慢性血栓栓塞性肺動脈高壓的動物模型制備方法與特點

陳曦，王明宇，孫曉琳，安克江·安尼瓦爾，朱治萩，楊蘇喬

肺動脈高壓共分為五大類，其中慢性血栓栓塞性肺動脈高壓（chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH）屬于第四大類，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前公認(rèn)的CTEPH的主要發(fā)病原因是急性肺栓塞未得到及時診治或反復(fù)發(fā)生血栓栓塞后，血栓無法完全溶解，逐漸機(jī)化，阻塞肺血管床，導(dǎo)致肺血管重塑，在血栓機(jī)械性阻塞的基礎(chǔ)上加重血流動力學(xué)異常，產(chǎn)生肺動脈高壓［1］。近年來，隨著人們對急性肺栓塞的重視程度不斷提高，CTEPH的檢出率也隨之提高。國外急性肺栓塞患者CTEPH的發(fā)病率為0.45%～6.20%［2］，我國急性肺栓塞患者2年后CTEPH累積發(fā)病率約為1.3%［3］。然而，急性肺栓塞并不是CTEPH發(fā)生發(fā)展的唯一原因，CTEPH還與凝血和纖溶機(jī)制異常、炎癥、遺傳易感因素、血管新生及原位血栓形成等多種因素密切相關(guān)［4］，但其具體分子機(jī)制尚不明確。由于CTEPH患者疾病負(fù)擔(dān)較重，未經(jīng)治療的患者預(yù)后極差，因此需要對其發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制進(jìn)行深入探索。動物模型的建立可以有效推動CTEPH發(fā)病機(jī)制的研究，為疾病早期預(yù)警和個體化防治提供研究基礎(chǔ)。本文旨在綜述CTEPH動物模型研究進(jìn)展，為探討CTEPH的發(fā)病機(jī)制、早期預(yù)警及個體化治療提供依據(jù)。

1 CTEPH的動物模型種類概述

理想的CTEPH動物模型一般具有以下特點：（1）血栓持續(xù)存在并機(jī)化，產(chǎn)生慢性肺動脈阻塞；（2）非阻塞部位肺血管病變、右心室重構(gòu)、肺動脈高壓持續(xù)存在［5］；（3）動物血管清晰、實驗操作方便；（4）經(jīng)濟(jì)且可重復(fù)。目前較為成熟的CTEPH模型選用的動物類型包括羊、豬、犬、兔、嚙齒類動物（大鼠、小鼠）。不同的動物由于其基因構(gòu)成、生理結(jié)構(gòu)和生活習(xí)性等方面不同而各具特點，適用于不同類型的實驗。

大體型動物如羊、豬、犬等操作方便，麻醉、呼吸易控制，術(shù)中機(jī)械通氣在呼吸頻率、潮氣量、氧濃度的選擇上較中小體型動物容易掌控。同時大體型動物的解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，適合進(jìn)行血流動力學(xué)、影像學(xué)、解剖學(xué)以及手術(shù)治療的實驗研究。如使用陶瓷念珠輸入法建立豬、犬的CTEPH模型，經(jīng)動物頸靜脈置管，反復(fù)多次注入陶瓷念珠，可造成其外周肺動脈的物理性栓塞，可用于CTEPH影像學(xué)診斷技術(shù)和病理生理特點的研究［6］。然而，此類方法所需要的實驗動物和手術(shù)材料的獲得成本較高，術(shù)后護(hù)理難度較大，不宜廣泛開展。

中體型動物的研究顯示，可以通過向犬、兔等動物的頸靜脈注入自體血栓來誘導(dǎo)CTEPH的發(fā)生［7-8］。但犬類性情兇猛，價格較高；兔類喜活動，與CTEPH患者運(yùn)動不耐受的實際情況相違背，均不能得到有效推廣和應(yīng)用。

以鼠類為主要代表的嚙齒類動物被視為“標(biāo)準(zhǔn)實驗動物”，其先天遺傳性狀、后天繁育條件、微生物攜帶狀況、營養(yǎng)需求及環(huán)境因素等方面均可受到全面控制，能保證實驗結(jié)果的可靠性、精確性、均一性、可重復(fù)性和可比性［9］。盡管其體型較小、血管壁薄、對實驗技術(shù)操作的要求較高，但由于其遺傳背景明確、模型性狀顯著且穩(wěn)定、質(zhì)量和規(guī)格可在一定程度上自由選擇、相應(yīng)的檢測試劑全面、價格合理，是目前最理想的動物模型種類。并且，由于鼠類品種和基因的多樣性，其能夠模擬不同病種和患病程度［10］，在CTEPH動物模型的構(gòu)建中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

