間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶蛋白在兒童外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤中的表達(dá)及意義

陳 干 樊金星 黃 慧 徐 錦 楊文萍 陶 強(qiáng)

外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤(peripheral neuroblastic tumours，pNT)是兒童常見(jiàn)的顱外實(shí)體瘤，其異質(zhì)性強(qiáng)，從自發(fā)性消退、分化成熟到轉(zhuǎn)移死亡，在不同年齡、不同臨床分期的病例間預(yù)后差異較大[1]。國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤危險(xiǎn)因素分組(International Neuroblastoma Risk Group，INRG)中的年齡、臨床分期、組織學(xué)類(lèi)型、腫瘤細(xì)胞的分化程度、N-MYC基因狀態(tài)、11q及DNA指數(shù)是目前主要的預(yù)后評(píng)估參數(shù)，間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶蛋白(ALK)及基因異常在pNT中的意義未達(dá)成共識(shí)[2]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同年齡段的兒童pNT進(jìn)行ALK蛋白和N-MYC基因檢測(cè)，探討ALK蛋白檢測(cè)的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集江西省兒童醫(yī)院病理科2010年1月至2020年6月存檔的外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤94例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2017年發(fā)表的《外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤病理診斷共識(shí)》[3]，共46例臨床資料完整和診斷明確的病例納入研究。46例pNT中男性24例,女性22例；平均年齡24個(gè)月(年齡0.3～144個(gè)月)，其中≤18個(gè)月28例(新生兒NB 15例)，>18個(gè)月18例；送檢部位腎上腺12例、腎上腺外(包括頸部、縱隔、盆腹腔、骶尾部、腰部和大腿)34例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期各23例。15例新生兒NB中男孩6例、女孩9例，均為產(chǎn)前診斷或生后28天內(nèi)在家發(fā)現(xiàn)包塊，或因眼瞼下垂、發(fā)熱、嘔吐、納差及健康體檢而發(fā)現(xiàn)包塊；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期11例,Ⅲ～Ⅳ期4例。

1.2 方法

將蠟塊組織做成組織芯片，連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化染色或N-MYC基因檢測(cè)。所用抗體ALK(克隆號(hào)：5A4，陽(yáng)性部位：胞質(zhì)/胞核)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。具體操作步驟按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。N-MYC基因購(gòu)自廣州安必平科技有限公司，判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[3]。應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法比較臨床病理參數(shù)與ALK蛋白表達(dá)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)分類(lèi)及國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤病理分類(lèi)

46例pNT中，神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)40例、節(jié)細(xì)胞性神經(jīng)母細(xì)胞瘤(GNB)6例。40例NB中分化差型38例、未分化型和分化型各1例，其中預(yù)后良好型(FH型27例)、預(yù)后差型(UH型13例)。6例GNB中結(jié)節(jié)型1例(UH)，混雜型5例(均為FH)。15例新生兒NB均為分化差型，其中FH型14例、UH型1例。

2.2 免疫表型和熒光原位雜交

ALK在NB和GNB中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為55%(22/40)和0(0/6)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)。40例NB中N-MYC基因擴(kuò)增陽(yáng)性4例、獲得7例，6例GNB均無(wú)N-MYC基因擴(kuò)增和獲得；4例N-MYC基因擴(kuò)增陽(yáng)性者均表達(dá)ALK蛋白，7例N-MYC基因獲得者5例表達(dá)ALK蛋白。15例新生兒NB中ALK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為40%(6/15)(Ⅰ期和Ⅲ期各2例、Ⅱ期和Ⅳ期各1例)，100%(15/15)N-MYC基因擴(kuò)增陰性。ALK蛋白在Ⅲ～Ⅳ期、UH型和N-MYC基因異常中表達(dá)率高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018、0.001、0.010)，在不同性別、年齡和部位間無(wú)差異表達(dá)(P=0.382、0.400、0.617)。

