納米硒對(duì)犬腎衰中腎組織離子轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)及凋亡的影響

高海航，張嘉賓，張夢(mèng)迪，李 浩，楊小琦，史菁菁，劉 鑫，周東海*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070; 2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，阿拉爾 843300)

急性腎衰作為發(fā)病率死亡率最高的腎疾病嚴(yán)重危害犬的健康[1]，以往研究主要集中在急性腎衰所致的腎實(shí)質(zhì)性損傷引起腎功能的改變，對(duì)治療中離子代謝與凋亡關(guān)聯(lián)性研究甚少。本研究以腺嘌呤為急性腎衰造模藥物、納米硒為急性腎衰治療與預(yù)防藥物，以急性腎衰犬腎組織為研究對(duì)象，旨在探究納米硒對(duì)犬腎衰中重吸收與凋亡作用的影響。

硒(Se)是動(dòng)物機(jī)體不可或缺的一種微量元素[2]，近些年來(lái)，納米硒(nano-Se)因其生物利用度、催化效率、吸附能力較亞硒酸鹽高，在影響綿羊與山羊[3]、小鼠[3]、大鼠[4]及家禽[5]機(jī)體代謝中廣為研究。納米硒治療與預(yù)防以往作用主要針對(duì)敏感組織和器官的氧化應(yīng)激損傷，例如口服2 mg·kg-1的納米硒通過(guò)減輕雄性小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激來(lái)抑制BPA引起的生殖毒性[6]；提前口服0.5 mg·kg-1的納米硒可通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和血紅素加氧酶-1(HO-1)表達(dá)來(lái)減輕氧化應(yīng)激同時(shí)抑制腦組織炎癥反應(yīng)與凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，延緩戊四唑注射后小鼠全面性癲癇發(fā)作的持續(xù)時(shí)間[7]。急性腎衰治療主要圍繞恢復(fù)電解質(zhì)、酸堿平衡，抗炎利尿進(jìn)行，而其治療策略本身需要評(píng)估具體腎排泄功能情況，防止過(guò)度補(bǔ)液導(dǎo)致的鹽、水超負(fù)荷[8]。急性腎衰的特征是腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate，GFR)急劇下降及急性腎小管壞死(acute tubular necrosis，ATN)；與之有關(guān)的病理生理機(jī)制包括由腎小管上皮細(xì)胞從基底膜上脫離引起的腎小管阻塞，以及由于上皮細(xì)胞層破壞導(dǎo)致腎小球?yàn)V液回流重吸收功能受阻。SLC12A1基因是一種腎特異性的 Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同種型，僅在髓袢升支粗段(thick ascending limb, TAL)的頂膜中表達(dá)。它的主要作用是介導(dǎo) Na+、K+和Cl-通過(guò)哺乳動(dòng)物腎中的TAL頂膜的共轉(zhuǎn)位[9]回收25%的超濾NaCl負(fù)載[10]。間質(zhì)鈣濃度升高會(huì)激活基底外側(cè)CaSR直接調(diào)節(jié)細(xì)胞旁鈣通透性[11]，除了Ca2+運(yùn)輸系統(tǒng)，CaSR (鈣敏感性受體)信號(hào)傳導(dǎo)影響相關(guān)的腎小管遠(yuǎn)端NKCC2和NCC。NKCC2和NCC由包含無(wú)賴氨酸激酶 (lysine deficient protein kinase, WNK)和兩種同源Ste20相關(guān)激酶SPAK和OSR1的激酶級(jí)聯(lián)激活[12]。WNK家族一方面感知細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度、細(xì)胞外滲透壓和細(xì)胞體積的變化，并將這些信息最終傳遞給眾多離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以維持細(xì)胞和有機(jī)體的穩(wěn)態(tài)并影響細(xì)胞形態(tài)和行為[13]。除腎小管上皮細(xì)胞外，神經(jīng)細(xì)胞對(duì)體積變化同樣敏感，以往的研究表明，抑制WNK-SPAK/OSR1信號(hào)通路可通過(guò)減少NKCC的磷酸化來(lái)緩解腦中風(fēng)時(shí)滲透壓變化引起的腦細(xì)胞腫脹引起的腦水腫[14]，此外通過(guò)RNA干擾抑制內(nèi)源性WNK3蛋白可加速細(xì)胞凋亡反應(yīng)并促進(jìn)Caspase-3的活化[15]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所使用的年齡1歲左右，體重約4 kg的20只健康貴賓犬均購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)(武漢)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器與試劑

