miR-383-5p轉(zhuǎn)染對人卵巢顆粒細胞株KGN凋亡的影響及其機制

李韻穎，曹琴英，韓映雪，趙健，戶月，苗穗兵，甄亞麗，伊鳳蕊

1 河北醫(yī)科大學附屬石家莊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊 050000；2 石家莊市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一類以排卵功能障礙、高雄激素血癥或超聲顯示多囊卵巢為特征的多因素、多系統(tǒng)性疾病，影響全球8%～13%的育齡婦女［1］。PCOS女性中不孕的發(fā)生率為72%［2］，盡管通過干預(yù)生活方式、降雄激素治療、促排卵藥物、IVF-ET技術(shù)的應(yīng)用，其妊娠率較前有了很大的提高，但仍達不到預(yù)期水平，而且發(fā)現(xiàn)其卵母細胞受精能力和胚胎著床率低、流產(chǎn)率高等問題，這與卵泡發(fā)育異常、卵母細胞質(zhì)量降低、子宮內(nèi)膜功能障礙等有關(guān)。卵巢顆粒細胞作為卵泡微環(huán)境中主要的體細胞，緊鄰卵母細胞，其異常的增殖、凋亡和氧化應(yīng)激等直接影響卵母細胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育［3］。微小RNAs（miRNAs）是一類由18～23個核苷酸組成內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過調(diào)控并降低下游靶基因的表達，參與機體細胞幾乎全部的生物學過程中。微小RNA-383-5p（miR-383-5p）在多種惡性腫瘤中低表達，如鼻咽癌、乳腺癌、肺癌等，影響癌細胞的增殖能力及對放化療的敏感性，扮演“抑癌基因”的角色。研究［4］發(fā)現(xiàn)，miR-383-5p在PCOS患者卵巢顆粒細胞中差異表達。2021年10月—2022年5月，我們觀察了miR-383-5p轉(zhuǎn)染對人卵巢顆粒細胞株KGN凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑KGN細胞（上海中喬新舟生物）。TriQuick總RNA提取試劑（北京索萊寶），miR-383-5p及U6引物和miRNAs RT-qPCR試劑盒（廣州銳博生物），DMEM/F-12培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（浙江四季青），胰蛋白酶-EDTA消化液和胰蛋白酶消化液（北京索萊寶），miR-383-5p mimics（上海吉瑪），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen），活性氧（ROS）檢測試劑盒（上海碧云天），丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成），N-乙酰半胱氨酸（NAC）（上海碧云天），細胞凋亡檢測試劑盒（上海翊圣），RIPA裂解液（強），Bax鼠單克隆抗體和β-actin鼠單克隆抗體（武漢賽維爾），Bcl-2兔多克隆抗體和cleaved caspase 3鼠單克隆抗體（武漢三鷹），羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗（Seracare），ECL化學發(fā)光超敏顯色試劑盒（上海翊圣）。

1.2 KGN細胞培養(yǎng) 將KGN細胞從液氮中取出，放置在37℃恒溫水浴箱內(nèi)快速復蘇，依據(jù)細胞密度種至合適的培養(yǎng)皿中，隔日更換1次培養(yǎng)基。

1.3 KGN細胞分組、miR-383-5p mimics轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率判定 采用qRT-PCR法。取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液消化，按每孔3.5×105細胞接種于6孔板中，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。當細胞融合度在80%～90%時分組，并嚴格按照Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染150 pmol的miR-383-5p mimics。收集細胞加入TriQuick總RNA提取試劑提取細胞內(nèi)總RNA，Nanodrop One超微量分光光度計測定RNA濃度及純度。嚴格按照miRNAs RT-qPCR試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行擴增。擴增程序如下：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性2 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s（重復40個循環(huán)）；溶解曲線生成。U6作為miR-383-5p的內(nèi)參。采用2-ΔΔCT的方法進行計算。CT值為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán) 數(shù)。Blank組、miR-383-5p mimics組、miR-383-5p mimics+NAC組miR-383-5p相對表達量分別為1、98.849±11.208、99.104±10.022，miR-383-5p mimics組和miR-383-5p mimics+NAC組miR-383-5p表達較Blank組升高（P均＜0.05）。這一結(jié)果表明，細胞轉(zhuǎn)染成功。

