基于基因表達(dá)譜的銀屑病自噬相關(guān)關(guān)鍵基因篩選和候選藥物預(yù)測(cè)*

郭宜城，羅美蘭，許時(shí)貴，李小蘭，付志媛

(1.江西省皮膚病專(zhuān)科醫(yī)院藥劑科，南昌 330001；2.江西省皮膚病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南昌 330001)

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，全球發(fā)病率為1%～3%[1-3]，容易反復(fù)發(fā)作，給患者帶來(lái)巨大困擾。銀屑病的致病原因尚未完全闡明，涉及遺傳學(xué)、免疫系統(tǒng)和環(huán)境暴露等因素，如白細(xì)胞介素17(IL-17)和IL-23認(rèn)為是疾病的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[4-5]，細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6等在功能上參與發(fā)病過(guò)程[6]。

自噬是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的進(jìn)化保守過(guò)程，是缺陷細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，以及某些老化蛋白質(zhì)的自我降解[7]。自噬與自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān)[8-10]，自噬相關(guān)基因(ARGs)死骨片1在銀屑病皮損區(qū)中表達(dá)顯著增強(qiáng)，激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白抑制自噬對(duì)IL-17a介導(dǎo)的銀屑病具有積極的治療作用[11]。

近年來(lái)，隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，基于測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析可高效地處理大量樣本數(shù)據(jù)，并提供疾病的有價(jià)值信息。WANG等[12]基于生物信息學(xué)方法得到趨化因子(C-X-C型)配體 9(CXCL9)、脯氨酸的小蛋白1B(SPRR1B)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶6(TGM6)和 S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)4個(gè)銀屑病進(jìn)展的關(guān)鍵基因，其中CXCL9對(duì)炎癥過(guò)程中具有關(guān)鍵作用的單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化作用[13]；SPRR1B被確定為牛皮癬的潛在生物標(biāo)志物[14]；TGM6則影響角質(zhì)形成細(xì)胞的分化[15]；S100A9因趨化、黏附和嗜中性粒細(xì)胞的脫粒作用在銀屑病炎性反應(yīng)的擴(kuò)增過(guò)程中發(fā)揮作用[16]。然而利用生物信息學(xué)分析銀屑病自噬相關(guān)關(guān)鍵基因(Hub)鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究選擇基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO數(shù)據(jù)庫(kù))中銀屑病的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析和驗(yàn)證，探討Hub和潛在治療藥物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄全球范圍研究機(jī)構(gòu)提交的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，是目前使用最廣泛的基因數(shù)據(jù)庫(kù)之一。通過(guò)GEOquery包從該數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE41662、GSE13355兩個(gè)數(shù)據(jù)集的表達(dá)譜，其中GSE41662作為分析數(shù)據(jù)集，GSE13355作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集，具體信息見(jiàn)表1。通過(guò)箱式圖查看樣本標(biāo)準(zhǔn)化的情況，通過(guò)主成分分析(PCA)圖查看樣本分組間聚類(lèi)情況。另外通過(guò)HAMdb數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hamdb.scbdd.com/home/index/)收集ARGs。

表1 數(shù)據(jù)集GSE41662、GSE13355具體信息

1.2 方法

1.2.1分析和篩選自噬相關(guān)差異表達(dá)基因(DEARGs)

使用R語(yǔ)言L(fǎng)imma包分析GSE41662數(shù)據(jù)集中皮損區(qū)和正常區(qū)皮膚組織樣本之間的差異表達(dá)基因(DEGs)，篩選條件：P≤0.05、|log2(FC)|>1，采用R語(yǔ)言ggplot2包繪制火山圖。運(yùn)用DrawVennDiagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be)工具對(duì)DEGs、ARGs作韋恩圖取交集得到DEARGs，并通過(guò)Complex Heatmap包繪制熱圖。

1.2.2基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)信號(hào)通路富集分析

采用ClusterProfiler包和ggplot2包對(duì)DEARGs進(jìn)行GO生物過(guò)程和KEGG通路富集分析及結(jié)果可視化，均以P<0.05作為分析標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及Hub分析