2 CTEPH嚙齒類動物模型的制備方法與特點

制備CTEPH嚙齒類動物模型的方法有很多，主要制作原理為模擬靜脈血栓形成后，反復(fù)多次栓塞于肺動脈導(dǎo)致CTEPH發(fā)生，主要方法包括栓子注入法和血管結(jié)扎法。

2.1 自體血栓注入法 LI等［11］使用自體血栓注入法成功制備CTEPH大鼠模型，其2周內(nèi)向大鼠頸靜脈注射自體血栓2次，并使用氨甲環(huán)酸抑制纖溶。然而這種造模方法穩(wěn)定性較差，且動物模型表現(xiàn)出的病情嚴(yán)重程度與人體差異較大［12］。隨著炎癥機(jī)制如葡萄球菌感染、起搏器感染、腦室-心房分流術(shù)、慢性骨髓炎、炎癥性腸病等逐漸被證實與CTEPH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］，研究者們開始嘗試模擬炎癥環(huán)境以增加動物模型的肺動脈壓。WU等［14］以8周齡雄性SD大鼠為材料，分別在第1、4、11天將其用水合氯醛麻醉后，向其左頸靜脈注射自體血栓，并使用氨甲環(huán)酸抑制纖溶；同時，向一部分大鼠體內(nèi)注射卡拉膠以維持無菌炎癥細(xì)胞環(huán)境，在炎癥機(jī)制的參與下使肺動脈壓進(jìn)一步升高；此外，向所有大鼠體內(nèi)注入青霉素以預(yù)防感染；結(jié)果表明，單純注入自體血栓的CTEPH模型大鼠的平均肺動脈壓〔（25.51±1.13）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）〕明顯高于對照組大鼠〔（15.92±1.13）mm Hg〕，而注射自體血栓聯(lián)合卡拉膠的大鼠平均肺動脈壓更高〔（29.82±1.26）mm Hg〕；解剖后發(fā)現(xiàn)，注射自體血栓聯(lián)合卡拉膠的大鼠病理特點更加典型，血管壁增厚、血管重塑與內(nèi)膜增生更明顯，且出現(xiàn)了洋蔥皮樣增生，也更符合人體實際情況。這一動物模型制作簡便、利于維護(hù)、特征典型，還可以通過計算血管內(nèi)沉積的血栓數(shù)量來量化肺栓塞的嚴(yán)重程度，適合用于研究各類細(xì)胞因子、炎性遞質(zhì)等在CTEPH病理生理過程中發(fā)揮的作用。

自體血栓注入法在小鼠中同樣得到了成功應(yīng)用?？娙降龋?5］在戊巴比妥鈉麻醉的小鼠頸外靜脈注入自體白色血栓使其發(fā)生栓塞，首次注入血栓后分別于1、2、3周進(jìn)行自體血栓重復(fù)輸注，注入血栓35～40個/次，全程使用氨甲環(huán)酸防止血栓自溶，并應(yīng)用慶大霉素防止感染；6周后小鼠右心室收縮壓明顯升高，右心室肥大指數(shù)明顯增加；形態(tài)學(xué)上也發(fā)生了CTEPH的典型改變，即血管中膜平滑肌層增厚，平滑肌細(xì)胞增殖，管腔明顯縮小，部分管腔近乎閉合；肺中可見肺間質(zhì)增厚，炎性細(xì)胞明顯浸潤，部分遠(yuǎn)端肺動脈中發(fā)現(xiàn)大量紅細(xì)胞聚集；栓塞較多部位可見肺泡融合或膨脹不全，肺泡壁充血、水腫；造模成功率可達(dá)50%，小鼠死亡主要是由于自體血栓過大或過多，堵塞主肺動脈，導(dǎo)致右心室負(fù)荷過重。如果將這種造模方法推廣至基礎(chǔ)研究中，在注入的血栓大小和數(shù)量及維持血栓和血流動力學(xué)穩(wěn)定等方面仍有一定的優(yōu)化空間。