1.4 各組細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的檢測 ①細胞凋亡率測算：采用流式細胞術(shù)。使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液常規(guī)消化收集細胞，加入1 mL預(yù)冷的1×PBS重懸洗滌兩次，4℃環(huán)境下 以1 000 r/min速度離心5 min，棄上清。加入1×Binding Buffer調(diào)整細胞密度為1×106細胞/mL。將100 μL細胞懸液轉(zhuǎn)移至5 mL流式管內(nèi)，依次加入5 μL的Annexin V-PE和10 μL的7-AAD，避光，室溫反應(yīng)15 min。加入400 μL的1×Binding Buffer，輕彈流式管底混勻。于1 h內(nèi)使用流式細胞儀進行檢測。使用FlowJo_V10軟件分析各組細胞的凋亡率。②細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase 3檢測：采用Western blot法。將細胞內(nèi)加入RIPA裂解液（強）冰上裂解30 min，后收集至離心管內(nèi)檢測蛋白濃度。95℃煮10 min使蛋白變性，室溫冷卻后備用。使用10%分離膠進行電泳，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)60 min。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h后孵育一抗［Bax抗體（1∶1 000）；Bcl-2抗體（1∶3 000）；cleaved caspase 3抗體（1∶1 000）；β-actin抗體（1∶1 000））］，4℃過夜。室溫孵育二抗（1∶5 000）1 h后ECL化學發(fā)光超敏顯色試劑盒顯色，拍照后對各組條帶的灰度值進行統(tǒng)計及分析。

1.5 各組細胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標檢測 ①細胞ROS檢測：采用流式細胞術(shù)。將收集的細胞用1 mL的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸洗滌兩遍，以1 000 r/min速度離心5 min，棄上清。加入1 mL的DCFH-DA稀釋液（1∶1 000），置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，每5 min顛倒混勻1次，以保證細胞和探針充分接觸。取出離心管，以1 000 r/min速度離心5 min，棄上清。加入培養(yǎng)基重懸洗滌兩遍，以充分去除未進入細胞的DCFH-DA。500 μL的1×PBS重懸細胞后轉(zhuǎn)移至流式管。于1 h內(nèi)使用流式細胞儀進行檢測，使用FlowJo_V10軟件分析各組細胞內(nèi)活性氧的水平。②細胞MDA檢測：將收集的細胞加入適量1×PBS重懸（1×106細胞加入0.3～0.5 mL的1×PBS）。使用超聲破碎儀提取細胞內(nèi)蛋白，Nanodrop One超微量分光光度計檢測蛋白濃度。按照MDA測定試劑盒的說明書，將蛋白樣本和試劑依次加至離心管中，蓋好蓋子，渦旋儀混勻，放置恒溫水浴箱中95℃孵育80 min。取出離心管，流水冷卻后，4 000 g/min速度離心10 min。取上清200 μL加至96孔板。使用酶標儀在532 nm波長處測定吸光度值。按照以下公式計算各組細胞內(nèi)MDA水平，MDA含量（nmol/mg）=（測定管-對照管）/（標準管-空白管）×標準品濃度÷蛋白濃度（mg/mL）。③細胞SOD活性檢測：制備細胞蛋白樣本及檢測蛋白濃度同“1.5”。按照SOD活性測定試劑盒的說明書，將蛋白樣本和試劑依次加至96孔板中。將96孔板放置酶標板上振蕩混勻后，37℃孵育20 min，在450 nm波長處測定吸光度值。按照以下公式計算各組細胞內(nèi)SOD活性，SOD抑制率（%）=×100%，SOD活性（U/mg）=SOD抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)÷蛋白濃度（mg/mL）。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達比較 相較于空白對照組，miR-383-5p mimics組細胞內(nèi)凋亡率明顯升高，并且抑凋蛋白Bcl-2的表達水平降低，促凋蛋白Bax和cleaved caspase 3的表達水平升高（P均＜0.05）。這說明miR-383-5p具有促進KGN細胞凋亡的作用。再進一步檢測發(fā)現(xiàn)，NAC干預(yù)組細胞的凋亡率低于miR-383-5p mimics組（P＜0.05），同時Bax和cleaved caspase 3蛋白的表達水平下調(diào)，Bcl-2蛋白的表達水平上調(diào)（P＜0.05），即抗氧化劑NAC逆轉(zhuǎn)了miR-383-5p促進KGN細胞凋亡的作用。這一結(jié)果表明，miR-383-5p通過誘導細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激從而引發(fā)了細胞的凋亡。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達比較（）

表1 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達比較（）

注：與Blank組比較，*P＜0.05；與miR-383-5p mimics組比較，△P＜0.05。

組別miR-383-5p mimics+NAC組miR-383-5p mimics組Blank組凋亡率（%）5.347±0.698△8.013±1.252*1.650±0.886 Bax蛋白0.657±0.171△0.870±0.227*0.535±0.163 Bcl-2蛋白1.498±0.586△0.962±0.476*1.541±0.686 cleaved caspase 3蛋白1.504±1.009△2.136±1.259*1.239±1.321

2.2 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組ROS、MDA、SOD活性比較 相較于空白對照組，miR-383-5p mimics組細胞內(nèi)ROS和MDA的水平升高，抗氧化物SOD水平下降（P＜0.05）。說明miR-383-5p誘導了KGN細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生。然而，當我們將100 μmol/L的抗氧化劑NAC添加至miR-383-5p mimics組作用24 h后，NAC干預(yù)組細胞內(nèi)ROS和MDA的水平低于miR-383-5p mimics組，SOD水 平則較高，說明NAC抑制了細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生（P＜0.05）。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組細胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較（）

