量化成像流式細胞儀在免疫相關研究中的應用

周羽 陳路 四川大學華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學研究院疾病基因轉(zhuǎn)錄剪切調(diào)控實驗室/出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室 （四川成都 610041）

內(nèi)容提要：量化成像流式細胞儀具有多參數(shù)、高分辨率成像、高靈敏度以及高通量特點。文章綜述近年來量化成像流式細胞儀優(yōu)勢特點及其在免疫細胞、免疫表型、炎癥及免疫相關藥物研發(fā)方面的研究。

流式細胞儀主要應用于檢測細胞、細菌和微小顆粒物質(zhì)等。利用多參數(shù)測量，流式細胞儀對細胞標記物進行熒光信號檢測和強弱測定，反映篩選細胞的比例或者細胞表面和內(nèi)部物質(zhì)分布及含量等信息。傳統(tǒng)的流式細胞分析基于一定的細胞上樣量，對細胞的分群結(jié)果及細胞比例展示的是比較宏觀的結(jié)果。而對于極微量細胞甚至單個細胞的亞細胞定位及細胞中物質(zhì)分布、形態(tài)及大小的分析所獲取的信息量很少。因此流式細胞技術(shù)的發(fā)展關注精準性、操作性、檢測參數(shù)量、純度、通量、靈敏度、流式數(shù)據(jù)展示以及數(shù)據(jù)分析等方面。新一代的流式細胞儀如量化成像分析流式細胞儀（ImageStreamXMark Ⅱ）將流式細胞分析、熒光顯微成像、圖像數(shù)據(jù)獲取及分析軟件結(jié)合一體，可以對每個細胞進行形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及亞細胞定位熒光信號采集，最終將細胞信息進行量化成像分析。目前，該儀器已廣泛應用于腫瘤、納米材料、免疫、植物、微生物、藥物研發(fā)、外泌體研究以及方法學方面的研究。

1.量化成像流式細胞儀介紹

ImageStreamX Mark II量化成像流式儀在傳統(tǒng)流式細胞儀的液流系統(tǒng)上整合顯微成像技術(shù)，可高效每秒分析數(shù)千個細胞。該儀器也是由液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)三部分組成，最高可以升級配置7根激光器，同時檢測12個通道并采集細胞圖像。而該儀器的軟件部分涉及儀器操作、數(shù)據(jù)獲取和分析，可以對采集的每個細胞圖像進行量化參數(shù)分析，量化參數(shù)結(jié)果可以用于后續(xù)統(tǒng)計學分析，保證了數(shù)據(jù)的重復性和可靠性。儀器操作方面，該儀器具有自動激光校準、自動上樣、自動開關機和清洗功能，同時具備系統(tǒng)自檢。

2.量化成像流式儀技術(shù)優(yōu)勢

2.1 獲取細胞形態(tài)及定位信息

量化成像流式技術(shù)將熒光顯微成像技術(shù)與流式細胞技術(shù)相結(jié)合，對細胞形態(tài)、細胞定位及熒光標記物進行量化分析。儀器的特點主要是采用極限層流技術(shù)最大程度抑制液流中細胞的翻轉(zhuǎn)，同時儀器的檢測系統(tǒng)是選用廣泛用于宇宙航拍和基于時間延遲積分技術(shù)的CCD，保障了高速流動中細胞的高分辨率成像效果。此外，成像流式細胞儀還可以與共聚焦顯微鏡聯(lián)用，通過觀察活細胞中病毒結(jié)構(gòu)、侵染和復制機制，研究病原微生物和宿主的免疫反應[1]。因此，流動中的每個細胞圖像可以被快速捕捉，細胞的各種形態(tài)學參數(shù)及物質(zhì)定位信息可被用于后續(xù)分析，豐富了細胞的形態(tài)學統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2.2 精準細胞分群

在細胞分群實驗中，如果能夠同時結(jié)合細胞表面特定標記物和細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖像，細胞分群效果會更好。傳統(tǒng)的流式分析中通常需要人工圈門，該方法具有重復性差、耗時長、依賴主觀和經(jīng)驗判斷等缺點。流式分選時圈定細胞群的界線通常是直接在流式散點圖或者柱狀圖上界定分割線，缺乏對界限附近細胞準確的歸屬判斷，而量化成像流式分析可以清晰直觀地觀察界限處細胞形態(tài)及細胞熒光學特征，有效地判斷出圈門的界限，從而更準確地分選出目的細胞。在本文關注的免疫相關研究的免疫表型分析中，對免疫細胞分群圈門的操作中量化成像流式細胞分析技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢。此外，量化成像流式細胞技術(shù)在稀有細胞分析方面可以獲得更多細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的圖像信息及其他量化參數(shù)數(shù)據(jù)，有助于稀有細胞功能的進一步研究。

