體積=長徑×短徑2/2)。第4周末,麻醉小鼠,收集瘤體,按照常規(guī)法將瘤體組織用石蠟包埋,并切片(4 μm)。切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復與封閉后,按照免疫組化SABC法進行操作,顯微鏡下觀察瘤體組織中beclin-1和PIK3CA的表達情況。

    3 統(tǒng)計學分析

    采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)描述。兩組間差異比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析,多組間均數(shù)兩兩事后比較用Bonferroni校正法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    1 耐藥卵巢癌組織和細胞中miR-409-3p表達下調

    與癌旁組織比較,化療敏感和耐藥卵巢癌組織中miR-409-3p表達水平均顯著降低(P<0.05),且耐藥卵巢癌組織中miR-409-3p表達水平較敏感組織顯著降低(P<0.05),見圖1A。在卵巢癌細胞系中,耐順鉑細胞系SKOV3/DDP和A2780/DDP中miR-409-3p表達水平均顯著低于其親本細胞(P<0.05),見圖1B。

    Figure 1.Expression of miR-409-3p in ovarian cancer tissues and cells.A:miR-409-3p expression levels in chemosensitive tumor(T)tissues(n=16),chemo-resistant T tissues(n=10)and their corresponding adjacent non-tumor(N)tissues;B:miR-409-3p expression levels in SKOV3,SKOV3/DDP,A2780 and A2780/DDP cells(n=3).Mean±SD.*P<0.05 vs N;#P<0.05 vs sensitive;△P<0.05 vs SKOV3 cells;▲P<0.05 vs A2780 cells.圖1卵巢癌組織和細胞中miR-409-3p表達情況

    2 miR-409-3p提高耐藥卵巢癌細胞的順鉑敏感性

    與miR-NC組比較,miR-409-3p mimics組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞的活力(圖2A、B)均顯著降低(P<0.05),凋亡比例(圖2C)均顯著升高(P<0.05)。

    3 miR-409-3p抑制自噬

    Figure 2.Over-expression of miR-409-3p reduced cisplatin resistance.A and B:the viability of A2780/DDP(A)and SKOV3/DDP(B)cells was detected by WST-1 assay;C:the apoptosis of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs miR-NC group.圖2過表達miR-409-3p降低順鉑耐藥性

    Cyto-ID染色結果(圖3A)顯示,與miR-NC組比較,miR-409-3p mimics組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中平均每個細胞的Cyto-ID染色斑點數(shù)均顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測自噬相關蛋白結果(圖3B)顯示,與miR-NC組比較,miR-409-3p mimics組SKOV3/DDP和A2780/DDP細 胞 中beclin-1表達水平和LC3-II/LC3-I比值均顯著降低(P<0.05),SQSTM1表達水平均顯著升高(P<0.05)。

    4 自噬誘導劑Rap能消除miR-409-3p的順鉑增敏作用

    WST-1實驗(圖4A、B)和流式細胞術(圖4C)結果顯示,與miR-409-3p mimics組比較,miR-409-3p mimics+Rap組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞活力均顯著升高(P<0.05),凋亡率均顯著降低(P<0.05)。

    5 miR-409-3p靶向抑制PIK3CA表達

    生物信息學預測PIK3CA與miR-409-3p存在潛在結合序列(圖5A)。雙螢光素酶報告基因結果(圖5B)顯示,在轉染W(wǎng)T PIK3CA 3′UTR螢光素酶表達載體的細胞,與miR-NC組比較,miR-409-3p mimics組相對螢光素酶活性顯著降低(P<0.05);而在轉染MUT PIK3CA 3′UTR螢光素酶表達載體的細胞,miRNC組的相對螢光素酶活性與miR-409-3p mimics組無顯著差異(P>0.05)。Western blot結果顯示,與化療敏感組織或敏感細胞比較,耐藥組織(圖5C)和耐順鉑細胞(圖5D)中PIK3CA蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-409-3p mimics組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中PIK3CA蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05),見圖5E。

    6 敲減PIK3CA能抑制卵巢癌細胞自噬并增強其對順鉑的敏感性

    Cyto-ID染色結果(圖6A)顯示,與si-NC組比較,si-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中平均每個細胞的Cyto-ID染色斑點數(shù)均顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測自噬相關蛋白結果(圖6B)顯示,與si-NC組比較,si-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中beclin-1表達水平和LC3-II/LC3-I比值均顯著降低(P<0.05),SQSTM1表達水平均顯著升高(P<0.05)。WST-1(圖7A、B)和流式細胞術(圖7C)結果顯示,與si-NC組比較,si-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞活力均顯著降低(P<0.05),凋亡比例均顯著升高(P<0.05)。

