牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管內(nèi)礦化組織形成的研究進(jìn)展

高碧聰，呂柯佳 ，沈晨露，葉偉佳 ，胡 文，姚 華

年輕恒牙是指剛萌出到口腔，形態(tài)、結(jié)構(gòu)尚未完全成熟的恒牙。年輕恒牙在發(fā)育過程中常因齲病或外傷等因素導(dǎo)致牙髓感染或壞死，進(jìn)而出現(xiàn)根尖發(fā)育停止的現(xiàn)象。喇叭口樣寬大的根尖若用常規(guī)根管治療的方式直接充填，易引發(fā)超充、充填不密、根折等問題。牙髓血運(yùn)重建術(shù)(dental pulp revascularization)多以血凝塊為支架，誘導(dǎo)年輕恒牙的殘余牙髓細(xì)胞、根尖周干細(xì)胞在根管壁表面形成礦化組織，起到增厚根管壁、封閉根尖孔的作用。早在上個(gè)世紀(jì)60年代，就有學(xué)者提出利用根管內(nèi)血凝塊修復(fù)根管組織的策略[1]。2001年，Iwaya等首次提出牙髓血運(yùn)重建術(shù)這一概念，通過滅菌藥物灌洗代替機(jī)械清潔根管，保留年輕恒牙根尖存活牙髓以促進(jìn)根管內(nèi)組織再生[2]。2004年，Banchs等正式制定牙髓血運(yùn)重建技術(shù)操作流程[3]，后人不斷對其加以修改與完善，2013年美國牙髓病協(xié)會(American Association of Endodontics，AAE)發(fā)布了完整的牙髓血運(yùn)重建術(shù)的操作指南。

早期的臨床研究通過X線片驗(yàn)證了牙髓血運(yùn)重建術(shù)后部分患牙可出現(xiàn)牙根增長、根管壁增厚的現(xiàn)象。最初，學(xué)者們推測根管內(nèi)新形成的硬組織來源于根尖區(qū)殘留的未感染牙髓組織[2]，Herwig′s上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath, HERS)細(xì)胞和根尖周干細(xì)胞也可能與牙髓血運(yùn)重建術(shù)后牙根形成有關(guān)[4-5]。隨著組織學(xué)和免疫組化技術(shù)的應(yīng)用，動物實(shí)驗(yàn)顯示牙髓血運(yùn)重建術(shù)后大多數(shù)根管的根尖部分被新形成的礦化組織不嚴(yán)密填充，礦化組織內(nèi)可見含有血管與成纖維細(xì)胞的活性結(jié)締組織[6-7]。2015年，第1例來自人類年輕恒牙的牙髓血運(yùn)重建術(shù)的研究顯示，術(shù)后根管內(nèi)礦化組織為牙骨質(zhì)樣或骨樣組織，而未見牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)[8]。牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管內(nèi)礦化組織的質(zhì)量和數(shù)量與其預(yù)后效果密切相關(guān)。本文將對近年來牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管內(nèi)礦化組織相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，就其可能機(jī)制及影響因素進(jìn)行探討，并提出可促進(jìn)牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管壁礦化組織形成的策略。

1 牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管內(nèi)礦化組織的形態(tài)和種類

牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管內(nèi)礦化組織形態(tài)多樣，Song等將其大致分為鈣化屏障(calcific barrier，CB)和根管閉塞(canal obliteration，CO)兩大類，認(rèn)為觀察時(shí)點(diǎn)不同是造成觀察到根管內(nèi)礦化組織形態(tài)不同的原因，根管內(nèi)礦化物質(zhì)在前期形成鈣化屏障或散在鈣化，隨著礦化組織不斷沉積，最終表現(xiàn)為完全閉塞，但并未有足夠長期的觀察實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一點(diǎn)，也并未有相關(guān)文獻(xiàn)明確表述各種礦化組織形成的準(zhǔn)確時(shí)間。根管內(nèi)新生礦化組織根據(jù)形成機(jī)制可分為修復(fù)性牙本質(zhì)、類牙骨質(zhì)組織、類骨組織、根尖周硬組織長入等，其形成機(jī)制與其形態(tài)有一定關(guān)聯(lián)。

1.1 修復(fù)性牙本質(zhì)

