肝纖維化治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證

沈鎮(zhèn)揚(yáng) 陸倫根

各種病因引起的慢性肝損傷已造成全球健康負(fù)擔(dān)，每年導(dǎo)致近200萬人死亡[1]。肝纖維化作為慢性肝損傷期間所觸發(fā)的一系列傷口愈合表現(xiàn)，其特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的廣泛積累，從而破壞了正常的肝臟結(jié)構(gòu)[2]。未經(jīng)任何治療的慢性肝損傷和ECM過度積累可能導(dǎo)致肝臟瘢痕形成，并最終發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[3]。經(jīng)過數(shù)十年基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化和臨床研究的發(fā)展，人們已經(jīng)對肝纖維化的發(fā)病機(jī)制以及其對終末期肝病的影響有了很多的認(rèn)識。但是迄今為止，由于缺乏精確的治療靶點(diǎn)和良好的靶點(diǎn)驗(yàn)證方法，成功治療肝纖維化比任何人預(yù)期的都要困難，且尚未有抗肝纖維化藥物得到批準(zhǔn)。因此，迫切需要探索更多準(zhǔn)確可靠的治療靶點(diǎn)以及靶點(diǎn)驗(yàn)證方法，以期獲得更好的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

一、抗肝纖維化靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)

(一)基于分子的已知功能識別靶點(diǎn) 作為目前最經(jīng)典的靶點(diǎn)識別方法，其根據(jù)已知分子的生物學(xué)功能以及其拮抗或激動劑來確定該分子是否影響肝纖維化的發(fā)生。為了識別潛在的肝纖維化相關(guān)分子，需要對公共數(shù)據(jù)庫以及從動物和人體組織、細(xì)胞中提取的潛在靶標(biāo)基因和蛋白數(shù)據(jù)集進(jìn)行全面而細(xì)致的分析。值得注意的是，近年來流行的單細(xì)胞測序分析能夠構(gòu)建纖維化肝臟全面而詳細(xì)的細(xì)胞異質(zhì)性圖譜，闡明不同肝臟疾病中肝星狀細(xì)胞(HSCs)的亞型分類，這對我們確定肝纖維化候選靶點(diǎn)的有效性以及減少肝臟靶向治療過程中出現(xiàn)的意外脫靶效應(yīng)具有重大意義[4-6]。此外，這些龐大而復(fù)雜的數(shù)據(jù)集還需要強(qiáng)大的生物信息學(xué)技術(shù)來提煉相關(guān)信息，以便根據(jù)其表達(dá)、定位以及特定生物學(xué)功能偏好快速識別潛在靶點(diǎn)。

(二)新興的高通量靶點(diǎn)篩選 除了上述提及的“假設(shè)驅(qū)動”方法，還有不假設(shè)分子在肝纖維化中作用的靶點(diǎn)篩選方法。這種方法主要通過應(yīng)用特定的基因干擾操作，如CRISPR篩選，以確定其能否抑制HSCs活化所需的關(guān)鍵通路或介質(zhì)。盡管該方法主要用于揭示癌癥靶點(diǎn)，但也可用于探索體內(nèi)和分離細(xì)胞的纖維化相關(guān)靶點(diǎn)[7-8]。此外，通過整合空間基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及轉(zhuǎn)座酶及染色質(zhì)測序(ATAC-seq)等技術(shù)可以進(jìn)一步無偏倚地發(fā)現(xiàn)潛在靶點(diǎn)。這些技術(shù)還可通過機(jī)器學(xué)習(xí)方法進(jìn)一步加強(qiáng)，以細(xì)化靶點(diǎn)識別和驗(yàn)證，并提高臨床成功的可能性[9]。