    Figure 3.Over-expression of miR-409-3p reduced autophagy of drug-resistant ovrian cancer cells.A:Cyto-ID staining of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells(scale bar=10 μm);B:the expression levels of autophagy-related proteins beclin-1,LC3 and SQSTM1 in A2780/DDP and SKOV3/DDP cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs miR-NC group.圖3過表達miR-409-3p降低耐藥卵巢癌細胞自噬水平

    Figure 4.Rapamycin(Rap)eliminated the sensitizing effect of miR-409-3p on drug-resistant ovrian cancer cells to cisplatin.A and B:the viability of A2780/DDP(A)and SKOV3/DDP(B)cells was detected by WST-1 assay;C:the apoptosis of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs miR-409-3p mimics group.圖4雷帕霉素消除miR-409-3p對耐藥卵巢癌細胞的順鉑增敏作用

    Figure 5.PIK3CA was the target gene of miR-409-3p.A:predicted PIK3CA binding sequence to miR-409-3p;B:luciferase activity detection to validate the binding relationship(n=3);C:the expression levels of PIK3CA in chemosensitive tumor(T)tissues(n=16),chemoresistant T tissues(n=10)and their corresponding adjacent non-tumor(N)tissues;D:the expression levels of PIK3CA in SKOV3,SKOV3/DDP,A2780 and A2780/DDP cells(n=3);E:the expression levels of PIK3CA in A2780/DDP and SKOV3/DDP cells from miR-NC and miR-409-3p mimics groups(n=3).Mean±SD.*P<0.05 vs miR-NC group;#P<0.05 vs N;&P<0.05 vs sensitive;△P<0.05 vs A2780 cells;▲P<0.05 vs SKOV3 cells.圖5 PIK3CA為miR-409-3p的靶基因

    7 過表達PIK3CA能消除miR-409-3p的抑制自噬和順鉑增敏的作用

    Western blot結果(圖8A)顯示,與miR-409-3p mimics+pcDNA-NC組 比 較,miR-409-3p mimics+pcDNA-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中PIK3CA和beclin-1表達水平及LC3-II/LC3-I比值均顯著升高(P<0.05),SQSTM1表達水平均顯著降低(P<0.05)。Cyto-ID染色結果(圖8B)顯示,與miR-409-3p mimics+pcDNA-NC組 比較,miR-409-3p mimics+pcDNA-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中平均每個細胞的Cyto-ID染色斑點數(shù)均顯著增加(P<0.05)。WST-1(圖9A、B)和流式細胞術(圖9C)結果顯示,與miR-409-3p mimics+pcDNA-NC組比較,miR-409-3p mimics+pcDNA-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞活力均顯著升高(P<0.05),凋亡率均顯著降低(P<0.05)。

    8 miR-409-3p、PIK3CA和順鉑對SKOV3/DDP細胞移植瘤小鼠荷瘤生長的影響

    游標卡尺測量的瘤體體積結果(圖10A)顯示,與對照組比較,LV-miR-409-3p mimics組和單獨順鉑組的瘤體體積均顯著減小(P<0.05);與單獨順鉑組比較,順鉑+LV-miR-409-3p mimics組的瘤體體積顯著減小(P<0.05);與順鉑+LV-miR-409-3p mimics組比較,順鉑+LV-miR-409-3p mimics+Rap組和順鉑+LV-miR-409-3p mimics+PIK3CA組的瘤體體積均顯著增大(P<0.05)。第4周分離的瘤體的照片也顯示出與游標卡尺測量的瘤體體積相似的結果,順鉑+LV-miR-409-3p mimics組瘤體顯示的體積最小(圖10B)。免疫組織化學染色結果(圖10C)顯示,順鉑+LV-miR-409-3p mimics+Rap組和順鉑+LV-miR-409-3p mimics+PIK3CA組瘤體組織中PIK3CA和beclin-1陽性染色范圍廣且染色強度高,但LV-miR-409-3p mimics組和順鉑+LV-miR-409-3p mimics組瘤體組織中PIK3CA和beclin-1陽性染色范圍?。ㄉ踔敛糠忠曇拔匆婈栃匀旧┣胰旧珡姸鹊汀?/p>

