流式細(xì)胞分選儀（BD FACSAria lll）分選中常見問題分析及處理

周羽 陳路 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院疾病基因轉(zhuǎn)錄剪切調(diào)控實(shí)驗(yàn)室/出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （四川成都 610041）

內(nèi)容提要： 流式細(xì)胞分選技術(shù)在基礎(chǔ)科研和臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用廣泛。為提高分選操作效率，保障分選過程中故障能夠及時處理，文章對BD（FACSAria III）流式細(xì)胞分選儀分選中常見問題分析和處理進(jìn)行簡單介紹。

流式細(xì)胞分選儀可以通過細(xì)胞大小、形態(tài)、顆粒復(fù)雜程度及細(xì)胞特異性標(biāo)志物等多參數(shù)對細(xì)胞進(jìn)行鑒別區(qū)分。流式細(xì)胞分選技術(shù)在臨床和科研工作中應(yīng)用范圍涉及腫瘤學(xué)、血液學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域[1-4]。特別是在疾病診斷、療效評估、微生物檢測、物種倍性鑒定和金屬納米顆粒檢測等生物醫(yī)學(xué)研究及制藥工業(yè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[5-10]?？蒲泄ぷ髦袠颖痉诌x前的準(zhǔn)備通常還存在樣本處理過程繁瑣、樣本需分批收集、分選前后樣本需保持活性等特點(diǎn)。因此，儀器分選過程中對儀器操作員的分選經(jīng)驗(yàn)有一定的要求。分選不順利不僅延長整個實(shí)驗(yàn)周期，還會造成人力、物力和財力的浪費(fèi)，因此，儀器日常維護(hù)和專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)非常重要[11,12]。流式技術(shù)的發(fā)展關(guān)注精準(zhǔn)性、易操作性、檢測參數(shù)量、高純度、高通量、靈敏度、流式數(shù)據(jù)展示以及數(shù)據(jù)分析等方面。新一代的流式細(xì)胞儀如量化成像分析流式細(xì)胞儀結(jié)合了熒光顯微成像技術(shù)，可以將細(xì)胞信息進(jìn)行量化成像分析，可用于藥物篩選研究和外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測[13-15]。本綜述針對常用的流式細(xì)胞分選儀（BD FACSAria III）日常分選過程中經(jīng)常遇到的問題進(jìn)行詳細(xì)的分析和整理。

1.流式細(xì)胞分選技術(shù)

1.1 流式分選技術(shù)優(yōu)勢

流式細(xì)胞儀可以根據(jù)不同的熒光信號對特異抗原、單個分子（DNA、RNA、蛋白）以及微生物進(jìn)行特定分析和分選。流式細(xì)胞分選技術(shù)是最有效和快速的細(xì)胞分選技術(shù)。由于該技術(shù)對細(xì)胞分選具有高純度、高活性以及高速的特點(diǎn)，因此流式分選技術(shù)在高純度目的細(xì)胞、低含量細(xì)胞和多孔板分選中有顯著優(yōu)勢。特別是BD FACSAria III在選擇單細(xì)胞分選模式后可以很快地結(jié)合下游單細(xì)胞建庫測序及其他實(shí)驗(yàn)。

1.2 流式分選原理

BD FACSAria Ⅲ型號流式分選儀具有卓越的多色性能，可以配置六根激光，具備18色的檢測能力，能夠滿足多色交叉的復(fù)雜分選方案。同時該儀器自動化操作性強(qiáng)，具有較高分析靈敏度、分辨率和回收率等性能，在細(xì)胞分選中具有廣泛的應(yīng)用。分選進(jìn)行時，樣本中的細(xì)胞在壓力的驅(qū)動下以液流形態(tài)通過石英杯流動池，激光聚焦到樣本流上，細(xì)胞產(chǎn)生光學(xué)信號并被收集[16]。被圈定的目的細(xì)胞在電極板的加電作用下帶上不同的電荷，分選倉可以給液滴充上正電荷或負(fù)電荷以及不同的電量，液滴的偏轉(zhuǎn)角度被調(diào)節(jié)到合適的位置，因此包裹目的細(xì)胞的液滴可以實(shí)現(xiàn)多路分選，最多可以同時完成四路分選。在軟件的分選調(diào)節(jié)窗口呈現(xiàn)的操作是調(diào)節(jié)電壓的強(qiáng)弱就可以將包裹著細(xì)胞的液滴依次有序地分選到不同的收集管里。

