環(huán)狀RNA 在非小細胞肺癌順鉑耐藥中的研究進展

唐瑜琳 何 新

1.贛南醫(yī)學院第一臨床醫(yī)學院，江西贛州 341000；2.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江西贛州 341000

肺癌是全球發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤[1]。根據(jù)組織學類型，肺癌可分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）。NSCLC 約占肺癌的85%，主要包括肺腺癌和肺鱗狀細胞癌。近年來，雖然診斷方法和治療方法快速發(fā)展，但肺癌的5 年總生存率仍然較低[2-4]。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新型RNA[5]，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多種水平上對生命活動進行關鍵性調(diào)控[6]。研究顯示circRNA在腫瘤組織中表達異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[7]。circRNA 具有表達量高及在血液、組織液、分泌物中廣泛存在的特點[8]。研究表明，circRNA可影響細胞的生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而在體外和體內(nèi)促進NSCLC 的進展。由于其在不同體液中的穩(wěn)定性，circRNA 有望成為NSCLC 新的診斷/預后生物標志物和潛在治療靶點[9]。

1965 年，順鉑（cisplatin，DDP）首次被用于抗腫瘤研究[10]。DDP 的抗腫瘤活性逐漸得到證實，廣泛用于治療包括NSCLC 在內(nèi)的人類腫瘤性疾病[11]。DDP 的作用方式與其與DNA 上的嘌呤堿基交聯(lián)能力有關，可干擾DNA 修復機制，引起DNA 損傷，隨后誘導癌細胞凋亡。然而，由于耐藥性和不良反應眾多，DDP 的臨床應用受到一定限制[12]。

1 circRNA 概述及功能

circRNA 是一組新型的單鏈、共價閉環(huán)RNA 分子，它們不具有3'和5'末端，能夠抵抗核糖核酸酶R（ribonuclease R，RNase R）的降解，因而circRNA相較于線性RNA 更穩(wěn)定、半衰期更長[7]。1976 年Sanger 等在病毒中首次發(fā)現(xiàn)circRNA，最初其被認為是剪接過程中形成的副產(chǎn)物，并未引起重視[13]。隨后的多項研究表明，在各種物種中均發(fā)現(xiàn)或合成circRNA，包括病毒、原核生物、單細胞真核生物和哺乳動物[14]。近年來，由于高通量測序及生物信息分析的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)circRNA 在基因表達調(diào)控和多種疾病中發(fā)揮重要作用[15]。根據(jù)來源，目前可將circRNA 分為四類：外顯子circRNA（ecircRNA）、內(nèi)含子circRNA（ciRNA）、外顯子-內(nèi)含子circRNA（EIciRNA）和tRNA 內(nèi)含子circRNA（tricRNA）[16]。circRNA 的主要功能包括調(diào)節(jié)親本基因表達、參與表觀遺傳調(diào)控、充當miRNA 海綿、充當?shù)鞍踪|(zhì)“骨架”與RNA 蛋白質(zhì)結(jié)合、參與蛋白質(zhì)翻譯調(diào)節(jié)、作為翻譯模板編碼蛋白質(zhì)等[17]。

2 circRNA 與非小細胞肺癌

研究表明，與癌旁正常組織相比，NSCLC 中的circRNA 表達水平異常。Zhou 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_102179 在NSCLC 組織和細胞中的表達水平高于癌旁正常肺組織。circRNA_102179 通過miR-330-5p 海綿作用正向調(diào)節(jié)高遷移率族蛋白B3（highy mobility group protein B3，HMGB3）的表達，促進NSCLC 細胞增殖、侵襲和遷移。Liu 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與相鄰的非腫瘤組織相比，circ_0001649 在NSCLC 組織中的表達顯著降低，且circ_0001649 表達較低的患者總生存時間短于高表達者，其表達水平與 TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，并通過miR-331-3p 和miR-338-5p 海綿作用抑制NSCLC 進展，提示其有潛力成為評估NSCLC 預后的生物標志物。Wang 等[20]發(fā)現(xiàn)一種人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN 基因）衍生的circRNA（hsa_circ_0094342，circ-PTEN），可通過充當miR-155 和miR-330-3p 海綿在轉(zhuǎn)錄后增加其宿主PTEN 基因表達，導致致癌的磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路失活。研究表明，PTEN 通過三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化和抑制原癌基因PI3K/Akt 蛋白激酶信號通路，發(fā)揮抑制腫瘤的作用[21]。細胞周期蛋白E1 是一種重要的細胞周期調(diào)節(jié)劑，在細胞周期有序進行中起關鍵作用，通過定時表達，結(jié)合、激活細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶2和增強底物親和力，在人類惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用[22]。She 等[23]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0062389 在NSCLC組織和細胞系中的表達上調(diào)，其高表達與晚期臨床特征和不良預后相關。Hsa_circ_0062389 敲減后，NSCLC 細胞的增殖受到抑制并停滯在G0/G1期，可作為miR-103a-3p 的內(nèi)源競爭性RNA 來促進肺癌中細胞周期蛋白E1 的表達，促進NSCLC 進展。