    Figure 6.Knockdown of PIK3CA reduced autophagy level.A:Cyto-ID staining of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells(scale bar=10 μm);B:the expression levels of autophagy-related proteins beclin-1,LC3 and SQSTM1 in A2780/DDP and SKOV3/DDP cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs si-NC group.圖6敲減PIK3CA降低細胞自噬水平

    Figure 7.Knockdown of PIK3CA enhanced cisplatin sensitivity.A and B:the viability of A2780/DDP(A)and SKOV3/DDP(B)cells was detected by WST-1 assay;C:the apoptosis of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs si-NC group.圖7敲減PIK3CA增強順鉑敏感性

    Figure 10.miR-409-3p increased the sensitivity of SKOV3/DDP cells to cisplatin in vivo.A:changes of the tumor volume in each group;B:photographs of the isolated tumors in each group;C:representative immunohistochemical staining images of PIK3CA and beclin-1 in isolated tumor tissues of each group.Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs cisplatin group;&P<0.05 vs cisplatin+LV-miR-409-3p mimics group.圖10 miR-409-3p增加SKOV3/DDP細胞在體內(nèi)對順鉑的敏感性

    討 論

    在腫瘤的研究中,許多影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展和化療藥物敏感性的癌基因和抑癌基因都受到miRNAs的調控,故這些miRNAs可能成為新的治療靶點[5-6,11]。miR-409-3p已被報道在多種腫瘤中可作為腫瘤抑制因子[7-9]。近來研究發(fā)現(xiàn),過表達miR-409-3p可部分恢復結直腸癌耐藥細胞對順鉑的敏感性[10]。盡管miR-409-3p已被證明在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有調控功能,但其在卵巢癌中對順鉑化療的具體作用尚不清楚。本研究結果顯示,miR-409-3p能增強卵巢癌耐藥細胞對順鉑的敏感性。

    自噬參與調控腫瘤的化療的敏感性。一些研究顯示,自噬能在腫瘤細胞化療中對化療劑誘導的凋亡起著協(xié)同作用[12-13]。但更多的研究支持自噬在腫瘤細胞(特別是在實體腫瘤細胞)中主要表現(xiàn)為對化療劑導致的凋亡起拮抗作用,起到降低化療敏感性的效應[14-16]。推測造成這種現(xiàn)象的差異可能是因為不同種類的細胞的自噬閾值以及的應激條件的不同。另外,順鉑在殺傷卵巢癌A2780細胞的同時也能引起自噬,繼而發(fā)生耐藥[17]。本研究探索了miR-409-3p對自噬的影響。其中,beclin-l參與了從自噬體的形成到自噬溶酶體的成熟的途徑中的每一個重要步驟,是自噬激活的關鍵分子[18];自噬小體中的LC3-II是細胞發(fā)生自噬的分子標志,LC3-II/LC3-I比值可反映自噬的水平[19];SQSTM1與泛素化蛋白結合,再與定位于自噬小體內(nèi)膜上的LC3-II蛋白形成復合物,在自噬溶酶體內(nèi)降解,進而促進自噬[18-19]。本研究顯示,在耐藥卵巢癌組織和細胞中beclin-1表達水平和LC3-II/LC3-I比值升高,而SQSTM1表達水平降低,提示自噬活性增強;外源性過表達miR-409-3p能抑制耐藥卵巢癌細胞的自噬,而激活自噬能消除miR-409-3p的功能,提示miR-409-3p能通過抑制自噬進而恢復耐藥卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。

    miRNAs可通過轉錄后水平負向調控靶基因的表達來廣泛參與細胞的生長、增殖、分化和凋亡等生理病理過程[5-6]。本研究借助生物信息學分析顯示miR-409-3p與PIK3CA存在靶向結合序列,進一步研究得出PIK3CA是miR-409-3p的直接調控靶點。PIK3CA可通過AKT/mTOR信號激活自噬[20-21]。本研究顯示,敲減PIK3CA能抑制耐藥卵巢癌細胞自噬,而過表達PIK3CA能消除miR-409-3p抑制自噬和順鉑增敏的作用,說明miR-409-3p可通過靶向PIK3CA而抑制促存活自噬,進而恢復耐藥卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。