1.3 影響流式分選的因素

流式分選過程涉及樣本制備、樣本保存、儀器校準(zhǔn)質(zhì)控、電壓設(shè)置、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、圈門及數(shù)據(jù)分析等關(guān)鍵步驟[17]。①分選前，由于流式細(xì)胞分選的細(xì)胞純度和效率與分選細(xì)胞樣本的狀態(tài)和染色、離心等操作有關(guān)。因此，分選前需要保持細(xì)胞的活性，選擇合適的細(xì)胞緩沖液，并且避免過高離心轉(zhuǎn)速對細(xì)胞造成損害。②分選中，分選細(xì)胞的純度和得率與儀器的液流狀態(tài)和分選模式選擇有關(guān)，比如分選前后需要檢查維護(hù)儀器液流系統(tǒng)、分選倉、收集倉等關(guān)鍵部件處于正常狀態(tài)。因此，分選過程中樣品、儀器和軟件的實(shí)時監(jiān)控顯得尤為重要。分選過程中液流出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)時，已調(diào)節(jié)好的液滴延遲時間可能不適用，液滴加電時間不準(zhǔn)確，造成非目的細(xì)胞被分選到收集管中，從而間接影響了分選細(xì)胞的純度。分選模式通常有三種：富集模式、純化模式和單細(xì)胞模式。富集模式使所有含陽性細(xì)胞的液滴都被選中，而純化模式是所有含陰性細(xì)胞的液滴都被舍棄。因此選擇不同的分選模式會直接影響目的細(xì)胞的得率。此外，上樣細(xì)胞的大小和濃度不同，分選過程中需要調(diào)節(jié)細(xì)胞的上樣速率，保證細(xì)胞的分選效率。③分選后，由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌诌x的細(xì)胞將用于培養(yǎng)或者裂解后提取核酸等。在對細(xì)胞活性要求較高的情況下，需要對分選過程中無菌環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格把控，包括儀器無菌管路準(zhǔn)備，分選操作人員取樣、過濾、上樣時進(jìn)行無菌消毒處理，儀器上樣倉和樣品接收倉表面噴灑酒精消毒。如果分選后的細(xì)胞將用于提取RNA，細(xì)胞也需要保持較高的活性，否則細(xì)胞破碎會使釋放出來的RNA被迅速降解。通常實(shí)驗(yàn)人員會在細(xì)胞緩沖液中加入防止RNA降解的成分，同時收集器連接冷凝管使樣本保持4°C，并且收集到的細(xì)胞應(yīng)及時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理。

2.分選中常見問題分析及處理（BD FACSAria lll）

2.1 液流紊亂

液流紊亂是流式細(xì)胞分選儀在分選過程中最常見的現(xiàn)象，操作人員需要及時發(fā)現(xiàn)和處理并首先關(guān)掉液流，否則會首先影響儀器的整個液流系統(tǒng)，造成樣本的浪費(fèi)，影響目的細(xì)胞的分選效果。液流突然紊亂的原因及解決方法通常有：①液流存在氣泡：分選前如果鞘液過濾器中氣泡沒有排完，分選中液流就會受影響，需要重新徹底檢查氣泡是否排完；②液路出現(xiàn)漏液：檢查液路管是不是漏液，拔掉重新扣緊，或者是管子里的密閉圈磨損了，磨損的話則更換密閉圈；③氣路存在漏氣：檢查氣管是不是沒有扣緊或者鞘液桶的蓋子周圍漏氣，可以用手感受一下，如果是密封圈磨損，則及時更換；④樣本中有雜質(zhì)或細(xì)胞粘黏嚴(yán)重堵住了流動室的噴嘴，因此超聲清洗噴嘴，樣本重新過濾處理后再上機(jī)。

2.2 上樣速率

問題描述：設(shè)備運(yùn)行過程中，上樣速率突然變?yōu)?evt/s，但是液流窗口顯示液流處于正常狀態(tài)?？赡茉颍菏紫葯z查上樣倉中流式樣品管是否還有細(xì)胞懸液，排除細(xì)胞樣本跑完造成的流速為零。該現(xiàn)象最常見的原因是樣本中細(xì)胞成團(tuán)對上樣倉中進(jìn)樣針或噴嘴造成堵塞。處理方法：①細(xì)胞堵管道了，準(zhǔn)備一管次氯酸，以最高速沖洗后，選擇進(jìn)樣針反沖；②如果是進(jìn)樣針外壁細(xì)胞聚團(tuán)，進(jìn)樣針反沖無法清洗干凈，樣本運(yùn)行中就會出現(xiàn)堵塞，這時需要在擰旋鈕處畫個標(biāo)記，擰開后取出進(jìn)樣針，打開進(jìn)樣針反沖，用吸水紙擦拭外壁，再按照之前標(biāo)記的位置組裝好后放回去；③如果是噴嘴堵了，將噴嘴超聲處理。

2.3 分選速率

問題描述：儀器分選過程中分選速率變?yōu)?evt/s，但是樣本流速正常?？赡茉蚣疤幚矸椒ㄓ校孩倥懦康募?xì)胞所圈的門是開放式的門；②目的細(xì)胞所圈門的前面一個邏輯門位置避免處于信號過弱的位置；③目的細(xì)胞所在的門稍微移動下，有時可能是目的細(xì)胞比例極低，收集一定數(shù)量級目的細(xì)胞所需分選時間較久造成的軟件識別反應(yīng)滯后。