STRIN數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)之一，收錄超過(guò)14 000個(gè)物種、200多億個(gè)相互作用，通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建DEARGs的PPI，篩選條件為combined score>0.4，刪除游離點(diǎn)，隨后將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.72軟件，利用 MCODE算法插件篩選DEARGs最顯著模塊，條件為MCODE score>5，degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100，k score=2，得到Hub。

1.2.4Hub驗(yàn)證

采用GSE13355作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集，分析Hub表達(dá)水平。此外，采用受試者工作特征(ROC)曲線(xiàn)評(píng)估Hub與銀屑病的相關(guān)性。

1.2.5藥物分子預(yù)測(cè)

DGIdb數(shù)據(jù)庫(kù)(www.DGIdb.org/)是一個(gè)包含了NCBI Entrez、DrugBank、PharmGKB等臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)及PubMed已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)等30個(gè)來(lái)源的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)搜索DGIdb數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能逆轉(zhuǎn)異常表達(dá)Hub的潛在治療藥物，并構(gòu)建藥物-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。采用DGIdb數(shù)據(jù)庫(kù)分析可能與血管緊張素Ⅱ受體1(AGTR1)、過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、瘦素(LEP)、脂聯(lián)素(ADIPOQ)、煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)、IL6相互作用的藥物，過(guò)濾條件選擇Approved(已批準(zhǔn))。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs的獲取

共篩選出1 428個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因647個(gè)(45.3%)，下調(diào)基因781個(gè)(54.7%)，樣本標(biāo)準(zhǔn)化情況箱式圖見(jiàn)圖1A。數(shù)據(jù)集中于皮損區(qū)和正常區(qū)能顯著分離。見(jiàn)圖1B。差異分析結(jié)果可靠。結(jié)果的火山圖見(jiàn)圖1C。

A：樣本標(biāo)準(zhǔn)化情況箱式圖；B：GSE41662數(shù)據(jù)集PCA分析；C：DEGs火山圖，紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào)。

2.2 DEARGs篩選

將獲得的DEGs與收集到的797個(gè)ARGs取交集得到39個(gè)DEARGs，其中上、下調(diào)基因分別為23個(gè)(59.0%)和16個(gè)(41.0%)。見(jiàn)圖2A。表達(dá)熱圖和箱式圖見(jiàn)圖2B～D。DEARGs差異表達(dá)見(jiàn)表2。

表2 DEARGs差異表達(dá)

A:DEGs、ARGs韋恩圖；B:DEARGs表達(dá)熱圖;C、D:DEARGs在樣本中的表達(dá)差異箱式圖。

2.3 富集分析

DEARGs主要參與炎性反應(yīng)調(diào)控、細(xì)胞因子分泌調(diào)節(jié)、自噬調(diào)控，以及IL-8與IL-17的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程；主要細(xì)胞成分位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、濃縮染色體及紡錘絲微管；主要分子功能為受體激活劑活性、絲氨酸/蘇氨酸酶活性、細(xì)胞因子活性及脂肪酸結(jié)合等相關(guān)。見(jiàn)圖3A。DEARGs主要參與腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、脂肪細(xì)胞因子、NOD樣受體、胰島素抵抗等通路。見(jiàn)圖3B。

A：GO功能富集分析結(jié)果氣泡圖；B：KEGG通路富集分析圓圈圖。

2.4 PPI構(gòu)建及Hub篩選

運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建DEARGs的PPI，其由27個(gè)節(jié)點(diǎn)和46條邊組成。見(jiàn)圖4A。通過(guò)Cytoscape的MCODE插件篩選出最顯著模塊得到Hub，分別是AGTR1、PPARG、LEP、ADIPOQ、NAMPT和IL-6。見(jiàn)圖4B。