3 circRNA 在非小細胞肺癌順鉑耐藥中的作用與機制

3.1 circRNA 與ABC 轉(zhuǎn)運蛋白

ABC 轉(zhuǎn)運蛋白是一類重要的細胞表面蛋白，普遍存在于細胞膜上，負責不同配體的跨膜轉(zhuǎn)運，對維持細胞的正常功能至關重要[24]。目前已在人體發(fā)現(xiàn)49 種ABC 轉(zhuǎn)運蛋白，根據(jù)其基因組序列和組織結(jié)構(gòu)進一步分為7 個亞組（ABCA～ABCG）。在細胞水平上，ABC 家族的泵調(diào)節(jié)包括藥物在內(nèi)的多種物質(zhì)進出細胞的運輸，其過表達是導致各類腫瘤細胞毒性藥物外排增強和治療失敗的主要原因[25]。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白可分為內(nèi)向轉(zhuǎn)運蛋白和外向轉(zhuǎn)運蛋白[26]。目前發(fā)現(xiàn)的藥物外向轉(zhuǎn)運蛋白有P 糖蛋白、多藥耐藥蛋白-1、乳腺癌耐藥蛋白、囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)劑和磺酰脲受體[25]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，circ-SNAP47 可促進NSCLC 進展并提示預后不良[27]。Zou 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，circ-SNAP47 主要在細胞質(zhì)中表達，與NSCLC 細胞（A549、H1299）相比，DPP 耐藥細胞（A549/DDP、H1299/DDP）中circ-SNAP47 表達上調(diào)，其對RNase R 的降解具有高度抗性，可作為miR625-5p 海綿，而WEE1 是miR625-5p 的直接作用靶點。抑制circ-SNAP47 表達可抑制DPP 耐藥細胞的耐藥性，表達si-circ-SNAP47 的DDP 耐藥細胞中多藥耐藥相關標志物（包括MDR1 和MRP1）的蛋白表達持續(xù)降低。過表達miR-625-5p 可導致耐藥細胞中WEE1蛋白表達下調(diào)，并誘發(fā)化療敏感性，表明上調(diào)miR-625-5p 可抑制NSCLC 的DDP 耐藥性。值得注意的是，阻斷circ-SNAP47 可使miR-625-5p 上調(diào)，并下調(diào)WEE1 表達，而抑制 miR625-5p 可抵消circ-SNAP47 下調(diào)對WEE1 表達的影響。在裸鼠體內(nèi)實驗得到同樣的結(jié)果，因而推斷circ-SNAP47 可通過吸附miR625-5p 上調(diào)WEE1，進而促進DDP 耐藥。

Chu 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，circ_0058357 在DDP 耐藥的NSCLC 組織中高表達。使用siRNA 在體外抑制circ_0058357 表達，H1299/DDP 和A549/DDP 中周期相關的細胞周期蛋白D1、遷移相關的基質(zhì)金屬蛋白酶9 和MDR1 水平降低，DDP 耐藥的NSCLC 細胞生長、侵襲、遷移受到抑制，同時增加對DDP 細胞毒作用的敏感性和細胞凋亡。通過軟件預測circ_0058357 的靶基因為miR-361-3p。miR-361-3p在DDP 耐藥的NSCLC 組織中受到顯著抑制，而抑制circ_0058357 可提高其表達水平。miR-361-3p 通過與ABCC1 的3'UTR 結(jié)合抑制ABCC1 表達，影響H1299/DDP 和A549/DDP 對DDP 的敏感性。此外，circ_0058357 和ABCC1 具有共同的miR-361-3p 結(jié)合序列，circ_0058357 通過競爭性結(jié)合miR-361-3p 來調(diào)節(jié)ABCC1 的表達。由此推斷，circ_0058357 可通過靶向miR-361-3p/ABCC1 軸恢復H1299/DDP 和A549/DDP 對DDP 治療的敏感性。