年輕恒牙的根尖孔寬大，即使根尖周感染也可能留存活髓組織。因此，牙髓血運(yùn)重建術(shù)時(shí)常避免對根管進(jìn)行機(jī)械預(yù)備，以盡量保留根尖的活髓組織。動物實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)根尖存在1～4 mm無感染牙髓時(shí)，牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體可再生[9]。新形成的牙本質(zhì)小管結(jié)構(gòu)排列紊亂，呈現(xiàn)出修復(fù)性牙本質(zhì)特征[10-11]。Herwig′s上皮根鞘細(xì)胞存活時(shí)能促進(jìn)牙根發(fā)育，但易受炎癥影響。在HERS細(xì)胞與根尖乳頭受損傷程度較小的情況下，根部的成牙本質(zhì)細(xì)胞可形成根牙本質(zhì)，牙根能繼續(xù)增長。

1.2 類牙骨質(zhì)組織

張映娟等對犬無髓年輕恒牙的牙髓血運(yùn)重建術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，牙骨質(zhì)在其根管外表面沉積，延續(xù)生長到牙根內(nèi)表面，稱之為根管內(nèi)牙骨質(zhì)(in-canal cementum, IC)。術(shù)后3個(gè)月所有患牙內(nèi)壁均出現(xiàn)牙骨質(zhì)樣硬組織沉積，根管壁增厚及牙根長度增加[12]。除根尖周的牙骨質(zhì)可直接長入根管之外，當(dāng)用K銼刺破根尖周組織，將血引入根管內(nèi)時(shí)，根尖周組織內(nèi)的干細(xì)胞，可分化為類牙骨質(zhì)細(xì)胞，形成沉積于根管內(nèi)壁表面的類牙骨質(zhì)組織，稱為牙本質(zhì)相連礦化組織(dentin-associated mineralized tissue, DAMT)[13-14]。DAMT為類牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)但膠原幼稚結(jié)構(gòu)無序，基質(zhì)內(nèi)幾乎無細(xì)胞。根中部牙本質(zhì)表面的DAMT與牙本質(zhì)壁之間結(jié)合不是特別緊密，可見部分分離，但在某些牙本質(zhì)脫礦區(qū)域可見膠原纖維將兩者緊密相連。隨著時(shí)間的推移，DAMT會持續(xù)沉積直到完全封閉根管[15]。在長期根尖周感染的狀況下，根尖乳頭無法存活，HERS細(xì)胞在后期改變其形態(tài)，向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，分化為類成牙骨質(zhì)細(xì)胞，此時(shí)牙根長度的增加與牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)沉積有關(guān)[16]。

1.3 類骨組織

根管中血凝塊內(nèi)的干細(xì)胞分化為類成骨細(xì)胞時(shí)，會形成類骨組織，這些類骨組織未與根管內(nèi)壁接觸，稱為骨島(bony island, BI)。BI為類牙槽骨結(jié)構(gòu)，基質(zhì)內(nèi)含大量細(xì)胞、血管、骨髓樣組織但缺乏骨單位，有免疫組化分析顯示，BI表達(dá)破骨細(xì)胞特征性酶——抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)，提示BI除沉積外還同時(shí)發(fā)生骨改建。Lei等對人年輕恒牙的組織學(xué)研究顯示，類骨組織與類成骨細(xì)胞形成的礦化組織島可出現(xiàn)在根管中段[8]。BI與DAMT間存在一定關(guān)聯(lián)，BI與牙本質(zhì)壁不接觸，與DAMT之間由疏松結(jié)締組織連接，在某些區(qū)域也呈現(xiàn)出緊密絞索連接，但BI與DAMT是否最終會完全融合尚需要更多長期實(shí)驗(yàn)證實(shí)。牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管內(nèi)的主要礦化組織為類牙骨質(zhì)組織與類骨組織，提示術(shù)后根管內(nèi)微環(huán)境更有利于牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化增殖[17]。

1.4 根尖周硬組織直接長入

當(dāng)根尖孔無法正常閉合時(shí)，根尖區(qū)可產(chǎn)生形態(tài)不規(guī)則被結(jié)締組織包裹的鈣化團(tuán)塊，內(nèi)嵌針狀牙本質(zhì)、較多的成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞，阻礙根尖孔的閉合[13,15]。長入根管內(nèi)的結(jié)締組織發(fā)生改建或牙槽骨與根管內(nèi)硬組織之間形成連接時(shí)，根管內(nèi)外硬組織出現(xiàn)相連[18]。

