多房棘球蚴誘導小鼠枯否氏細胞極化相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

李艷萍，劉婷麗，李 紅，陳國梁，王立群，郭小臘，駱學農(nóng),2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046;2.揚州大學，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

多房棘球蚴病(Echinococcosismultilocularis，Em),又稱泡球蚴病(alveolar echinococcosis，AE),是多房棘球蚴絳蟲的中絳期幼蟲-多房棘球蚴(E.multilocularis，Em)寄生于人和嚙齒類動物的肝所引起的一種嚴重的人畜共患寄生蟲病，廣泛流行于歐洲、北美、亞洲北部及我國西北地區(qū)[1-2]。犬、狐貍、狼等為其終末宿主，而嚙齒類動物為其中間宿主[3]。人因誤食蟲卵而感染，幼蟲寄生于肝，如惡性腫瘤一樣形成局部侵襲性和浸潤性生長，并可轉(zhuǎn)移到其他組織器官[4]，未經(jīng)治療的患者死亡率高達90%[5]。目前，使用手術(shù)切除結(jié)合阿苯達唑(ABZ)藥物是公認的治療方法[6]。

巨噬細胞亞群主要包括促炎的M1型和抗炎的M2型。M1型巨噬細胞通常產(chǎn)生高水平的促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和誘導型一氧化氮合酶(inducible NO synthase，iNOS)等，從而表現(xiàn)出強大的抗微生物和腫瘤活性；而M2型巨噬細胞通常產(chǎn)生高水平的甘露糖受體(CD206)、精氨酸酶1(Arg1)及IL-10和TGF-β等，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進組織重塑、血管生成和腫瘤形成[7-11]。肝巨噬細胞主要由常駐枯否氏細胞(KCs)和單核巨噬細胞(MoMφs)組成，在免疫耐受、維持肝穩(wěn)態(tài)和抗炎微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[12]。研究證實，多房棘球蚴感染早期刺激宿主產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，隨著AE的發(fā)展逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)門h2型免疫抑制反應(yīng)。同時，在感染過程中也可能伴隨M1/M2型巨噬細胞極化[13]。據(jù)報道，多房棘球蚴感染小鼠在第5天時肝中就出現(xiàn)大量以M1表型(F4/80+)為主的巨噬細胞浸潤，通過產(chǎn)生促炎細胞因子來清除早期幼蟲。而在慢性感染階段極化為M2表型，從而有利于蟲體的持續(xù)性感染[14]。

微小RNA(miRNAs)和環(huán)狀RNAs(circRNAs)參與不同水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[15]。miRNA通常與靶基因3′UTR互補結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄或降解，從而下調(diào)靶基因的表達[16]。circRNAs作為一種內(nèi)源性RNAs，通過與miRNAs的競爭性靶向結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達[17]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs和circRNAs參與細胞自噬、凋亡、增殖等生理病理過程[18-22]，在調(diào)控疾病進程中發(fā)揮重要作用[23-27]。在寄生蟲感染過程中，很多miRNAs參與宿主巨噬細胞的極化[28-30]，在調(diào)節(jié)宿主與病原相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在疾病的致病機制、診斷、治療領(lǐng)域具有很大的研究潛力[31]。因此，本研究通過RNA高通量測序分析，篩選并鑒定與多房棘球蚴感染誘導巨噬細胞極化相關(guān)的非編碼RNA(ncRNA)，并建立與之相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，旨在探索ncRNAs在多房棘球蚴感染誘導的KCs極化中的作用機制，為進一步揭示多房棘球蚴的免疫逃避機制，探索其診斷標志提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物及蟲體 BALB/c小鼠，雄性，6～8周齡，購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心。長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)購自北京首都醫(yī)科大學，多房棘球蚴于長爪沙鼠體內(nèi)保種。

1.1.2 主要試劑 膠原酶Ⅳ(Gibco, USA)、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、0.25%的胰蛋白酶(trypsin)均購自Gibco公司；lipofectamine 3000、TRIzol試劑購自Invitrogen公司；HiScript?III 1 st Strand cDNA Synthesis試劑盒購自南京諾維贊生物公司；All-in-One qPCR Mix、qPCR內(nèi)參GAPDH、U6引物均購自Gene Copoeia；mmu-miR-466c-5p模擬物購自上海生工生物公司。