(三)現(xiàn)有藥物的再利用 藥物再利用已在許多疾病中得到驗(yàn)證，通過對現(xiàn)有藥物的可能作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，篩選出一批現(xiàn)有藥物，并觀察它們在體外實(shí)驗(yàn)中逆轉(zhuǎn)疾病基因特征的能力，從而確定具有潛在有效，但初始適應(yīng)證與肝纖維化無關(guān)的候選藥物[10]。例如，索拉非尼是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，可阻斷腫瘤細(xì)胞中生長因子信號傳導(dǎo)，其也被證實(shí)可能通過限制肝損傷誘導(dǎo)的基質(zhì)和血管生成來改善肝纖維化[11]。

(四)特定基因變異與疾病的關(guān)聯(lián)研究 潛在的靶點(diǎn)可能出現(xiàn)在無偏倚的全基因組關(guān)聯(lián)研究中，這些研究將特定的基因變異與疾病聯(lián)系起來。例如，含Patatin樣磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)基因的多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，該基因不僅影響肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝，還能起到增強(qiáng)HSCs活化的作用[12]。由于基因組變異通常在以前未知的基因中發(fā)現(xiàn)，這些方法可揭示該變異的生物學(xué)途徑。通過增加保護(hù)性變異或拮抗致病變異，得到這種類型基因組信息演變而來的治療方法。例如，先前研究發(fā)現(xiàn)，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因的一種變體能夠預(yù)防冠狀動脈疾病，后續(xù)在治療上通過拮抗PCSK9發(fā)揮降脂作用也取得了較大成功[13]。同樣，通過改變PNPLA3的功能，也可以作為基于疾病相關(guān)變體的NASH治療策略。

(五)抗纖維化靶點(diǎn)的重要特征 盡管目前在活化的HSCs上表達(dá)的纖維化靶點(diǎn)沒有單一的理想特征，但應(yīng)具備以下一些重要特征：(1)目標(biāo)易于接近。除了直接作用于細(xì)胞表面受體，將細(xì)胞內(nèi)有效成分傳遞至HSCs的方法也在不斷發(fā)展。例如，維生素A偶聯(lián)脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)向HSCs內(nèi)傳遞小干擾RNA(siRNA)的功能[14]。(2)靶點(diǎn)的抑制或改變不影響正常HSCs和肝功能。比較有前景的策略是靶向那些僅在活化的HSCs上表達(dá)的分子，從而最大限度減少對正常HSCs穩(wěn)態(tài)功能的影響。例如，血小板衍生生長因子受體β(β-PDGF)受體在肝臟損傷過程中被顯著誘導(dǎo)且僅在活化的HSCs上表達(dá)[15]。(3)靶點(diǎn)在受損肝臟中表達(dá)最強(qiáng)或選擇性最強(qiáng)。盡管沒有HSCs絕對特異的靶點(diǎn)，但仍可通過查詢基因表達(dá)數(shù)據(jù)集來確定候選靶點(diǎn)在正常肝臟和其他組織中的表達(dá)水平，從而將脫靶效應(yīng)降到最低。

二、抗肝纖維化靶點(diǎn)的驗(yàn)證

(一)抗肝纖維化靶點(diǎn)的驗(yàn)證模型 在進(jìn)行臨床試驗(yàn)之前，抗肝纖維化靶點(diǎn)的驗(yàn)證一般要經(jīng)歷從細(xì)胞、嚙齒動物到非人靈長類動物，從簡單的系統(tǒng)到復(fù)雜的系統(tǒng)驗(yàn)證的過程。對于旨在減弱HSCs活化的分子而言，若其在體外的表達(dá)與體內(nèi)表達(dá)相似，那么嚙齒動物和人的原代、永生化HSCs都是強(qiáng)大的前期驗(yàn)證工具。最近，多能干細(xì)胞誘導(dǎo)生成的HSCs提供了對細(xì)胞內(nèi)特定遺傳背景的認(rèn)識，可能有助于對肝纖維化發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)病機(jī)制的了解[16]。為了更好地模擬人肝纖維化物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，用于檢測靶點(diǎn)效果的模型也得到了改善和擴(kuò)充，包括運(yùn)用單細(xì)胞或多細(xì)胞類器官[17]，從正?；蚧疾〉膰X動物和人的肝臟上精確切取的肝臟切片[18]，以及使用人工肝裝置系統(tǒng)復(fù)制人肝中所需的各種要素[19]。此外，這些技術(shù)可通過3D打印獲得更進(jìn)一步的優(yōu)化[20]。