2 影響牙髓血運(yùn)重建術(shù)后礦化組織形成的因素

2.1 根管內(nèi)是否有牙髓再生

根管內(nèi)是否存在能發(fā)揮生理功能的牙髓決定了新生礦化組織的性質(zhì)，牙髓的原位再生并恢復(fù)其生理功能，是牙髓血運(yùn)重建最理想的結(jié)果。早期研究者在術(shù)后觀察到患牙牙髓活力測試陽性[19-20]，但僅以此推測牙髓再生的成功并不嚴(yán)謹(jǐn)。引起牙髓電活力測試陽性的其他可能原因是：①殘余活力牙髓；②干細(xì)胞如牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)、牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化為神經(jīng)元細(xì)胞[8]。只使用X線片與牙髓電活力測試難以評價(jià)牙髓血運(yùn)重建術(shù)后的礦化組織是否為牙本質(zhì)以及是否有牙髓再生。目前，有學(xué)者在活性生物材料與干細(xì)胞方面研究，致力于創(chuàng)造適宜微環(huán)境促使干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞定向分化，并有實(shí)驗(yàn)觀察到牙髓樣結(jié)締組織形成，但其結(jié)構(gòu)與功能尚待進(jìn)一步研究[21-22]。

2.2 根管感染程度

根管感染嚴(yán)重程度會影響根管內(nèi)礦化組織沉積性質(zhì)和形態(tài)。根管內(nèi)感染消除不徹底的患牙，根管內(nèi)炎性細(xì)胞常與新生牙骨質(zhì)樣組織并存，壞死細(xì)胞殘片與牙本質(zhì)碎片嵌入其中，周圍包繞新生結(jié)締組織[23]。另外，與無感染組相比，感染組新生牙骨質(zhì)的量更少[12]。Stambolsky等對犬牙的組織學(xué)研究表明當(dāng)感染極嚴(yán)重或極輕微時(shí)，形成礦化物的概率較低[24]。嚴(yán)重感染可能會影響根尖周干細(xì)胞生存的微環(huán)境，同時(shí)影響引血后血凝塊發(fā)揮正常支架作用，造成血運(yùn)重建的失??；當(dāng)使用高濃度抗生素對根管進(jìn)行化學(xué)清理，會同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致礦化組織形成減少。牙髓血運(yùn)重建術(shù)的臨床病例顯示，失敗病例多與持續(xù)感染相關(guān)[25]。劉彩霞等報(bào)道了10例年輕恒牙牙髓血運(yùn)重建術(shù)后病例，所有患牙都有不同程度根管壁的增厚，但有部分感染較重的根尖周炎患牙根尖孔未閉合[10]。

2.3 根管內(nèi)生物支架

2.3.1 血凝塊 根管內(nèi)血凝塊通常來源于根尖周組織，在牙髓血運(yùn)重建中起到重要作用：第一，血凝塊內(nèi)的膠原起到支架作用，可為干細(xì)胞的增殖分化提供空間。第二，血凝塊的引入更容易將根尖周細(xì)胞帶入根管，作為成牙骨質(zhì)細(xì)胞與成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞來源。第三，血凝塊中的血小板存儲和分泌活性生長因子、多種細(xì)胞黏附分子，均有利于根管內(nèi)礦化組織沉積。

2.3.2 血制品支架 富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)，是自體全血經(jīng)離心后得到的血小板濃縮物，可形成三維纖維網(wǎng)絡(luò)，比普通血凝塊富含更高濃度生長因子，是一種高效的支架。Alagl等研究顯示使用PRP支架可顯著增加根長[26]。近年來還有第3代血小板濃縮制品，濃縮生長因子纖維蛋白(concentrated growth factors, CGF)，以CGF產(chǎn)品作為干細(xì)胞增殖和分化的支架，有利于提高牙髓再生的成功率[27]。

2.3.3 人工合成支架 隨著應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域生物材料的飛速發(fā)展，各種人工合成材料，如納米纖維、纖維蛋白凝膠也被用于牙髓血運(yùn)重建術(shù)研究中。人造交聯(lián)膠原支架使用純化的Ⅰ型膠原，形成不可溶的膠原網(wǎng)絡(luò)，提供穩(wěn)定的微環(huán)境，更有利于干細(xì)胞的黏附和生長。有實(shí)驗(yàn)表明，使用交聯(lián)膠原支架比僅使用血凝塊能更顯著提高根管內(nèi)礦化組織沉積程度。商品化膠原蛋白膜的使用可促進(jìn)患牙根中1/3的牙本質(zhì)壁的發(fā)育[28]。

磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)是一種具有生物學(xué)活性的新型非陶瓷型羥基磷灰石類人工骨材料，具有“骨引導(dǎo)性”和可降解性，且封閉根尖完全，抗菌抑菌效果好，炎癥下仍可誘導(dǎo)根尖孔閉合[29]。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)和人成骨細(xì)胞(human osteoblast, HOB)共培養(yǎng)方法成功地在CPC+RGD序列(由精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸組成)上生成了微毛細(xì)管樣網(wǎng)絡(luò)[30]。新型膠原蛋白-羥基磷灰石支架的使用誘導(dǎo)新礦化組織形成，在原牙本質(zhì)表面形成類牙骨質(zhì)組織[31]。這類磷酸鈣支架常以礦化物質(zhì)充滿根管從而提高牙根機(jī)械強(qiáng)度為最終目標(biāo)。

2.3.4 與干細(xì)胞結(jié)合支架 牙髓血運(yùn)重建術(shù)的成功與否離不開干細(xì)胞、生長因子、支架這三大要素[32]。眾多研究致力于再生具有形成牙本質(zhì)功能的牙髓組織，常用干細(xì)胞有人脫落乳牙干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、PDLSCs、DPSCs、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)等。有學(xué)者將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)與納米生物玻璃涂層牙本質(zhì)于裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)，觀察到牙本質(zhì)表面的細(xì)胞黏附和牙源性分化[33]。目前認(rèn)為干細(xì)胞參與組織的再生與修復(fù)；生長因子促進(jìn)干細(xì)胞的增殖與分化；支架作為一種三維結(jié)構(gòu)的支持物，可供干細(xì)胞的黏附，并為其增殖和分化提供非常有利的環(huán)境。干細(xì)胞微環(huán)境中的生物分子，例如TGF-β、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、Nfic(nuclear factor I C)、WNT通路信號傳導(dǎo)分子、抗菌肽LL-37、血管緊張素Ⅱ等都可以影響干細(xì)胞的分化方向[34-36]，Zarei等對犬牙進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用蜂膠誘導(dǎo)VEGF和Ⅷ因子，新生硬組織由牙骨質(zhì)樣組織和其他礦化組織構(gòu)成[37]。有學(xué)者用外源性牙本質(zhì)制備牙本質(zhì)基質(zhì)支架，為牙髓干細(xì)胞提供具有生物活性的細(xì)胞外基質(zhì)，動物實(shí)驗(yàn)顯示修復(fù)性牙本質(zhì)再生[38]。有學(xué)者指出，單獨(dú)使用PRP支架與引血產(chǎn)生血凝塊的患牙在根長與根管直徑的變化方面無明顯差異，但PRP支架與干細(xì)胞結(jié)合使用后結(jié)果令人滿意[39]。Zhu等[40]將高生長因子支架PRP與牙髓干細(xì)胞結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了軟組織和硬組織的形成增加，Chai等觀察到人牙髓干細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞并形成修復(fù)性牙本質(zhì)[41]，但Torabinejad等的類似實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)牙根內(nèi)吸收、根尖周肉芽腫等病態(tài)變化[9]。另外有學(xué)者稱支架和生長因子對牙根發(fā)育和根尖周愈合方面沒有明顯作用[42]，因此對干細(xì)胞結(jié)合生物支架的機(jī)制及精確調(diào)控仍需進(jìn)一步研究。

3 促進(jìn)牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管內(nèi)礦化組織形成的臨床決策

AAE給出了牙髓血運(yùn)重建術(shù)的三級結(jié)局指標(biāo)，第一級為消除癥狀并有骨愈合，第二級為根部厚度和/根部長度的增加，第三級為活力測試陽性[43]。臨床操作前后的診療決策將影響牙髓血運(yùn)重建術(shù)術(shù)后根管內(nèi)礦化組織的形成。

第一，對根管內(nèi)礦化組織性質(zhì)的預(yù)期。根管內(nèi)礦化組織的性質(zhì)與數(shù)量與預(yù)后息息相關(guān)，最理想的結(jié)果是形成修復(fù)性牙本質(zhì)，最不理想的則是根尖周硬組織直接通過開放的根尖孔與根管內(nèi)硬組織相通。由于牙髓組織再生的技術(shù)尚不成熟，目前根管內(nèi)礦化組織為類牙骨質(zhì)組織的情況能滿足AAE的第一級和第二級指標(biāo)，并獲得較好的預(yù)后[44]。有文獻(xiàn)指出，根管內(nèi)形成類牙骨質(zhì)礦化組織的預(yù)后優(yōu)于類骨礦化組織[45]，即DAMT有序形成的預(yù)后優(yōu)于BI。無法完全封閉的根尖常與BI并存[46]，BI的存在可能是牙髓血運(yùn)重建失敗率較根尖誘導(dǎo)成形術(shù)更高的原因之一[44]。對牙本質(zhì)進(jìn)行一定的脫礦處理，例如增加乙二胺四乙酸(EDTA)沖洗步驟，可使牙本質(zhì)表面形成毛發(fā)狀突起結(jié)構(gòu)，使DAMT與牙本質(zhì)間形成鎖結(jié)連接形式，可促進(jìn)DAMT的生成并提高新礦化組織與原根管的附著強(qiáng)度。