1.1.3 主要儀器 恒溫循環(huán)水浴、ABI 7500實時熒光定量PCR儀(Termo Fisher)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Termo Fisher)、水浴鍋、低速冷凍離心機和倒置熒光顯微鏡(Leica)等。

1.2 方 法

1.2.1 多房棘球蚴原頭蚴感染小鼠模型的建立 采用頸椎脫臼處死長爪沙鼠，取出腹腔內(nèi)寄生的多房棘球蚴包囊，研磨過濾后收集原頭蚴，并進行計數(shù)。將60只BALB/c小鼠隨機分為感染組和對照組，每組30只。感染組每只小鼠腹腔接種600只原頭蚴，對照組腹腔注射等體積PBS，分別在感染后1、2和3月處死小鼠，分離肝KCs。

1.2.2 小鼠肝KCs的分離鑒定 分別取感染組和對照組小鼠各3只，麻醉后暴露腹腔，將乙二醇雙四乙酸(EGTA)經(jīng)肝門靜脈注入肝。2 min后，灌注含0.04%的膠原酶Ⅳ的EB(Earle’s balanced salt solution)溶液，消化6 min。摘取肝，剔除膽囊及結(jié)蹄組織，放入含0.1 mg·mL-1DNase Ⅰ及0.08%的膠原酶Ⅳ的EB中，充分研磨，于37 ℃水浴內(nèi)消化30 min，用70目細胞篩過濾后，收集濾液于50 mL離心管，45×g離心5 min，收集上清液，加入等體積的GBSS(Gey’s balanced salt solution)緩沖液，600×g離心10 min。棄上清，用少量GBSS重懸沉淀，并加入GBSS溶液至50 mL，500×g離心10 min，棄上清，用2～3 mL GBSS重懸細胞沉淀。用GBSS分別配制20%和11.5% 的optiprep溶液，并用長針頭將20%、11.5% optiprep溶液及細胞懸液依次沿管壁緩慢加入15 mL離心管中，1 400×g離心17 min，收集最上面的KCs層于15 mL離心管，加入GBSS緩沖液，600×g離心10 min，收集細胞沉淀，用含10% FBS的RPMI-1640進行培養(yǎng)。

KCs培養(yǎng)4 h后，用TRizol提取總RNA， HiScript?III合成cDNA第一鏈，用All in one qPCR Mix進行qRT-PCR反應(yīng)，檢測KCs表面標志分子F4/80及肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)標志分子Col1a1、Col3a1、a-SMA及GFAP的水平。反應(yīng)體系：2×All in one qPCR Mix 10 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物(2 μmol·L-1)各1 μL，cDNA模板2 μL，DEPC水 6.5 μL。反應(yīng)程序參數(shù)：95 ℃預變性10 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。每個試驗設(shè)3個生物學重復，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達水平。

1.2.3 不同感染時期KCs表型分子的相對表達水平 分別分離多房棘球蚴感染1、2和3月的小鼠肝KCs，用qPCR檢測M1型巨噬細胞標志分子IFN-γ、IL1β、IL12α、IL18、TNF-α、iNOS、IL6及M2型標志分子IL4、IL10、IL13、TGF-β、Arg1的mRNA水平。同時，用Western blot檢測M2型標志分子IL13 和Arg1的表達水平。

1.2.4 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 將感染2月的小鼠肝KCs進行RNA高通量測序分析，篩選出與M2型巨噬細胞極化相關(guān)的部分差異表達的circRNA、miRNA和mRNA，結(jié)合Target Scan在線軟件預測基因靶向結(jié)合位點，利用Cytoscape2.0軟件構(gòu)建相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用qPCR驗證部分基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.5 miR-466c-5p抑制circ_0000372和IL13的表達 分離正常小鼠的KCs，用人工合成的miR-466c-5p模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染KCs，利用qPCR分析miR-466c-5p過表達對circ_0000372和IL13的轉(zhuǎn)錄水平的影響，進一步驗證上述構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠KCs的純度鑒定

qPCR結(jié)果顯示(圖1)，KCs表面標志分子F4/80的表達水平顯著高于HSCs的標志分子Col1a1、Col3a1、a-SMA及GFAP的mRNA表達水平(P<0.000 1)，說明分離的KCs純度較好。