研究發(fā)現(xiàn)，circ_PIP5K1A 可通過調(diào)節(jié)miRNA/mRNA 軸，包括miR-600/缺氧誘導因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）、miR-142-5p/胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1），促進NSCLC 的發(fā)生和發(fā)展[30,31]。Feng 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在DDP 耐藥的NSCLC 組織中circ_PIP5K1A 水平升高，其可通過miR-493-5p/ROCK1 軸調(diào)節(jié)體內(nèi)對DDP的敏感性。Shao 等[33]通過生物信息分析預測circ_PIP5K1A 的潛在靶基因為miR-101，后者的目標基因為ABCC1，并通過RNA pull-down 和雙熒光素酶報告試驗驗證了結(jié)果。敲減circ_PIP5K1A 可增加對DDP 的敏感性，加速細胞凋亡，而抑制miR-101逆轉(zhuǎn)上述作用。由此推斷，敲減circ_PIP5K1A 通過調(diào)節(jié)miR-101/ABCC1 軸抑制NSCLC 進展并增加DDP 敏感性。

Liang 等[34]發(fā)現(xiàn)，敲減circRNA_103615 可降低NSCLC 細胞（A549）對DDP 的耐藥性。值得注意的是，在circRNA_103615 敲減后，ABCB1 的表達顯著降低，ABCB1 的過表達可逆轉(zhuǎn)circRNA_103615敲減對NSCLC 耐藥的影響。因此推斷，circRNA_103615 可能通過調(diào)節(jié)ABCB1 表達作為NSCLC 的關鍵癌基因和潛在新型生物標志物。

3.2 circRNA 與糖酵解

惡性腫瘤的一個顯著特點是代謝異常。研究表明，糖酵解增強可促進腫瘤細胞耐藥[35]。Xu 等[36]發(fā)現(xiàn)circAKT3 在NSCLC 細胞中表達上調(diào)，敲減circAKT3 可提高NSCLC 細胞對DDP 的敏感性，并削弱 HIF-1α 依賴性糖酵解。CircAKT3 與 miR-516b-5p 的表達呈負相關，而與STAT3 的表達呈正相關，miR-516b-5p 抑制劑可逆轉(zhuǎn)circAKT3 敲減對肺癌細胞中HIF-1α 蛋白水平的抑制作用。肺癌組織中miR516b-5p 的表達水平與STAT3 呈負相關，STAT3可與miR-516b-5p 結(jié)合，實驗表明，miR-516b-5p 高表達明顯降低STAT3 水平，而pcDNA-STAT3 的重新引入在一定程度上可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。敲減circAKT3 可顯著抑制NSCLC 細胞中circSTAT 的mRNA 和蛋白表達，而過表達STAT3 可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。miR-516b-5p 過表達抑制肺癌細胞中葡萄糖的消耗和乳酸的生成，同時抑制HIF-1α 表達，但過表達STAT3 可逆轉(zhuǎn)這種抑制。從而推斷抑制circAKT可抑制HIF-1α 依賴的糖酵解誘導的A549/H1299 細胞耐藥。此外，Dong 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，circ_0076305可通過與miR-296-5p 結(jié)合來調(diào)節(jié)NSCLC 細胞的DDP 耐藥性。STAT3 是miR-296-5p 的直接靶點，可解除miR-296-5p 誘導的對DDP 耐藥的抑制作用。

3.3 circRNA 與氧化應激

Geng 等[38]發(fā)現(xiàn)，相對于正常肺細胞，circCCND1在NSCLC 細胞（A549/HCC827）中表達上調(diào)，其表達水平與生存時間、腫瘤分期有關。在DDP 治療下，敲除circCCND1 顯著抑制A549 和HCC827 的細胞活力及增殖能力，同時導致其凋亡增強，即敲除circCCND1 可增加NSCLC 細胞對DDP 的敏感性。運用軟件預測得出 circCCND1 的靶基因為miR-187-3p，后者的目標基因為FGF9。在A549 和HCC827 細胞中，circCCND1 與miR-187-3p 表達呈負相關。在DDP 處理下，敲減circCCND1 可使NSCLC 細胞（A549/HCC827）中谷胱甘肽水平和超氧化物歧化酶活性顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF9 可參與DDP 耐藥[39]。Geng 等[38]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF9 在A549 細胞中被miR-187-3p 模擬物下調(diào)，并被miR-187-3p 抑制劑上調(diào)。與DDP 處理下的sh-circCCND1-1 細胞相比，miR-187-3p 抑制劑增加A549 和HCC827 的細胞活力，并抑制其凋亡。從而推斷circCCND1 可作為miR-187-3p 海綿調(diào)節(jié)氧化應激和FGF9，進而增強NSCLC 對DDP 的耐藥性。