2.2 體外栓子注入法 由于嚙齒類動物體型較小，構(gòu)建大體型動物模型時應(yīng)用的葡聚糖凝膠G50和陶瓷念珠等體外栓子并不適用。ARIAS-LOZA等［16］使用了有纖維蛋白膠原涂層的聚苯乙烯微球以確保栓子表面與血管內(nèi)壁更好地黏附，此法成功模擬了肺栓塞亞急性期背景下的肺動脈高壓，若要模擬CTEPH動物模型則需要更長的觀察時間。NETO-NEVES等［17］向大鼠頸靜脈注射聚苯乙烯微球，同時注射SU5416以抑制血管內(nèi)皮生長因子受體，連續(xù)觀察6周發(fā)現(xiàn)大鼠肺動脈壓持續(xù)升高，并伴有右心室肥大、功能障礙以及運(yùn)動耐量下降，符合CTEPH的臨床表現(xiàn)。這一實驗也佐證了栓塞后血管生成減少對CTEPH發(fā)病存在影響，但使用聚苯乙烯等材料制成的微球無法溶解，不能完全模擬CTEPH的發(fā)病機(jī)制，而新型有機(jī)材料的發(fā)現(xiàn)使這一問題有了改進(jìn)。KARPOV等［18］4 d內(nèi)向大鼠靜脈內(nèi)共注射8次可溶性海藻酸鈉微球，持續(xù)觀察18周，發(fā)現(xiàn)大鼠肺動脈壓穩(wěn)定增加、運(yùn)動耐量下降、內(nèi)皮功能發(fā)生障礙，并發(fā)生了形態(tài)學(xué)上的變化；該方法造模成功率為56%，動物死亡主要是由于無法耐受栓子而發(fā)生了缺血性腦卒中或急性心力衰竭。該模型避免使用了氨甲環(huán)酸，降低了纖溶抑制劑對實驗的影響，同時模擬了無菌炎癥環(huán)境下CTEPH的病理生理變化，此法可以嘗試應(yīng)用于CTEPH病理生理機(jī)制，尤其是針對血流動力學(xué)效應(yīng)方面的研究。

2.3 左肺動脈結(jié)扎法 YUN等［19］通過結(jié)扎大鼠左肺動脈以引起肺血管重構(gòu)和持續(xù)收縮，從而模擬嚴(yán)重CTEPH患者的動物模型，結(jié)果顯示，在術(shù)后第2周和第5周時實驗組右心室收縮壓與D-二聚體水平明顯高于對照組，且實驗組大鼠出現(xiàn)了右心室肥厚與遠(yuǎn)端肺血管重塑。此法盡管成功再現(xiàn)了CTEPH患者血管張力的變化，但是沒有模擬臨床病理過程中出現(xiàn)的內(nèi)皮功能障礙與無菌性炎癥環(huán)境等［20］，若要在臨床研究中使用還需在造模過程中結(jié)合其他方法以提高模型擬合程度。

2.4 下腔靜脈結(jié)扎法 近年來，下腔靜脈結(jié)扎法被視為最能反映深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）病理生理過程的小鼠造模方法［21］，但這種方法制備的DVT模型僅能發(fā)生輕微的肺動脈內(nèi)皮功能障礙。BRANDT等［22］結(jié)扎了雄性C57BL/6小鼠的下腔靜脈與左腎靜脈，保留了所有側(cè)支，成功制備了小鼠DVT模型，在此基礎(chǔ)上經(jīng)小鼠眼眶后靜脈竇每間隔15 min注射凝血酶166 U/kg，共3次，誘導(dǎo)其發(fā)生非致命性伴血流動力學(xué)改變的肺栓塞，通過高頻超聲和超聲心動圖觀察小鼠的血管情況，成功觀察到右心室結(jié)構(gòu)和功能障礙、左心室受壓以及肺動脈加速時間的縮短；將小鼠解剖后發(fā)現(xiàn)其肺動脈內(nèi)可見血栓栓塞、肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖/肥大等病理特征。這一造模方法已逐漸應(yīng)用于CTEPH的基礎(chǔ)研究［23］，但由于不同動物的纖溶抗性不同，這一造模方法尚未在其他類型動物上構(gòu)建成功。FREY等［24］在切除小鼠脾臟后結(jié)扎其腎靜脈下方的下腔靜脈，28 d后，實驗組小鼠血栓消融明顯延遲。雖然沒有直接模擬肺栓塞的病理過程，但其提供了一種新的造模思路來研究特定臨床條件下的CTEPH發(fā)病過程。

3 小結(jié)及展望

綜上所述，目前在建立CTEPH動物模型時，每種實驗方法均存在一定的局限性。CTEPH模型應(yīng)具有肺動脈壓持續(xù)升高、血栓形成和栓塞引起血管床穩(wěn)定下降的雙重特點。根據(jù)現(xiàn)有證據(jù)，目前還沒有一種最優(yōu)的方法來模擬CTEPH模型，且具體模型和動物種類的選擇應(yīng)根據(jù)研究目標(biāo)確定。在今后的研究中，可以嘗試在下腔靜脈結(jié)扎法的基礎(chǔ)上，結(jié)合血栓注入法中誘導(dǎo)與維持血栓的技巧，如使用氨甲環(huán)酸抑制纖溶、改變小鼠體位以促進(jìn)其血栓形成［11］、注射卡拉膠以維持慢性炎癥狀態(tài)等方法，以期建立更符合人體臨床及病理特點的CTEPH動物模型，為探索CTEPH的發(fā)病機(jī)制及個體化防治策略提供基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：陳曦進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計撰寫，及修訂論文；陳曦、王明宇、孫曉琳、安克江·安尼瓦爾、朱治萩進(jìn)行文獻(xiàn)/資料收集、整理；楊蘇喬進(jìn)行文章的可行性分析，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。