腺嘌呤(G1924214)購(gòu)自Aladdin生物制品有限公司。納米硒(純度≥99%)購(gòu)自Macklin生化有限公司。呋塞米注射液購(gòu)自廣東萬(wàn)事達(dá)動(dòng)物藥業(yè)有限公司。葡萄糖NaCl注射液購(gòu)自武漢濱湖雙鶴藥業(yè)。肌酐測(cè)試盒(C011-1-1)、血尿素氮測(cè)試盒(C013-1-1)、鈣測(cè)試盒(C004-2-1)、無(wú)機(jī)磷測(cè)試盒(C006-1-1)購(gòu)自南京建成科技有限公司。Trizol Reagent(15596-026)購(gòu)自Invitrogen Life Technologies公司。cDNA合成試劑盒、RT-qPCR試劑盒購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。NKCC2、Caspase3、Caspase9、BAX、BCL-2抗體購(gòu)自沈陽(yáng)Wanleibio 試劑公司。WNK1、WNK3、CaSR、ACTB抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗及蛋白Marker購(gòu)自ABclonal試劑公司。PAGE凝膠快速制備試劑盒(8%)購(gòu)自上海雅酶生物科技公司。

LightCycler96 熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche集團(tuán)，URIT-150Vet尿液分析儀購(gòu)自桂林優(yōu)利特醫(yī)療公司，OLYMPUS YCX41 光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯光學(xué)株式會(huì)社。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

20只體重約4 kg年齡1歲左右的貴賓犬在做基本健康檢查并適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control，飼喂基礎(chǔ)日糧30 d)、急性腎衰造模組(Model，15 d基礎(chǔ)日糧+15 d腺嘌呤75 mg·(kg·d)-1)、常規(guī)輸液治療組(Infusion，15 d腺嘌呤75 mg·(kg·d)-1+15 d葡萄糖氯化鈉注射液60 mL·(kg·d)-1、呋塞米2～4 mg·kg-1、納米硒治療組(Nano-Se，15 d添加飼喂腺嘌呤，75 mg·(kg·d)-1+15 d添加飼喂納米硒0.5 mg·(kg·d)-1)、納米硒預(yù)防組(Prevention，15 d添加飼喂納米硒0.5 mg·(kg·d)-1+15 d添加飼喂腺嘌呤，75 mg·(kg·d)-1)，每組4只犬，試驗(yàn)周期為30 d。

1.4 樣本采集與處理

跟蹤記錄30 d治療周期內(nèi)犬臨床狀態(tài)變化，包括精神狀態(tài)、食欲飲欲、排尿排便情況、尿液糞便顏色狀態(tài)變化，完成30 d造模與治療流程周期后對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行靜脈采血5 mL，用于血液生化檢測(cè)，膀胱穿刺取尿用于尿常規(guī)檢測(cè)，麻醉安樂(lè)死后腎組織取樣用于石蠟切片、免疫組化以及核酸與蛋白提取等后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 犬急性腎衰判斷

參考國(guó)際急性腎衰造模試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，在造模后犬7～15 d內(nèi)出現(xiàn)穩(wěn)定的血清CRE，BUN上升且超出正常范圍，其中，血肌酐濃度需達(dá)到三級(jí)腎衰CRE 180～440 μmol·L-1標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 血清肌酐與血清尿素氮含量的測(cè)定

全血分離血清后分，別使用肌酐測(cè)定試劑盒(除蛋白法)及血清尿素氮測(cè)定試劑盒(二乙酰肟比色法)進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 血清鈣離子與磷離子濃度測(cè)定

全血分離血清后，分別使用鈣測(cè)試盒與無(wú)機(jī)磷測(cè)試盒測(cè)定濃度。

1.8 尿常規(guī)檢測(cè)