3.4 circRNA 與自噬

Li 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，circ_100565 在NSCLC 中上調(diào)，其高表達與NSCLC 患者較差的總生存呈正相關。circ_100565 的沉默可抑制體外NSCLC 細胞增殖、遷移和侵襲，并減少體內(nèi)NSCLC 的生長。Zhong等[41]進一步研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_100565 主要定位于細胞質(zhì)，具有良好的穩(wěn)定性，能抵抗放線菌素D 及RNase R 的作用。circRNA_100565 在NSCLC 耐藥組織和細胞系（A549/DDP 和H1299/DDP）中上調(diào)，其高表達與NSCLC 患者較短的總生存相關。運用軟件預測得出circRNA_100565 的潛在miRNA 靶點為 miR-377-3p，后者的目標基因為 ADAM28，circRNA_100565 可作為miR-337-3p 海綿并與其直接作用，負調(diào)控miR-337-3p 在NSCLC 細胞中的表達，miR-337-3p 靶向 ADAM28 并負調(diào)節(jié)其在NSCLC 細胞中的表達。沉默circRNA_100565 則A549/DDP 和H1299/DDP 細胞的增殖受到抑制，促進細胞凋亡。同時還發(fā)現(xiàn)敲減circRNA_100565 可抑制 NSCLC 中的耐藥細胞自噬。在體內(nèi)，circRNA_100565 基因下調(diào)促進DDP 對NSCLC 的抗腫瘤作用。Kong 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，與鄰近正常組織相比，hsa_circ_0085131 在NSCLC 組織中具有更高的表達水平，其高表達與NSCLC 復發(fā)和較低的生存率有關。hsa_circ_0085131 可促進NSCLC 細胞增殖，還能作為miR-654-5p 海綿調(diào)節(jié)ATG7 依賴的自噬途徑在NSCLC 中誘導DDP 耐藥。

3.5 circRNA 與缺氧

作為一個重要的腫瘤微環(huán)境因素，缺氧在腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移中具有重要作用[43]。缺氧可通過改變促存活基因表達來抑制細胞凋亡、使基因組不穩(wěn)定性、腫瘤新生血管形成、酪氨酸激酶受體下游信號通路增強和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等途徑影響腫瘤生物學[44,45]。研究表明，缺氧與藥物的化學耐藥性有關[46,47]。Yu 等[48]研究發(fā)現(xiàn)，circASXL1 在NSCLC 組織中上調(diào)。在缺氧條件下，增殖相關蛋白c-myc 和波形蛋白表達增加，E-鈣黏蛋白表達下調(diào)，A549 和H1299 細胞的遷移、侵襲能力和對DPP 的耐藥性增加，miR-206在NSCLC 細胞中表達下調(diào)，HIF-1α 蛋白表達顯著上調(diào)，而敲減circASXL1 后上述作用被逆轉(zhuǎn)，同時circASXL1 敲減誘導低氧暴露下的細胞凋亡。然而，circASXL1 敲減帶來的影響可通過miR-206 抑制劑逆轉(zhuǎn)。此外，沉默circASXL1 可通過海綿化miR-206抑制體內(nèi)腫瘤生長。由此推斷敲減circASXL1 可抑制DDP 耐藥性、細胞增殖、遷移和侵襲。

3.6 circRNA 與外泌體

程序性死亡蛋白配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）存在于外泌體中，circ-CPA4 可通過靶向let-7 miRNA 調(diào)節(jié)NSCLC 細胞來源的外泌體PD-L1 的表達[49]。與DDP 敏感細胞相比，經(jīng)NSCLC 細胞源性外泌體預處理的NSCLC 細胞對DDP 治療具有更強的耐受性，這種作用可通過與PD-L1 抗體共處理細胞消除。由此推斷，circ-CPA4可通過let-7 miRNA/PD-L1 軸調(diào)節(jié)NSCLC 細胞對DDP 的耐藥性。

4 總結(jié)與展望

近年來，NSCLC 的診斷和治療方法不斷發(fā)展，但DDP 仍然是治療NSCLC 的一線化療藥物，其耐藥的發(fā)生是影響治療療效的主要原因[11]。越來越多的研究表明，circRNA 在NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展和DDP 耐藥中發(fā)揮重要作用。隨著對NSCLC 耐藥研究的不斷深入，越來越多的耐藥機制被發(fā)現(xiàn)，然而目前尚無辦法阻止或逆轉(zhuǎn)DDP 耐藥。現(xiàn)階段，研究多聚焦于circRNA 與NSCLC 耐藥的關系，相信隨著研究的深入，circRNA 在NSCLC 耐藥中的分子機制和潛能將被認識，為逆轉(zhuǎn)DDP 耐藥提供新的思路。