(二)驗(yàn)證模型的重要特征 任何抗肝纖維化靶點(diǎn)驗(yàn)證的模型都應(yīng)具備以下關(guān)鍵要素：(1)纖維化模型的行為和發(fā)病機(jī)制應(yīng)與人體相似。(2)候選治療靶點(diǎn)應(yīng)在模型和人的相同類型細(xì)胞表達(dá)且表達(dá)水平接近。(3)療效應(yīng)在多個(gè)模型中進(jìn)行驗(yàn)證。(4)應(yīng)在疾病確定后驗(yàn)證療效，而不是單純預(yù)防。(5)藥理學(xué)作用應(yīng)當(dāng)在模型與人體中相似。(6)應(yīng)有明確靶點(diǎn)參與的證據(jù)，藥物作用應(yīng)直接歸因于與其預(yù)期靶點(diǎn)的相互作用而不是脫靶作用。

(三)驗(yàn)證模型的局限性 盡管幾十年來嚙齒動物肝纖維化模型一直是藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證的主流，但它們與人體藥物療效的相關(guān)性相差甚遠(yuǎn)。雖然基于動物研究的許多藥物有較好前景，目前還沒有一種藥物被批準(zhǔn)用于肝纖維化的臨床治療。因此，我們需要對驗(yàn)證模型的局限性有更多關(guān)注：(1)微生物組的潛在貢獻(xiàn)。人和動物模型的微生物組之間的區(qū)別可能影響藥物療效，使用與人體微生物組接近的動物模型或許能更準(zhǔn)確地預(yù)測后續(xù)人體試驗(yàn)的結(jié)果。(2)動物模型患病時(shí)間短。人類肝病經(jīng)過數(shù)年乃至數(shù)十年的演變，引起ECM逐漸交聯(lián)且極難降解，最后導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)扭曲。然而，在驗(yàn)證抗肝纖維化藥物的嚙齒動物模型中，這些關(guān)鍵特征可能無法在相對較短的時(shí)間內(nèi)完全復(fù)制。(3)疾病可能由多個(gè)分子或通路驅(qū)動，僅針對單一分子或通路較難達(dá)到預(yù)期。最近的一項(xiàng)研究表明，NASH肝纖維化的發(fā)生受到復(fù)雜的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[6]，這意味著可能需要影響多個(gè)通路才能獲得治療效益。(4)肝纖維化可能具有不同亞型。例如，NASH可能由不同亞型組成，而不同的亞型具有不同的疾病驅(qū)動因素，因此也可能存在不同的治療靶點(diǎn)[21]。

三、總結(jié)及展望

利用強(qiáng)大的新技術(shù)來識別、優(yōu)化治療靶點(diǎn)，探索生物標(biāo)志物，通過對臨床試驗(yàn)中患者的肝臟樣本進(jìn)行更深入的分析以確定哪些靶點(diǎn)和標(biāo)記物能使治療獲益。這樣不僅能更好發(fā)現(xiàn)療效相關(guān)的分子驅(qū)動因素，還能識別出肝纖維化相關(guān)的候選生物標(biāo)志物。在改進(jìn)當(dāng)前動物模型的基礎(chǔ)上，輔以更復(fù)雜的類器官和其他先進(jìn)的體外模型，能更好地預(yù)測靶點(diǎn)在人體中的療效。結(jié)合數(shù)據(jù)驅(qū)動原理，多靶點(diǎn)聯(lián)合的抗纖維化治療也應(yīng)得到進(jìn)一步的研究。