將5 mL注射器收集到的尿液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，將尿常規(guī)檢測(cè)試紙完全浸于尿液中1 min，將浸潤(rùn)的試紙條置于尿液分析儀中進(jìn)行檢測(cè)并記錄。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)及凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平

Trizol法提取腎組織總RNA，并測(cè)定其濃度與純度，根據(jù)cDNA合成試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后根據(jù)RT-qPCR試劑盒說(shuō)明測(cè)定離子轉(zhuǎn)運(yùn)及凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

1.10 Western blot檢測(cè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

提取腎組織蛋白，BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，用SDS-PAGE Loading Buffer將其稀釋至同一濃度并煮沸。SDS-PAGE(8%)電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉。一抗統(tǒng)一于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次后，二抗常溫孵育1 h，TBST洗滌后，ECL顯色。用Image J(National Institutes of Helth，America)計(jì)算蛋白條帶灰度值。

1.11 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 納米硒犬腎衰治療對(duì)比試驗(yàn)中血清、尿液檢測(cè)

如圖1A、B所示，造模組CRE與BUN較空白組顯著上升，且CRE達(dá)到三級(jí)腎衰標(biāo)準(zhǔn)判定為造模成功；補(bǔ)液治療組、納米硒治療組、納米硒預(yù)防組對(duì)比造模組CRE與BUN均出現(xiàn)極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)下降。由圖1C、D顯示，對(duì)比造模組，納米硒治療組血清鈣濃度顯著上升(P<0.05)，納米硒治療組與預(yù)防組血清磷濃度顯著下降(P<0.05)。如圖1E、F所示，對(duì)比造模組，納米硒治療組與預(yù)防組尿比重顯著升高(P<0.05)，納米硒治療組尿pH顯著升高(P<0.05)。

2.2 腎組織離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)RT-qPCR、Western blot與切片免疫組化分析

如圖2A～C所示，對(duì)比造模組，納米硒治療組CaSR mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，納米硒預(yù)防組WNK1 mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.05)，納米硒治療組NKCC2 mRNA表達(dá)量極顯著減少(P<0.01)。如圖2D、E～G顯示，對(duì)比造模組，納米硒治療組CaSR蛋白表達(dá)量顯著上升，WNK1、NKCC2蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，納米硒預(yù)防組WNK1蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。

如圖3所示，NKCC2蛋白在造模組表達(dá)量明顯升高，且在壞死腎小管上皮細(xì)胞、腎小管間隔周圍高表達(dá)，腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞增多，補(bǔ)液治療組、納米硒治療組、納米硒預(yù)防組NKCC2蛋白表達(dá)量相比造模組均下降，且各治療組腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞數(shù)量下降。

2.3 腎組織凋亡相關(guān)RT-qPCR與Western blot檢測(cè)

如圖4A～D所示，相對(duì)造模組，納米硒治療組與預(yù)防組BCL-2/BAX相對(duì)轉(zhuǎn)錄量為增加趨勢(shì)，納米硒治療組WNK3 mRNA極顯著增加(P<0.01)，Caspase3與Caspase9 mRNA顯著降低(P<0.05)。如圖4E、F～I(xiàn)所示納米硒治療組BCL-2/BAX表達(dá)量較造模組相對(duì)增加，WNK3與Caspase9表達(dá)量較造模組極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)增加，Caspase3表達(dá)量相對(duì)造模組極顯著下降(P<0.01)。