3 討論

根據(jù)組織形態(tài)學(xué)外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤(peripheral neuroblastic tumours，pNT)分為神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)、節(jié)細(xì)胞性神經(jīng)母細(xì)胞瘤(GNB)結(jié)節(jié)型和混雜型、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤。在大多數(shù)家族性NB和大約10%的散發(fā)性NB中存在間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因異常，包括點(diǎn)突變和擴(kuò)增或獲得[2,4]。ALK蛋白的表達(dá)與ALK基因多拷貝(包括擴(kuò)增或獲得)相關(guān)，但與ALK基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化無(wú)明顯相關(guān)性，作者同時(shí)發(fā)現(xiàn)ALK蛋白表達(dá)和基因異常與NB的分化狀態(tài)無(wú)關(guān)[5]。根據(jù)國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤病理分類(lèi)(Shimada系統(tǒng))，將pNT分為預(yù)后良好型(FH型)和預(yù)后差型(UH型)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在FH型中ALK蛋白表達(dá)率(31.25%，10/32)明顯比UH型(85.71%，12/14)低，具有顯著差異(P=0.001)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALK在NB中的表達(dá)率比GNB高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)。這些數(shù)據(jù)間接證實(shí)ALK蛋白表達(dá)與pNT預(yù)后差有關(guān)。

在NB中，ALK蛋白的表達(dá)與年齡的關(guān)系報(bào)道不一。王娟等[7]報(bào)道ALK的表達(dá)與年齡有關(guān)，年齡>1.5歲的患兒比年齡≤1.5歲患兒高(32.7% VS 6.7%)，而Chang等[6]報(bào)道與年齡無(wú)關(guān)(>1.5歲為47.2%，≤1.5歲為32%)。本實(shí)驗(yàn)≤1.5歲為42.9%(12/28)，>1.5歲為55.6%(10/18)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在新生兒NB中ALK陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)40%(6/15)，因此，ALK在不同年齡段(尤其是新生兒期)的表達(dá)意義及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。臨床分期是影響NB的預(yù)后因素，進(jìn)展期(Ⅲ～Ⅳ期)存在ALK高表達(dá)[6]，尤其與臨床分期為III期患者預(yù)后密切相關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)顯示，Ⅲ～Ⅳ期NB患者存在更高的ALK陽(yáng)性表達(dá)率(P=0.018)，3例化療后死亡的非新生兒NB患者均為ALK蛋白陽(yáng)性表達(dá)，臨床分期為III期或Ⅳ期。由于可隨訪(fǎng)的數(shù)據(jù)較少，今后積累更多病例進(jìn)一步研究ALK在不同臨床分期中的表達(dá)意義。

文獻(xiàn)報(bào)道[8]，ALK基因異常只是一個(gè)加速器，需要與其他基因異常共同促進(jìn)NB的發(fā)生發(fā)展。Chang等[6]的研究表明，大多數(shù)ALK蛋白高表達(dá)者同時(shí)存在N-MYC蛋白高表達(dá)，而與N-MYC基因是否擴(kuò)增無(wú)關(guān)，而N-MYC蛋白高表達(dá)與N-MYC基因擴(kuò)增有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALK蛋白在N-MYC基因異常(包括擴(kuò)增和獲得)中的表達(dá)率明顯高于N-MYC基因擴(kuò)增陰性者(P=0.010)，這是否說(shuō)明除了N-MYC基因擴(kuò)增外，我們也要關(guān)注一下N-MYC基因獲得的病例。 根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，ALK蛋白高表達(dá)與進(jìn)展期或高危NB密切相關(guān)，部分原因可能是與N-MYC基因擴(kuò)增或N-MYC蛋白高表達(dá)產(chǎn)生的協(xié)同作用。此假設(shè)需要更大樣本量前瞻性研究或細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于早期或低危NB患者中ALK蛋白的表達(dá)意義及機(jī)制有待積累更多病例進(jìn)行研究。