    綜上所述,miR-409-3p可通過抑制PIK3CA介導的自噬在耐藥卵巢癌細胞中發(fā)揮順鉑增敏作用。

    猜你喜歡
    螢光瘤體卵巢癌
    火蟲發(fā)光為什么一閃一閃的
    腹主動脈瘤腔內(nèi)修復術后瘤體直徑及體積變化的隨訪研究
    卵巢癌:被遺忘的女性“沉默殺手”
    流螢之光
    活色螢光“耀”個性
    鳳凰生活(2018年8期)2018-09-03 10:38:12
    流螢之光
    Wnt3 a和TCF4在人卵巢癌中的表達及臨床意義
    《牛陰莖乳頭狀瘤的外科治療》圖版
    體表軟組織巨大神經(jīng)纖維瘤的手術治療
    microRNA與卵巢癌轉移的研究進展
    白带黄色成豆腐渣| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品久久视频播放| 美女高潮的动态| 老女人水多毛片| 人人妻人人看人人澡| 在线a可以看的网站| 亚洲精品日韩av片在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 日韩亚洲欧美综合| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精品在线美女| 日本精品一区二区三区蜜桃| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲avbb在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 午夜a级毛片| 黄色视频,在线免费观看| 国产美女午夜福利| 人人妻人人看人人澡| 悠悠久久av| 午夜a级毛片| 51午夜福利影视在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产麻豆成人av免费视频| 美女高潮的动态| 中文字幕高清在线视频| 午夜福利在线在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲人成电影免费在线| 真实男女啪啪啪动态图| 小说图片视频综合网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 小说图片视频综合网站| 亚洲精品色激情综合| 色精品久久人妻99蜜桃| 内地一区二区视频在线| av天堂中文字幕网| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲成av人片免费观看| 日日夜夜操网爽| 999久久久精品免费观看国产| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 麻豆av噜噜一区二区三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲av二区三区四区| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲无线在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日本 av在线| 99久久精品热视频| АⅤ资源中文在线天堂| 草草在线视频免费看| 精品国产三级普通话版| 亚洲精品色激情综合| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 天堂√8在线中文| www.色视频.com| 国产乱人伦免费视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 中文字幕免费在线视频6| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产日本99.免费观看| 国产视频内射| 少妇的逼水好多| 午夜福利高清视频| 乱人视频在线观看| 久久99热6这里只有精品| 国产精品野战在线观看| 国产野战对白在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 老司机福利观看| 国内精品一区二区在线观看| 日韩免费av在线播放| 色哟哟·www| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲国产精品sss在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 午夜激情欧美在线| 国产探花极品一区二区| www.色视频.com| a在线观看视频网站| 真实男女啪啪啪动态图| av在线蜜桃| 色哟哟·www| x7x7x7水蜜桃| 欧美日本视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 男女视频在线观看网站免费| 级片在线观看| 国产乱人视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| av国产免费在线观看| 夜夜爽天天搞| 免费观看精品视频网站| 男人舔奶头视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国内精品美女久久久久久| 变态另类丝袜制服| 91麻豆av在线| 亚洲国产精品合色在线| 欧美午夜高清在线| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品久久久久久成人av| 永久网站在线| 欧美日韩乱码在线| 国产69精品久久久久777片| 特级一级黄色大片| 国产91精品成人一区二区三区| 国产亚洲精品久久久com| 国产探花在线观看一区二区| 国产高清视频在线播放一区| 一个人免费在线观看电影| 国产精品亚洲av一区麻豆| 757午夜福利合集在线观看| 午夜影院日韩av| 久久6这里有精品| 黄色丝袜av网址大全| 永久网站在线| 天美传媒精品一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 一区二区三区高清视频在线| av在线天堂中文字幕| 99热这里只有是精品在线观看 | 国产成人影院久久av| 亚洲av成人精品一区久久| 91字幕亚洲| 深爱激情五月婷婷| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品综合久久久久久久免费| а√天堂www在线а√下载| 国产精品亚洲av一区麻豆| 婷婷精品国产亚洲av| 深夜精品福利| 久久草成人影院| 一级黄色大片毛片| 亚洲av电影在线进入| 91麻豆av在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 性色av乱码一区二区三区2| 精品久久久久久久久久久久久| 成人av一区二区三区在线看| 狠狠狠狠99中文字幕| 99久久成人亚洲精品观看| 国内精品美女久久久久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 88av欧美| 亚洲精品456在线播放app | 99热只有精品国产| 美女高潮的动态| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 露出奶头的视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 99热这里只有精品一区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 嫩草影院精品99| 亚洲avbb在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本五十路高清| 久久亚洲真实| 中文资源天堂在线| 亚洲av美国av| 成年免费大片在线观看| 999久久久精品免费观看国产| av在线天堂中文字幕| 黄色丝袜av网址大全| 日韩人妻高清精品专区| 色精品久久人妻99蜜桃| 在线国产一区二区在线| 我的女老师完整版在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 在线a可以看的网站| 久久精品综合一区二区三区| 级片在线观看| 久久国产乱子免费精品| 久久久国产成人免费| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩欧美三级三区| 久久草成人影院| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲在线自拍视频| 精华霜和精华液先用哪个| 毛片女人毛片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩人妻高清精品专区| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品国产高清国产av| 