A、B.各組犬血清肌酐和尿素氮深度；C、D.各組犬血清鈣離子、磷離子濃度；E、F.各組犬尿比重、尿液pH；Control. 空白對(duì)照組；Model. 腎衰造模組；Infusion. 輸液治療組；Nano-Se. 納米硒治療組；Prevention. 納米硒預(yù)防組；對(duì)比造模組，*. P<0.05，**. P<0.01；對(duì)比空白對(duì)照組，#. P<0.05，##. P<0.01，下同；參考正常范圍：CRE(44～159 μmol·L-1)，BUN(2.9～7.5 mmol·L-1)，尿比重(1.015～1.045)，尿pH(5.4～7.4)，血鈣(2.25～3.00 mmol·L-1)，血磷(0.97～1.76 mmol·L-1)A, B. Differences in serum creatinine (μmol·L-1) and blood urea nitrogen (mmol·L-1) of dogs in each group；C, D. Differences in serum calcium ion and phosphorus ion concentrations (mmol·L-1) in each group of dogs；E, F. Differences in urine specific gravity and urine pH of dogs in each group；Control. Blank control group; Model. Renal failure modeling group; Infusion. Infusion treatment group; Nano-Se. Nano-selenium treatment group; Prevention. Nano-selenium prevention group; Compared with modeling group, *. P<0.05, **. P< 0.01; Compared with blank control group, #. P<0.05, ##. P<0.01, the same as below; reference normal range: CRE (44-159 μmol·L-1), BUN (2.9-7.5 mmol·L-1), urine specific gravity (1.015-1.045), urine pH (5.4-7.4), blood calcium (2.25-3.00 mmol·L-1), blood phosphorus (0.97-1.76 mmol·L-1)圖1 血清、尿液檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Serum and urine test results

A～C. 各組犬腎組織CaSR、WNK1、NKCC2 (mRNA)表達(dá)差異；D、E～G.各組犬腎組織CaSR、WNK1、NKCC2蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果與灰度值分析結(jié)果A-C. Differences in the expressions of CaSR, WNK1, NKCC2 (mRNA) in kidney tissue of dogs in each group; D, E-G. Western blot detection results and gray value analysis results of CaSR, WNK1, NKCC2 proteins in dog kidney tissues of each group圖2 腎組織離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)RT-qPCR與Western blot結(jié)果Fig.2 Results of RT-qPCR and Western blot related to ion transport in renal tissue

圖3 犬腎組織切片NKCC2抗體免疫組化結(jié)果 (200×)Fig.3 Immunohistochemical results of NKCC2 antibody in canine kidney tissue sections (200×)

A～D.各組犬腎組織BCL-2/BAX，WNK3、Caspase3、Caspase9 (mRNA)表達(dá)差異；E、F～I(xiàn).各組犬腎組織BCL-2/BAX，WNK3、Caspase3、Caspase9蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果與灰度值分析結(jié)果A-D. Differences in the expressions of BCL-2/BAX，WNK3,Caspase3,Caspase9 (mRNA)in kidney tissue of dogs in each group; E, F-I. Western blot detection results and gray value analysis results of BCL-2/BAX，WNK3,Caspase3,Caspase9 proteins in dog kidney tissues of each group圖4 腎組織凋亡相關(guān)RT-qPCR與Western blot結(jié)果Fig.4 Results of RT-qPCR and Western blot related to apoptosis in renal tissue

3 討 論

治療周期結(jié)束時(shí)，各組犬血清生化檢測(cè)結(jié)果顯示，補(bǔ)液治療組、納米硒治療組與納米硒預(yù)防組的CRE與BUN較造模組均有數(shù)值上的顯著下降；尿常規(guī)檢測(cè)結(jié)果也顯示，補(bǔ)液治療組、納米硒治療組與納米硒預(yù)防組的尿比重較造模組顯著上升，尿pH較造模組顯著下降。從腎血清生化指標(biāo)與尿常規(guī)指標(biāo)變化來(lái)看，補(bǔ)液利尿與納米硒治療對(duì)于犬急性腎衰的治療均有積極作用且效果顯著。

造模組發(fā)生腎衰時(shí)表現(xiàn)出明顯的血鈣含量下降，血磷含量上升，在腎功能正常的患者中，鈣和磷酸鹽的循環(huán)水平通過(guò)甲狀旁腺激素、1,25-二羥基維生素D和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23三者與鈣磷鹽通過(guò)多個(gè)內(nèi)分泌反饋通路相互作用，這三種激素的主要靶器官為腎、骨骼、腸道與甲狀旁腺[16]，高磷血癥可以直接刺激甲狀旁腺使PTH過(guò)度分泌，一方面，增加腎鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)促進(jìn)鈣離子重吸收，另一方面，可以通過(guò)下調(diào)腎鈉依賴性磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加磷酸鹽排泄以此調(diào)節(jié)鈣磷代謝失衡。試驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)液治療組、納米硒治療組、納米硒預(yù)防組的血磷相對(duì)造模組均顯著降低，并增加血鈣含量，3種方法均可以減輕由急性腎衰引起的鈣磷代謝失調(diào)。