2.3 搭建大數(shù)據(jù)平臺

傳統(tǒng)的流式細胞儀上樣系統(tǒng)通常受到限制，需要手動將樣本依次放上，而量化成像流式細胞儀具有96孔板全自動上樣功能，同一批樣本可以同時制樣和上樣，減少了上樣操作的繁瑣性，適合高通量篩選試驗。

細胞表面和細胞內(nèi)熒光信號都可以通過量化成像流式細胞技術(shù)檢測。不僅在細胞檢測數(shù)量上可以從幾萬到幾十萬個細胞，還可以精確到每個細胞結(jié)構(gòu)及亞細胞熒光信號的監(jiān)測，很大程度地提高了通過流式細胞技術(shù)獲得數(shù)據(jù)的有效性和效率。

因此，結(jié)合多參數(shù)、高通量篩選系統(tǒng)和每秒幾千個細胞的分析速度，通過量化成像流式細胞儀可以高效獲取海量的細胞數(shù)據(jù)。并且采集的熒光和形態(tài)學參數(shù)量化分析數(shù)據(jù)具有客觀統(tǒng)計意義，有助于醫(yī)院和科研機構(gòu)分析研究平臺和大數(shù)據(jù)平臺的搭建。最重要的是，平臺的搭建有益于基礎科研和臨床相結(jié)合的研究，用于免疫類疾病及其他各類疾病發(fā)病機制的研究。

3.量化成像流式細胞儀在免疫相關研究中的應用

3.1 免疫細胞功能

人體中各種免疫細胞發(fā)揮著不同的作用，在抗原呈遞細胞功能研究中，T細胞和抗原提呈細胞的免疫突觸之間無法進行成像分析，而量化成像流式技術(shù)可以獲取量化成像信息，從而對細胞功能進行準確的分析。Habtamu等[2]通過成像流式儀分析抗原誘導下T細胞-單核細胞偶聯(lián)來研究結(jié)核患者的免疫調(diào)控作用。成像流式細胞技術(shù)還可以識別淋巴細胞中抗原相關結(jié)合蛋白定位信息來判斷免疫細胞激活狀態(tài)。此外，該技術(shù)也應用在單核細胞趨化、自然殺傷細胞功能障礙、淋巴細胞中物質(zhì)定位和脾細胞滲透性等研究中[3-6]。因此，在免疫細胞功能研究中，量化成像流式細胞技術(shù)主要利用成像功能對細胞與細胞之間的相互作用進行圖像信息采集和分析。

3.2 免疫表型分析

利用流式細胞儀對細胞進行分群實驗中，結(jié)合前向角散射光、側(cè)向角散射光和細胞標志物熒光特征參數(shù)，在相應的散點圖中設置不同的門來區(qū)分出不同的細胞群。而基于成像流式細胞儀對白細胞亞群分析進行方法學研究，可以較準確地區(qū)分不同的亞群。在1型糖尿病發(fā)病機制的研究中，通過量化成像流式儀可以觀察抗CD20藥物治療后細胞亞群分類及表達量[7]。Rao等[8]通過量化流式分析檢測二肽基肽酶-IV和免疫表型，研究巨噬細胞中調(diào)節(jié)二肽基肽酶-IV表達途徑，結(jié)果表明通過靶向調(diào)節(jié)二肽基肽酶-IV表達途徑可能是減少二肽基肽酶-IV引起的炎癥的新策略。