****. P<0.000 1圖1 KCs純度檢測Fig.1 Detection of KCs purity

2.2 小鼠KCs表型標志分子檢測

qPCR檢測發(fā)現(xiàn)(圖2)，感染1月時，M1型標志分子IL1β和TNF-α極顯著上調(diào)(P<0.001)，M2型標志分子IL10和IL13極顯著上調(diào)(P<0.000 1)(圖2A)；感染2和3月時M1型標志分子均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.001)下調(diào)，而M2型標志分子的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平均顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2B、C，圖3)。說明多房棘球蚴感染先誘導KCs產(chǎn)生M1型和M2型混合型極化，而后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐訫2型巨噬細胞為主的極化，產(chǎn)生抗炎因子Arg1和IL13等。

*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001, ****. P<0.000 1, ns. P>0.05圖2 多房棘球蚴不同感染時期KCs表型標志分子的相對表達水平Fig.2 Relative expression levels of phenotypic markers in KCs at different stages of E. multilocularis

2.3 ceRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)RNA高通量測序分析，篩選出與多房棘球蚴感染相關(guān)的M2型標志分子IL10、IL13及Arg1呈顯著正相關(guān)的circRNAs，然后預測與IL10、IL13及Arg1具有負調(diào)控關(guān)系的miRNA，構(gòu)建出由5個circRNA、9個miRNA及3個mRNA(IL10、IL13和Arg1)組成的12對circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖4)。

2.4 qPCR驗證網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

為了驗證構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，對網(wǎng)絡(luò)圖中的部分非編碼RNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進行了qPCR檢測(圖5)。結(jié)果顯示，circ_0000372、circ-0001571及circ-0001684在多房棘球蚴感染2月的小鼠KCs中均顯著上調(diào)表達(P<0.05)，而miR-449a-5p、miR-142a-5p、miR-182-5p、miR-466c-5p均呈顯著下調(diào)表達(P<0.05)，其靶基因IL10、IL13及Arg1均顯著上調(diào)表達(P<0.01)。circRNA、miRNA及mRNA的表達趨勢與測序結(jié)果及它們間的調(diào)節(jié)關(guān)系基本一致。

2.5 circ_0000372-miR466c-5p-IL13調(diào)控關(guān)系

以circ_0000372-miR466c-5p-IL13調(diào)控軸為例進一步驗證ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)(圖6)，在KCs中過表達miR466c-5p后，circ_0000372及IL13的表達水平均顯著下調(diào)(P<0.01)。結(jié)果說明circ_0000372、miR-466c-5p及IL13之間可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。

**. P<0.01圖3 多房棘球蚴感染2月的KCs M2型標志分子的表達水平Fig.3 Expression level of KCs M2 marker molecule in 2 months infected with E. multilocularis

圖4 與KCs M2型極化相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Construction of ceRNA network related with M2 polarization of KCs

3 討 論

AE于1965年在我國新疆首次被報道[32]，隨后，在甘肅、寧夏、西藏、青海、四川等地陸續(xù)出現(xiàn)病例[33-37]，嚴重威脅牧民的生命健康以及畜牧業(yè)的發(fā)展。AE在臨床上有“蟲癌”之稱，蟲體浸潤性生長壓迫肝及周圍器官，阻塞肝門靜脈引起肝功能障礙、肝硬化、繼發(fā)膽管炎，并可通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至其他器官組織[38]。多數(shù)寄生蟲為了達到長期生存的目的，進化出了多種逃避宿主免疫應(yīng)答的策略，一方面是改變其表面抗原從而逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別，另一方面，分泌一些活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答。有研究報道，多房棘球蚴感染能誘導宿主淋巴細胞和樹突狀細胞(DC)凋亡[39-40]，并可上調(diào)BALB/c小鼠肝中抗凋亡相關(guān)因子的表達水平，有利于蟲體在宿主體內(nèi)的發(fā)育和存活[41]。此外，多房棘球蚴感染誘導宿主Th1/Th2失衡也是其逃避宿主免疫應(yīng)答的主要手段。目前大多數(shù)研究認為，棘球蚴感染早期宿主為了清除蟲體感染主要產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，但隨著棘球蚴的生長和轉(zhuǎn)移，機體的免疫應(yīng)答逐漸向Th2型轉(zhuǎn)化[42]。KCs是肝常駐巨噬細胞，肝炎癥受促炎的M1型KCs和抗炎的M2型KCs的平衡調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，AE晚期的KCs中抗炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均高于促炎細胞因子，而且KCs能分泌大量TGF-β1，激活HSCs，進一步促進肝纖維化[43]。本研究通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，多房棘球蚴感染小鼠1月時KCs中M1表型標志分子IL1β、TNF-α顯著上調(diào)，在感染后2和3月時M1型標志分子均顯著下調(diào)，而M2型標志分子卻顯著上調(diào)，說明多房棘球蚴感染后期誘導KCs向M2型極化，這一結(jié)果進一步驗證了先前的報道。