CaSR是一種G偶聯(lián)蛋白受體，通常在甲狀旁腺與腎小管中表達(dá)[17]，其活化效應(yīng)通過(guò)響應(yīng)細(xì)胞外液鈣離子濃度，增加細(xì)胞內(nèi)液Ca2+作為第二信使調(diào)控下游信號(hào)通路，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通過(guò)激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶參與調(diào)控WNK1/SPAK通路最終促進(jìn)或抑制腎小管頂膜上NKCC2的磷酸化[18]。Western blot結(jié)果顯示，造模組CaSR相對(duì)空白對(duì)照組表達(dá)量降低而最終調(diào)控的NKCC2過(guò)表達(dá)，此時(shí)生理效應(yīng)可能為腎在組織受損的情況下通過(guò)感應(yīng)機(jī)體內(nèi)血清Ca2+濃度下降CaSR-WNK1/SPAK-NKCC2通路過(guò)表達(dá)來(lái)補(bǔ)償受損腎小管上皮細(xì)胞對(duì)尿液的重吸收功能；由于NKCC2是一類布美他尼類敏感受體蛋白故補(bǔ)液利尿治療中利尿劑的選擇為速尿，通過(guò)速尿特異性刺激NKCC2蛋白表達(dá)與納米硒治療效果進(jìn)行對(duì)比，在補(bǔ)液治療與使用納米硒后，CaSR表達(dá)量較造模組明顯增加，WNK1與NKCC2表達(dá)量相比造模組顯著減少，其原因可能為血清鈣離子的上升帶動(dòng)激活腎組織中CaSR表達(dá)量的增加，通過(guò)WNK/SPAK-NKCC2通路最終減少了下游NKCC2的表達(dá)量，減弱了急性腎衰中過(guò)度代償?shù)闹匚展δ?，進(jìn)一步促進(jìn)腎與機(jī)體的電解質(zhì)水平衡。

腎組織凋亡效應(yīng)增強(qiáng)伴隨急性腎衰的發(fā)展，在急性腎衰病程中調(diào)往與壞死效應(yīng)既有積極作用也有其帶來(lái)的消極作用。通過(guò)Western blot驗(yàn)證了治療周期BCL-2與BAX的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)補(bǔ)液治療與添加納米硒治療后促凋亡基因BAX的表達(dá)相比造模組顯著下降，抗凋亡基因BCL-2的表達(dá)顯著增加，從一方面證明了兩種治療方法對(duì)腎組織凋亡趨勢(shì)都具有抑制作用；治療組CaSR表達(dá)量增加，進(jìn)而下游WNK家族整體表達(dá)量增加，而低WNK3表達(dá)對(duì)下游Caspase-3具有直接效應(yīng)，當(dāng)WNK3被抑制時(shí)可加速細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)Caspase-3的活化[15]。首先在造模組可以看到明顯的Caspase3表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞凋亡效應(yīng)的增加，納米硒治療后，WNK3表達(dá)量增加，同時(shí)Caspase-3表達(dá)量減少，Caspase-9作為凋亡的觸發(fā)劑可激活Caspase 3直接通過(guò)自身介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡,而治療組Caspase9 mRNA減少進(jìn)一步反映了此時(shí)活化Caspase-3效應(yīng)減弱，從另一方面證明了兩種治療方法均可以下調(diào)急性腎衰中的調(diào)亡效應(yīng)。

4 結(jié) 論

納米硒可能在發(fā)生急性腎衰時(shí)改善機(jī)體鈣磷代謝，一方面，通過(guò)CaSR-WNK/SPAK-NKCC2通路間接地降低腎組織由于急性腎衰發(fā)生而過(guò)表達(dá)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從而調(diào)節(jié)腎的重吸收功能，另一方面，通過(guò)CaSR-WNK-Caspase3通路減少腎組織促凋亡蛋白的表達(dá)從而減輕腎損傷，納米硒在機(jī)體內(nèi)具體代謝及作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。