A：構(gòu)建 DEARGs的PPI；B：MCODE篩選出最顯著的模塊。

2.5 Hub驗(yàn)證

Hub在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集皮損區(qū)與正常區(qū)皮膚樣本的表達(dá)水平顯示,PPARGC1B、NAMPT、IL6在皮損區(qū)樣本中的表達(dá)量明顯高于正常區(qū)皮膚樣本，表明基因PPARGC1B、NAMPT、IL6可能在銀屑病發(fā)病過(guò)程中具有促進(jìn)作用；而AGTR1、LEP、ADIPOQ在皮損區(qū)樣本中的表達(dá)量明顯低于正常區(qū)皮膚樣本，表明AGTR1、LEP、ADIPOQ可能具有抑制銀屑病進(jìn)展的作用。見(jiàn)圖5A。AGTR1、PPARG、LEP、ADIPOQ、NAMPT、IL6的ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.946、0.961、0.810、0.763、0.995、0.887，見(jiàn)圖5B，與表達(dá)水平分析結(jié)果一致。表明Hub在銀屑病疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了作用。

A：Hub在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE13355皮損區(qū)和正常區(qū)皮膚組織樣本的表達(dá)差異；B：6個(gè)Hub的ROC曲線(xiàn)。

2.6 藥物-基因相互作用

包括環(huán)孢素、阿達(dá)木單抗、利妥昔單抗、異環(huán)磷酰胺在內(nèi)的77種藥物與Hub存在相互作用，NAMPT未找到匹配的潛在治療藥物。見(jiàn)圖6。

紅色圓圈代表基因，藍(lán)色方形代表藥物。

3 討 論

目前，僅有少量研究探索了銀屑病與ARGs的關(guān)系。目前研究證實(shí)，自噬相關(guān)16樣蛋白1缺失會(huì)誘發(fā)細(xì)胞死亡、組織損傷和炎癥，其多態(tài)性與銀屑病相關(guān)[17]。抑制自噬可刺激角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生自主的細(xì)胞增殖抑制[18]。在這項(xiàng)研究中選擇了基于GPL570平臺(tái)的數(shù)據(jù)集GSE41662對(duì)24例銀屑病患者的皮膚組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出39個(gè)DEARGs，并構(gòu)建PPI得到6個(gè)Hub，基于GSE13355數(shù)據(jù)集和ROC曲線(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果均提示這些基因通過(guò)自噬通路參與了銀屑病的疾病進(jìn)展，最后預(yù)測(cè)出77個(gè)潛在的治療藥物。

在分析得到的Hub中AGTR1可作為介導(dǎo)自噬效應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子[19]，已證實(shí)可通過(guò)干擾銀屑病患者表皮細(xì)胞自噬、介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖抑制發(fā)揮緩解病癥的作用[20]。PPARG是脂肪細(xì)胞脂肪酸沉積的關(guān)鍵因子[21]，其干預(yù)飽和脂肪酸代謝而改善脂代謝紊亂可對(duì)銀屑病皮損改善具有積極作用，與本研究結(jié)果一致，有研究發(fā)現(xiàn)，LEP在進(jìn)展期銀屑病患者中表達(dá)顯著增高[22]，可能與LEP 的T1型細(xì)胞因子釋放促進(jìn)及Th2型細(xì)胞因子抑制對(duì)銀屑病的免疫病理過(guò)程有關(guān)，其直接相關(guān)性需進(jìn)一步證明。ADIPOQ具有炎癥及促炎細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-8的雙重抑制作用，同時(shí)增加抗炎細(xì)胞因子的分泌，可能對(duì)銀屑病的炎癥狀態(tài)具有極大的改善作用[23-24]。NAMPT介導(dǎo)的 NAD+代謝促進(jìn)了銀屑病皮膚中Th1/Th17 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的過(guò)度增殖和終末分化損害進(jìn)而加快了銀屑病的進(jìn)程[25]，抑制其表達(dá)能否控制疾病尚需深入研究。IL-6被認(rèn)為是銀屑病炎癥活性的標(biāo)志物[26]，參與了TNF-α、IL-23、IL-17信號(hào)通路的銀屑病易感性位點(diǎn)，同時(shí)還與遺傳易感性和對(duì)TNF-α抑制劑的反應(yīng)有關(guān)[27]。另外，有研究表明，IL-6介導(dǎo)的慢性炎癥狀態(tài)可拮抗自噬[28]，表明IL-6是通過(guò)多途徑影響銀屑病的進(jìn)展。本研究中部分Hub已有相應(yīng)的銀屑病基礎(chǔ)研究成果支持，說(shuō)明本研究預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，同時(shí)NAMPT、ADIPOQ的表達(dá)或功能在銀屑病基礎(chǔ)研究中未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，提示NAMPT、ADIPOQ可能為銀屑病的診治提供新的研究思路。

本研究富集分析結(jié)果顯示，DEARGs與炎性反應(yīng)、細(xì)胞因子、自噬、IL等多種免疫反應(yīng)相關(guān)的功能活化有關(guān)，與銀屑病是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥性皮膚病這一共識(shí)一致，同時(shí)也表明自噬在銀屑病發(fā)病過(guò)程中的重要作用。KEEG富集分析提示，DEARGs涉及單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)、脂肪細(xì)胞因子、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體、胰島素抵抗等通路，其中AMPK是自噬生理過(guò)程中的關(guān)鍵位點(diǎn)，該位點(diǎn)激活后通過(guò)促使結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2和mTOR調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mTORC1)復(fù)合物下調(diào)和促進(jìn)Unc-51樣激酶1(ULK1)磷酸化的雙重作用激活自噬過(guò)程[29]。脂肪細(xì)胞因子、NOD樣受體、胰島素抵抗等通路均涉及代謝功能方面的調(diào)節(jié)，通常銀屑病與其他代謝性疾病合并發(fā)生，目前研究表明，銀屑病嚴(yán)重程度評(píng)分與高密度脂蛋白膽固醇外流能力呈負(fù)相關(guān)，高密度脂蛋白膽固醇外流能力與銀屑病患者冠狀動(dòng)脈疾病負(fù)擔(dān)直接相關(guān)[30]。

干預(yù)銀屑病自噬的潛在藥物預(yù)測(cè)中，阿達(dá)木單抗特異性地與 TNF-α 結(jié)合并阻斷其與細(xì)胞表面TNF受體p55、p75的相互作用而發(fā)揮治療作用。一項(xiàng)阿達(dá)木單抗治療銀屑病的臨床試驗(yàn)中，研究組71%患者皮損狀態(tài)得以改善,而安慰劑組僅為7%[31]。環(huán)孢素影響干擾素γ和IL-2等炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞DNA的合成與增殖用于銀屑病的治療[32]。異環(huán)磷酰胺抑制T淋巴細(xì)胞增殖和干擾素γ產(chǎn)生而改善銀屑病皮損狀況和炎性反應(yīng)[33]。氯沙坦降低血管緊張素受體Ⅰ(AT1R)和 IL-17a表達(dá)，減輕咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)的銀屑病模型小鼠的紅斑、鱗屑及真皮T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[34]。但篩選的潛在藥物中有一些是尚未被文獻(xiàn)報(bào)道具有逆轉(zhuǎn)銀屑病的功能，其治療銀屑病的可能性尚需更進(jìn)一步的論證。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法取得了預(yù)期研究結(jié)果，然而仍存在一定的局限：(1)樣本中患者與對(duì)照者在年齡分布方面存在的差異導(dǎo)致結(jié)果無(wú)法區(qū)分不同年齡患者自噬水平的差異；(2)本研究分析數(shù)據(jù)均取自于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和樣本量的有限性可能會(huì)造成研究結(jié)果的偏差，需要在后續(xù)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)踐中加以驗(yàn)證。

總之，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)分析了銀屑病自噬相關(guān)的Hub，并預(yù)測(cè)了涉及的信號(hào)通路及與Hub存在相互作用的潛在治療藥物，為研究銀屑病的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供了新的思考。