3.3 炎癥反應

炎癥的發(fā)生通常與免疫細胞的激活相關，而炎癥小體在人體免疫反應和炎癥發(fā)生過程中具有重要作用。凋亡相關斑點樣蛋白與胞質(zhì)傳感器蛋白組裝與炎癥小體的形成相關，炎癥小體的形成可以激活caspase-1，促進IL-1β/IL-18的釋放。其中凋亡相關斑點樣蛋白聚集濃縮后形成凋亡相關斑點復合物，用傳統(tǒng)熒光顯微鏡分析該復合物是經(jīng)典的評估炎癥小體活化的指標。但該方法耗時較長且樣本量少，開發(fā)靈敏快速的檢測方法是提高炎癥小體相關疾病臨床評估能力的手段。Lage等[9]構(gòu)建了一種基于成像流式細胞技術(shù)測量凋亡相關斑點樣蛋白斑點成像方法，同時可以檢測活化的caspase-1在凋亡相關斑點樣蛋白多聚體中的分布。該方法已在多種免疫性疾病、炎癥類疾病和阿爾茨海默癥中都有廣泛的應用。在對41例多發(fā)性硬化癥患者的研究中發(fā)現(xiàn)尿酸鈉晶體可以激活炎癥小體[10]。Nagar等[11]在細胞群和單細胞水平對凋亡相關斑點樣蛋白斑點和caspase-1活性進行定量檢測，量化信息包括斑點頻率、面積以及細胞分布等。

3.4 藥物研發(fā)

量化成像流式儀可用于細胞的攝取、靶向定向運輸以及細胞結(jié)合情況的藥物治療作用研究。在單抗藥物研發(fā)中，研究人員需要評估克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎疾病中抗β7整合素單抗etrolizumab藥物的安全性和有效性。通過細胞培養(yǎng)，結(jié)合量化成像流式儀進行功能性動態(tài)體外黏附實驗，對藥物誘導細胞分化、細胞毒性以及細胞因子分泌進行分析，有助于闡明藥物阻滯作用和免疫學機制[12]。在口服藥效研究中，Pocock等[13]結(jié)合成像流式細胞技術(shù)和紫外熒光光譜分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)聚乙二醇狀的顆粒狀載體更容易穿透黏液層。在生物制藥研究領域，Pekle等[14]開發(fā)了細胞系中成像流式分析技術(shù)檢測重組重鏈和mRNA，可用于篩選高產(chǎn)量的克隆細胞系。在疫苗研發(fā)方面，Schetters等[15]通過成像流式細胞儀鑒定骨髓來源的樹突狀細胞的內(nèi)吞能力，同時區(qū)分膜上熒光和胞內(nèi)熒光來跟蹤受體的內(nèi)在化，發(fā)現(xiàn)小鼠DC-SIGN/CD209a可作為抗原呈遞和適應性免疫的靶點。此外，量化成像流式細胞技術(shù)可以展現(xiàn)藥物作用后細胞數(shù)量統(tǒng)計、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、細胞代謝、增殖及凋亡等信息，通過細胞形態(tài)學數(shù)據(jù)及流式數(shù)據(jù)統(tǒng)計將數(shù)據(jù)進行定量，從而應用于大規(guī)模藥物篩選試驗。

4.小結(jié)

與傳統(tǒng)流式細胞分析儀相比，量化成像流式細胞儀具有高通量、數(shù)據(jù)量化、細胞成像等特點，已在免疫疾病及免疫相關的細胞學研究中應用較多。觀察免疫細胞之間相互作用，分析細胞內(nèi)相關蛋白含量及定位信息，可以作為免疫激活信號檢測或者疾病診斷標志。目前，量化成像流式檢測炎癥小體技術(shù)在神經(jīng)類疾病、免疫及炎癥中應用廣泛。而在免疫細胞功能研究、免疫表型分析及藥物研發(fā)方面，量化成像流式細胞也起到了重要的作用。同時，儀器在細胞學功能研究中還包括細胞周期、微核計數(shù)、細胞形變和趨化等。

量化成像流式細胞術(shù)作為細胞學領域強有力的分析工具，已應用在藥物研發(fā)過程中細胞動態(tài)觀察及靶點篩選，對免疫疾病中細胞信號調(diào)節(jié)及代謝通路研究提供進一步的量化成像數(shù)據(jù)支持。

因此，科學研究中基于成像信息的流式分析技術(shù)的研究手段可用于解決復雜的科學問題和臨床檢測方法的技術(shù)開發(fā)。這將不僅限于免疫類疾病發(fā)病機制、檢測技術(shù)以及治療手段的研究，而同時可以開發(fā)該技術(shù)用于其他類疾病及多種交叉學科的應用。此外，該技術(shù)可以完善流式細胞分析分選平臺設備功能應用，進一步促進醫(yī)療機構(gòu)及科研平臺細胞高通量分析及大數(shù)據(jù)采集平臺的搭建。這有利于基于細胞成像的流式技術(shù)用于疾病的診斷和治療學科研究方向的發(fā)展。