表2 轉(zhuǎn)染miR-383-5p后各組細胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較（）

注：與Blank組比較，*P＜0.05；與miR-383-5p mimics組比較，△P＜0.05。

組別miR-383-5p mimics+NAC組miR-383-5p mimics組Blank組ROS（%）27.133±13.931△56.167±19.610*23.583±19.440 MDA（nmol/mg）0.610±0.155△0.755±0.121*0.586±0.073 SOD（U/mg）48.016±4.223△38.259±4.774*47.351±3.608

3 討論

大量研究表明，PCOS患者卵母細胞不成熟、質(zhì)量差及胚胎發(fā)育能力低歸因于其卵巢顆粒細胞異常的增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等。而卵巢顆粒細胞的功能和生物學行為受激素、炎癥因子等影響。隨著生物學信息和測序技術(shù)的發(fā)展，miRNAs作為一種新型調(diào)控分子，參與卵巢顆粒細胞的生物學過程。miR-383-5p是一種位于染色體8p22的內(nèi)含子miRNA，其宿主基因為SGCZ。該基因編碼ζ-肌聚糖，后者屬于跨膜蛋白家族。研究報道，miR-383-5p在PCOS患者卵巢顆粒細胞中差異表達，但其對細胞內(nèi)氧化應(yīng)激及凋亡的影響和其內(nèi)在機制尚不明確。

眾所周知，機體內(nèi)存在一套完善的抗氧化體系，可以將ROS等自由基維持在一個相對低水平，有利于細胞的正常功能。但當自由基的產(chǎn)生與抗氧化體系的清除能力失衡時，就會引發(fā)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是人類多種疾病的主要病理生理機制［5］。過多的ROS導致DNA、蛋白質(zhì)等細胞成分損傷，觸發(fā)線粒體膜上通透孔的開放，誘導細胞凋亡。PCOS女性卵巢組織中上調(diào)的miR-21通過抑制程序性細胞死亡因子4/ROS軸促進胰島素處理的小鼠顆粒細胞增殖［6］。ROS誘導的氧化應(yīng)激可能是卵母細胞質(zhì)量差的原因［7］。先前報道稱，miR-383-5p可以通過靶向抑制過氧化物酶3—一種維持內(nèi)源性氧化還原穩(wěn)態(tài)的抗氧化蛋白［8］，誘導糖尿病性視網(wǎng)膜病變組織中ROS產(chǎn)生、凋亡、自噬等［9］。鑒于人卵巢顆粒瘤來源的KGN細胞株具有類似人卵巢顆粒細胞的功能。本研究中我們將miR-383-5p轉(zhuǎn)染至KGN細胞，發(fā)現(xiàn)過表達miR-383-5p可導致ROS和MDA升高，SOD降低。提示miR-383-5p可激活人卵巢顆粒細胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。

細胞凋亡是一種在生理或者病理狀態(tài)下發(fā)生的程序性細胞死亡，其中Bcl-2家族蛋白起著關(guān)鍵作用。Bcl-2家族包括以Bcl-2為代表的抑制凋亡的蛋白和以Bax為代表的促進凋亡的蛋白。經(jīng)證實，miR-16等多種miRNAs均可通過調(diào)控PCOS患者卵巢顆粒細胞凋亡影響其功能。miR-383-5p在胃癌組織中的表達相較于鄰近非腫瘤組織中偏低，與Bcl-2的表達水平負相關(guān)，并且兩者都與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移相關(guān)，體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-383-5p可以靶向調(diào)控Bcl-2的表達升高細胞凋亡率［10］。本研究通過檢測發(fā)現(xiàn)，將KGN細胞過表達miR-383-5p后，細胞的凋亡率升高，并且凋亡相關(guān)蛋白也隨之改變。提示miR-383-5p可以促進人卵巢顆粒細胞株KGN的凋亡。

如前所述，氧化應(yīng)激可導致細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，從而誘導細胞凋亡。為進一步探究miR-383-5p誘導的KGN細胞氧化應(yīng)激和凋亡之間的關(guān)系。我們將抗氧化劑NAC添加至過表達miR-383-5p的KGN細胞內(nèi)，可見細胞的凋亡率和促凋蛋白Bax、cleaved caspase 3表達水平降低，抑凋蛋白Bcl-2表達水平升高。本研究結(jié)果提示，miR-383-5p促進人卵巢顆粒細胞凋亡的功能可能是通過激活氧化應(yīng)激途徑誘導的。

總之，miR-383-5p可以通過激活人卵巢顆粒細胞株KGN中氧化應(yīng)激途徑誘導細胞凋亡。這為PCOS的病理生理機制提供了理論依據(jù)，為PCOS的診斷和治療提供了新思路。