国产黄a三级三级三级人| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩精品中文字幕看吧| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产成年人精品一区二区| 国产69精品久久久久777片| 亚洲中文字幕日韩| 51午夜福利影视在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 美女免费视频网站| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美性感艳星| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产成人aa在线观看| 国产黄片美女视频| 色综合站精品国产| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 毛片女人毛片| 久久国产精品影院| 一区二区三区四区激情视频 | 欧美一区二区亚洲| 日日夜夜操网爽| 国产高清激情床上av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲精华国产精华精| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 高清日韩中文字幕在线| 中文字幕免费在线视频6| 国产三级中文精品| 国产亚洲精品久久久com| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 97热精品久久久久久| 中文字幕av在线有码专区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美日韩乱码在线| 在线观看舔阴道视频| 精品乱码久久久久久99久播| 俺也久久电影网| 国产在线精品亚洲第一网站| 国语自产精品视频在线第100页| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产视频一区二区在线看| 美女免费视频网站| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费看a级黄色片| 欧美在线一区亚洲| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 精品一区二区免费观看| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品,欧美在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 超碰av人人做人人爽久久| 午夜精品在线福利| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产乱人伦免费视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产成人aa在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产不卡一卡二| 免费人成视频x8x8入口观看| 麻豆国产av国片精品| 欧美最黄视频在线播放免费| 1000部很黄的大片| 欧美黑人欧美精品刺激| 两人在一起打扑克的视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 极品教师在线免费播放| 午夜日韩欧美国产| 深夜精品福利| 亚洲在线自拍视频| 亚洲自偷自拍三级| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 老司机午夜福利在线观看视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久九九热精品免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一夜夜www| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 男女那种视频在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产野战对白在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 99热6这里只有精品| 国产精品综合久久久久久久免费| av女优亚洲男人天堂| 久久香蕉精品热| 亚洲黑人精品在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久亚洲真实| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 舔av片在线| 看片在线看免费视频| 一二三四社区在线视频社区8| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 美女高潮的动态| 国产三级中文精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 12—13女人毛片做爰片一| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美成人一区二区免费高清观看| h日本视频在线播放| 99国产精品一区二区蜜桃av| 婷婷亚洲欧美| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩国内少妇激情av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 色综合婷婷激情| 床上黄色一级片| 日韩大尺度精品在线看网址| 精品久久久久久久久av| 99精品在免费线老司机午夜| 国产黄a三级三级三级人| 高潮久久久久久久久久久不卡| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品一区二区三区四区久久| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品三级大全| 国产在线男女| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 91在线观看av| 国产黄色小视频在线观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美性感艳星| 亚洲最大成人中文| 久久久久久久精品吃奶| 一个人看的www免费观看视频| 欧美激情在线99| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲无线观看免费| 日韩欧美免费精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品女同一区二区软件 | 成人三级黄色视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲精品日韩av片在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 丁香欧美五月| 我的老师免费观看完整版| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 91九色精品人成在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 女人被狂操c到高潮| 日韩欧美精品v在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 一a级毛片在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲片人在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产精品一区二区性色av| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲国产高清在线一区二区三| 午夜福利视频1000在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 午夜福利在线在线| 无人区码免费观看不卡| 2021天堂中文幕一二区在线观| 成年免费大片在线观看| avwww免费| 国产精品永久免费网站| 日韩中字成人| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日韩av在线大香蕉| 国产一级毛片七仙女欲春2| 有码 亚洲区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 午夜福利欧美成人| 最新在线观看一区二区三区| 伊人久久精品亚洲午夜| 天堂√8在线中文| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品人妻偷拍中文字幕| 