*. P<0.05，**. P<0.01, ***. P<0.000 1, ns. P>0.05圖5 qPCR驗證ceRNA網(wǎng)絡(luò)Fig.5 CeRNA network verified by qPCR

**. P<0.01，***. P<0.001圖6 circ_0000372-miR466c-5p-IL13調(diào)控軸驗證Fig.6 Verification of circ_0000372-miR466c-5p-IL13 axis

miRNA參與巨噬細胞的極化，而且與巨噬細胞的極化相關(guān)的miRNAs具有治療炎癥相關(guān)疾病的潛力[44]。既然miRNAs 與多房棘球蚴感染引起的巨噬細胞極化有關(guān)，而circRNA又能競爭性與miRNAs的靶基因結(jié)合，那么circRNA也可能參與多房棘球蚴誘導的巨噬細胞極化。Li等[45]發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細胞癌中circRNA ciRS-7顯著上調(diào)，而miR-7卻顯著下調(diào)，說明ciRS-7可能通過競爭性結(jié)合miR-7，消除miR-7的腫瘤抑制作用。推測ciRS-7可作為預測疾病預后的生物標志物和食管鱗狀細胞癌患者的潛在治療靶點。Liu等[46]用小鼠異種移植模型探索了circ_0000372對直腸癌體內(nèi)生長的影響，發(fā)現(xiàn)circ_0000372通過結(jié)合miR-495而上調(diào)了IL6的表達，可能參與JAK2/STAT3信號通路的激活，而當干擾circ_0000372時，則顯著抑制了體外直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲及體內(nèi)腫瘤的生長。說明circ_0000372-miR-495-IL6調(diào)控軸在直腸癌進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，多房棘球蚴感染小鼠后2月時circ_0000372的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而miR-466c-5p的水平顯著下調(diào)，同時miR-466c-5p的靶基因IL13的表達顯著上調(diào)。推測circ_0000372-miR-466c-5p-IL13軸可能參與了M2型巨噬細胞極化過程。為了驗證這種調(diào)控關(guān)系，將miR-466c-5p在KCs中過表達，發(fā)現(xiàn)circ_0000372和IL13均被顯著下調(diào)，說明多房棘球蚴感染可誘導circ_0000372的顯著上調(diào)，從而競爭性與miR-466c-5p結(jié)合，引起miR-466c-5p的水平下調(diào)，最終導致其靶基因IL13的表達水平上調(diào)。此外，從構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖中，驗證了circ_0001684-miR-182-5p-IL13軸、circ_0001571-miR-449a-5p-IL13軸、circ_000896-miR-142-5p-IL10/Arg1軸上基因的表達趨勢均與預期的一致。推測這些ceRNAs對mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可能在多房棘球蚴感染誘導宿主M2型巨噬細胞極化過程中均發(fā)揮一定的作用。上述研究結(jié)果充分表明，多個circRNAs和miRNAs參與了多房棘球蚴感染誘導的巨噬細胞極化，而且同一個mRNA的表達水平，可能受多個ncRNAs的調(diào)節(jié)，形成了復雜的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系。因此，下一步將對該網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進行深入研究，為揭示ncRNAs在多房棘球蚴持續(xù)感染中所發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用提供更多的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

多房棘球蚴感染BALB/c小鼠后，其肝KCs由抗炎的M1型逐漸向抑炎的M2型極化，這一過程受一些circRNA和miRNA調(diào)控，并與之靶基因形成了復雜的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中，circ_0000372-miR-466c-5p-IL13調(diào)控軸可能發(fā)揮了重要作用。提示ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在多房棘球蚴感染誘導的巨噬細胞極化中發(fā)揮重要作用。