第二，術(shù)中可采用一些措施來減少根管感染，提高礦化組織形成的量和質(zhì)量。①使用適宜濃度的三聯(lián)抗生素溶液(環(huán)丙沙星、甲硝唑和米諾環(huán)素)。新近研究顯示，除了對根管系統(tǒng)進(jìn)行消毒外，環(huán)丙沙星和甲硝唑的組合還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可能有助于根尖愈合[47]。②優(yōu)化沖洗方案。有研究顯示，濃度為6%的高濃度次氯酸鈉溶液比1.5%濃度更有利于促進(jìn)牙根增長[48]。輔以17%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液或納米氣泡增強(qiáng)型抗菌劑等，進(jìn)一步去除牙本質(zhì)玷污層，提高抗菌效果[49]。③使用人工支架可減少感染。相比形成血凝塊的病例，使用PRP等人造支架發(fā)生根尖周炎癥比例更低，且出現(xiàn)根管完全鈣化的可能性也明顯降低[50-52]。④選擇性能更佳的蓋髓劑。蓋髓劑密封滅菌效果與術(shù)后根管炎癥相關(guān)，有文獻(xiàn)指出，iRoot BP比廣泛使用的傳統(tǒng)蓋髓劑礦物三氧化物凝聚體(mineral trioxide aggregate, MTA)更適宜于炎癥酸性環(huán)境，可提高牙本質(zhì)表面牙骨質(zhì)樣沉積率，從而提高血運(yùn)重建成功率[53]。有文獻(xiàn)報(bào)道，iRoot BP Plus和MTA可對BMMSCs的成骨或成牙分化方向產(chǎn)生影響，鈣離子與硅離子含量更高的iRoot BP Plus將誘導(dǎo)更多礦化組織的形成[54]。

第三，術(shù)后是否干預(yù)。當(dāng)牙髓血運(yùn)重建實(shí)現(xiàn)第一級或第二級目標(biāo)后，有兩種方案可供選擇。①在不出現(xiàn)癥狀的情況下不加干預(yù)，直至根管完全鈣化。根管內(nèi)礦物的沉積速度難以預(yù)測，眾多因素可導(dǎo)致根管內(nèi)鈣化的不均勻，甚至完全鈣化。目前尚無確切證據(jù)顯示牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管鈣化會影響根尖周炎愈合和根長發(fā)育，且鈣化根管的疏通難度大，因此，無癥狀時(shí)不建議干預(yù)[55-56]。②隨訪觀察，在合適的時(shí)機(jī)進(jìn)行常規(guī)根管治療，用牙膠尖充填，但充填時(shí)機(jī)尚未取得共識。這一策略有其合理性。某些維度根管看似封閉，其實(shí)根尖部分區(qū)域仍是開放的[46]。利用部分封閉的根尖完成根管治療，可避免未完全封閉的根尖帶來根尖周感染風(fēng)險(xiǎn)。但新生礦化組織與牙本質(zhì)壁的結(jié)合強(qiáng)度有待進(jìn)一步檢驗(yàn)，常規(guī)根管治療可能影響這種結(jié)合，反而破壞已經(jīng)封閉的根尖區(qū)域，最終造成治療的失敗。對根管充填的時(shí)機(jī)及提升牙髓血運(yùn)重建術(shù)療效的方法還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，牙髓血運(yùn)重建術(shù)可提高部分牙髓或根尖感染年輕恒牙的治療效果，術(shù)中可通過控制根管感染，人為控制支架、干細(xì)胞、局部微環(huán)境等方式促進(jìn)牙髓血運(yùn)重建術(shù)后根管內(nèi)礦化組織的有序形成，但仍需要大量研究和臨床隨訪觀察對相關(guān)因素加以驗(yàn)證，提高遠(yuǎn)期療效。