男女之事视频高清在线观看| 日韩欧美在线乱码| 欧美午夜高清在线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品,欧美在线| 国产成人aa在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 午夜亚洲福利在线播放| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 成年免费大片在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 老女人水多毛片| 一级a爱片免费观看的视频| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品三级大全| 高清在线国产一区| 欧美又色又爽又黄视频| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩东京热| a级毛片免费高清观看在线播放| 成人精品一区二区免费| 天堂√8在线中文| 久久国产精品人妻蜜桃| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品,欧美在线| 成人一区二区视频在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 国产毛片a区久久久久| 男女视频在线观看网站免费| 日本黄大片高清| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 人妻久久中文字幕网| 欧美午夜高清在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99国产综合亚洲精品| 白带黄色成豆腐渣| 欧美色视频一区免费| 精品人妻1区二区| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲激情在线av| 免费在线观看日本一区| 听说在线观看完整版免费高清| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 97热精品久久久久久| 两个人的视频大全免费| 色视频www国产| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 九色国产91popny在线| 久久精品综合一区二区三区| 757午夜福利合集在线观看| 性色avwww在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产高清激情床上av| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲最大成人av| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 午夜福利在线在线| 久久精品国产亚洲av天美| 一二三四社区在线视频社区8| 韩国av一区二区三区四区| 久久6这里有精品| 欧美三级亚洲精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| www日本黄色视频网| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 精品久久久久久久久av| 亚洲欧美日韩东京热| 桃红色精品国产亚洲av| 国产av在哪里看| 日本在线视频免费播放| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久久久九九精品影院| 亚洲真实伦在线观看| 一级av片app| 久久精品国产清高在天天线| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩av在线大香蕉| 国产高清视频在线播放一区| 特大巨黑吊av在线直播| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲,欧美,日韩| 丝袜美腿在线中文| 亚洲精品在线美女| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲av美国av| 亚洲,欧美,日韩| 一本久久中文字幕| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 在线播放国产精品三级| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产探花极品一区二区| 午夜精品在线福利| 美女大奶头视频| av黄色大香蕉| 黄色视频,在线免费观看| 一级黄色大片毛片| 国产中年淑女户外野战色| 最新中文字幕久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久久精品吃奶| 成人毛片a级毛片在线播放| 简卡轻食公司| 一区福利在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 99国产精品一区二区蜜桃av| 又紧又爽又黄一区二区| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲片人在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品久久久久久人妻精品电影| av在线蜜桃| 91麻豆av在线| 变态另类丝袜制服| 伦理电影大哥的女人| 最近在线观看免费完整版| 久久国产乱子免费精品| 日韩大尺度精品在线看网址| av视频在线观看入口| 国产高清视频在线播放一区| 色综合欧美亚洲国产小说| 免费高清视频大片| 少妇高潮的动态图| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 中文字幕久久专区| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲成人久久性| 亚洲av不卡在线观看| 国产成人福利小说| 网址你懂的国产日韩在线| 国产成人av教育| 草草在线视频免费看| 日韩欧美在线乱码| a在线观看视频网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲在线自拍视频| 欧美激情在线99| 大型黄色视频在线免费观看| av黄色大香蕉| 免费观看人在逋| 三级国产精品欧美在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产成人福利小说| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 美女 人体艺术 gogo| 好男人电影高清在线观看| 亚洲不卡免费看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 在线看三级毛片| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产高清激情床上av| 91在线观看av| 欧美成狂野欧美在线观看| 一a级毛片在线观看| 中文字幕高清在线视频| 久久久久九九精品影院| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲av成人精品一区久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩欧美国产在线观看| 天美传媒精品一区二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲男人的天堂狠狠| 最近视频中文字幕2019在线8| 在线天堂最新版资源| 极品教师在线视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲专区国产一区二区| 国产成人欧美在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品1区2区在线观看.| 最新在线观看一区二区三区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 最新在线观看一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚州av有码| 伦理电影大哥的女人| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| h日本视频在线播放| 欧美黄色淫秽网站| 88av欧美| 一个人看的www免费观看视频| 国产69精品久久久久777片| 亚洲精品粉嫩美女一区| av天堂中文字幕网| 国产精品伦人一区二区| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡|