提高發(fā)酵貓爪草多糖產量的菌種篩選

劉 濤，王 瑞，陳富生

(信陽農林學院，河南 信陽 464000)

0 引言

貓爪草原為無名野草，藥用歷史較短，是20世紀50 年代于河南省信陽地區(qū)發(fā)現的一種草藥，后經信陽中醫(yī)院依據其根形及能治療鼠瘡的特點定名為貓爪草。貓爪草味甘、辛，性平，具有解毒、化痰、消腫的功效。臨床上用于治療淋巴結結核、肺結核、骨結核、咽炎、瘧疾和癌腫。河南省信陽地區(qū)是貓爪草的優(yōu)勢產區(qū)，其多糖含量優(yōu)于其他產區(qū)。多糖具有的調節(jié)免疫作用，在養(yǎng)殖業(yè)替抗禁抗的大背景下，具有良好的開發(fā)前景。

據不完全統(tǒng)計，我國人藥與獸藥市場上，每年多糖的需求量在百萬至千萬噸以上。多糖資源的90%是從生藥中提取[1]，但是中藥藥材多糖的成分含量有限，常規(guī)提取法得率也較低。由于微生物在代謝過程中能產生多種酶，使由纖維素、半纖維素等構成的細胞壁發(fā)生裂解，從而促進中藥有效成分的釋放，甚至產生新的活性物質，引起中藥藥性、藥效等發(fā)生改變。菌種是中藥微生物轉化的關鍵和基礎，目前中藥微生物轉化大部分是采用單一菌種進行發(fā)酵轉化[2]。本試驗通過比較糞鏈球菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌4種益生菌對貓爪草發(fā)酵后的總多糖含量，為后期開發(fā)益生菌發(fā)酵中藥工藝提供依據。

1 材料

貓爪草(信陽淮濱中藥材市場，3年生中藥材)；糞鏈球菌(南京牧豐生物科技有限公司)，枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌 (河南君安生物科技有限公司)。試劑：無水葡萄糖標準品、甘露糖標準品、乙醇、硫酸、蒽酮、蒸餾水、葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉。

2 方法

2.1 貓爪草發(fā)酵工藝

發(fā)酵劑的制備： 0.5 g菌種溶于30 mL培養(yǎng)液(含2%葡萄糖，1%蛋白胨和0.5%氯化鈉)，37℃下培養(yǎng)6～8 h。發(fā)酵：將發(fā)酵劑倒入裝有中藥的密封袋，充分攪拌均勻，密封后，37℃恒溫培養(yǎng)5～7 d。100 g中藥(中藥用60～80目粉碎)對應0.5 g菌種。

2.2 水分、浸出物含量的測定

水分測定:稱取過2號篩的發(fā)酵貓爪草藥材粉末2 g，放置在干燥為恒重的稱量瓶中，打開稱量瓶蓋后，在100℃～105℃下干燥5 h，后蓋緊瓶蓋轉移至干燥器中冷卻30 min，精密稱定，放至烘干箱中在100℃～105℃下干燥1 h，干燥器中冷卻30 min后稱重，干燥至2次稱重的誤差以不超過5 mg為準。然后根據樣品中損失的重量，計算樣品中的水分含量。

冷浸法：稱取過2號篩的發(fā)酵貓爪草藥材粉末4 g，精密稱定后放置于250～300 mL的錐形瓶中，加入蒸餾水100 mL，塞緊瓶蓋，振搖6 min后靜置18 h，用濾紙過濾，取濾液20 mL，放置在干燥為恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，放于烘干箱中在105℃下干燥3 h，取出后移至干燥器中冷卻30 min，精密稱重。除另有規(guī)定外，以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量。

熱浸法：稱取過2號篩的發(fā)酵貓爪草藥材粉末4 g，精密稱定后放置于250～300 mL的錐形瓶中，加入蒸餾水100 mL，塞緊瓶蓋后稱重，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰后保持微沸1 h。冷卻后取下錐形瓶，擰緊瓶塞，稱重，用蒸餾水補足損失的重量，搖勻后用濾紙過濾，精密量取濾液25 mL，放置在干燥為恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于烘干箱在105℃下干燥3 h后轉移至干燥器中，冷卻30 min稱重。除另有規(guī)定外，以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量[3]。

2.3 多糖含量測定方法

葡萄糖、甘露糖對照品溶液的配制：精密稱取葡萄糖標準品、甘露糖標準品各10 mg，加適量水溶解后定容至100 mL(即為每1 mL含0.1 mg)。0.2%蒽酮-濃硫酸溶液的配制：精密稱取蒽酮試劑0.2 g，用適量濃硫酸溶解后定容至100 mL(現用現配)。

繪制標準曲線：分別精密吸取葡萄糖和甘露糖對照品溶液各5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL于50 mL容量瓶，加入蒸餾水定容至50 mL；再精密加入0.2%蒽酮-濃硫酸溶液各4 mL，混勻；顯色60 min后于485 nm處測葡萄糖吸光度A，于285 nm處測甘露糖吸光度A[4]。以吸光度A為縱坐標，葡萄糖溶液和甘露糖溶液的濃度C(mg/mL)為橫坐標。

制備供試品溶液：將發(fā)酵好的貓爪草藥材于60℃干燥，精密稱取10 g，加水回流提取(100 mL×2次)，2 h/次，趁熱過濾，濾液合并，于60℃濃縮至約20 mL，加乙醇至含乙醇量為85%，密閉靜置24 h，使用抽濾機抽濾，濾餅用80%乙醇洗滌2次，60℃水浴揮發(fā)盡乙醇，殘留物用適量水于60℃水浴溶解，以5 000 r/min離心10 min，取上清液定容至50 mL，搖勻后即得供試品溶液。

精密量取供試品溶液0.1 mL，加蒽酮-濃硫酸溶液定容至50 mL，同法測定吸光度，依據標準曲線計算出樣品溶液中多糖的含量。同法測定貓爪草原藥中多糖含量。

式中，C—葡萄糖質量濃度(mg/mL)；D—樣品稀釋倍數；V1—提取液總體積(mL)；V2—取樣體積(mL)；M—樣品質量(mg)。

3 結果與分析

3.1 貓爪草的水分、浸出物含量測定結果

4種益生菌發(fā)酵貓爪草的水分、浸出物含量測定結果如表1所示。由此可知，與冷浸法相比熱浸法測得水溶性浸出物含量較高。

表1 四種益生菌發(fā)酵貓爪草的水分、浸出物含量測定結果 單位：%

3.2 貓爪草多糖測定結果

將所得吸光度值A對葡萄糖濃度C進行最小二乘法回歸，得到葡萄糖的標準曲線回歸方程為：A=0.171 1C-0.105 7，R2=0.999 8(線性范圍為20～100 μg)；將所得吸光度值A對甘露糖濃度C進行最小二乘法回歸，得甘露糖的標準曲線回歸方程為：A=0.005 1C+0.005 5，R2=0.997 3(線性范圍為0.01～0.05 mg)，如表2、表3所示。葡萄糖在0.02～0.1 mg/mL濃度范圍內，吸光度與濃度呈現良好的線性關系；甘露糖在0.01～0.05 mg/mL濃度范圍內，吸光度與濃度呈現良好的線性關系，如圖1、圖2所示。

表2 葡萄糖線性相關性結果

表3 甘露糖線性相關性結果

圖1 葡萄糖標準曲線 圖2 甘露糖標準曲線

多糖測定結果見表4。結果表明與貓爪草原藥多糖含量相比，由4種益生菌發(fā)酵后的貓爪草多糖含量均有提高，最高的是酵母菌組，為9.06%，其次是乳酸菌組，為8.63%。

表4 多糖測定結果 單位：%

4 討論與分析

本實驗對4種益生菌發(fā)酵后的貓爪草多糖的測定結果進行比較，通過最大吸收波長掃描，建立了紫外分光法測定葡萄糖和甘露糖的方法。結果表明酵母菌發(fā)酵后的貓爪草多糖產量最高，為9.06%；乳酸菌發(fā)酵后的貓爪草多糖含量次之，為8.63%。說明酵母菌和乳酸菌作為發(fā)酵菌種可使貓爪草多糖的提取率得到提高，表明酵母菌和乳酸菌發(fā)酵后的貓爪草多糖產量優(yōu)于糞鏈球菌和枯草芽孢桿菌。

酵母菌和乳酸菌作為典型的糖菌，喜在含糖較高、酸性的環(huán)境中生長，貓爪草中富含糖分，可以作為酵母菌天然的營養(yǎng)體系。多糖含量的升高推測為酵母菌和乳酸菌代謝酶對于纖維素的降解，使多糖提取率增加。葡萄糖為發(fā)酵的最佳碳源，蛋白胨為最佳氮源，隨著在培養(yǎng)基中的濃度不同，對中藥發(fā)酵的影響相異較大。水提醇沉法是利用多糖具有溶解于水而不溶于醇類的特性來提取多糖的，但是多糖類物質又具有醇醚不溶性，如果溶液中的醇醚類物質過量就會使糖類物質沉淀析出。因此，乙醇加入量對發(fā)酵液中多糖提取產量的影響最大，其次是醇沉時間，醇沉時間過長或過短，對多糖提取的影響也較大。