2.4 流式散點(diǎn)圖形態(tài)改變

問題描述：樣本運(yùn)行時散點(diǎn)圖中細(xì)胞信號點(diǎn)突然全部壓線，緊貼坐標(biāo)軸，而電壓并沒有改變過并且液流處于穩(wěn)定狀態(tài)?？赡茉颍和ǔＪ菄娮斓目讖竭M(jìn)了氣泡，但是又沒有完全堵住噴嘴的孔徑，因此還是會有液滴下落，細(xì)胞是擠著通過變窄的孔徑的。處理方法：暫停液流，將噴嘴取下后重新安裝，必要時超聲處理噴嘴。

2.5 液滴延遲時間的調(diào)節(jié)

液滴延遲是指細(xì)胞經(jīng)過激光檢測區(qū)域到液滴分離斷點(diǎn)之間的距離的時間。液滴延遲時間的確定關(guān)乎液滴最佳充電的時間，與最終細(xì)胞分選純度和得率相關(guān)。因此液滴延遲的調(diào)節(jié)在流式分選過程中顯得尤為重要。目前BD FACSAria III流式細(xì)胞儀有產(chǎn)品化的Accudrop微球，可以按照操作說明進(jìn)行自動校準(zhǔn)。但在實(shí)際過程中容易出現(xiàn)校準(zhǔn)失敗的情況，可能的原因及處理辦法：①液流不穩(wěn)。分選的液流需要達(dá)到最佳狀態(tài)，也就是振幅和頻率是比較穩(wěn)定的狀態(tài)，必要時需要重新調(diào)節(jié)。②Accudrop微球上樣不符合要求。檢查Accudrop微球是否在效期內(nèi)并且最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，確保微球的上樣速率在合適的范圍，通常速率要求是600～1500evts/s。

2.6 電極板加電錯誤

問題描述：流式儀分選倉中的電極板加電時會不斷報錯，提示加電發(fā)生錯誤，而儀器上電壓指示燈呈現(xiàn)紅色狀態(tài)，這在分選中并不常見，但通常會發(fā)生在儀器開機(jī)時間過長，樣本分選操作頻繁的情況。電極板電壓傳感和軟件連接失靈，電極板無法加電也不能關(guān)掉，重啟軟件或者機(jī)器也不能改善。原因分析及處理方法：可能放置儀器的房間里溫度過高，影響分選儀電極板加電，可以調(diào)低空調(diào)設(shè)置溫度，將儀器打開上蓋和右側(cè)蓋進(jìn)行降溫后再開機(jī)進(jìn)行分選。

2.7 四路分選

問題描述：流式細(xì)胞儀在四路分選過程中主液流分叉調(diào)節(jié)很重要。有時候會出現(xiàn)中心液流和左一路、左二路、右一路、右二路液流采集點(diǎn)幾乎連成一條線的現(xiàn)象，該現(xiàn)象說明中心液流分叉很嚴(yán)重，而分選過程中主液流中細(xì)胞屬于非目的細(xì)胞，分叉嚴(yán)重會導(dǎo)致非目的細(xì)胞通過左右兩邊的分液流被分選到流式收集管里。可能的原因及處理方法：①分選過程中液流突然出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，干擾了電極板對液滴的加電。可以暫停分選，微調(diào)液流窗口中的amp，通常分選窗口液流的穩(wěn)定性會有改善。②電極板表面有雜質(zhì)，分選過程中液流濺到電極板表面，水分蒸發(fā)后留下PBS顆粒，也會干擾電極板對液滴的加電?？梢杂妹藓灢潦秒姌O板，液流分叉的情況會有改善。

3.小結(jié)

流式細(xì)胞分選儀（BD FACSAria III）屬于大型精密儀器，儀器硬件故障率較低，而分選中經(jīng)常會遇到一些高頻率故障。光學(xué)系統(tǒng)方面，激光器每日啟動后的穩(wěn)定狀態(tài)，可以通過儀器標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控流程檢測，如有問題，需要及時調(diào)試；液流系統(tǒng)方面，液路紊亂或斷流是發(fā)生頻率較高的故障，需要實(shí)驗(yàn)人員做出及時處理；分選方面，液滴延遲和分選角度等在正式分選前調(diào)試好，在整個分選操作結(jié)束之前需要關(guān)注整個儀器運(yùn)作的液路、光路、樣本量剩余等穩(wěn)定狀態(tài)。待分選的細(xì)胞如果能夠盡快順利地進(jìn)入分選流程，那么細(xì)胞是最大程度地保持了最佳狀態(tài)，這有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)操作員熟練掌握流式分選技術(shù)可以保障細(xì)胞樣本在最佳活性狀態(tài)下完成分選。當(dāng)流式細(xì)胞儀出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)或者故障時，儀器操作員如果能夠查找原因，做出正確的分析并及時處理，不僅能夠保證樣本的分選純度，還能夠避免儀器各貴重部件的進(jìn)一步損壞，這有利于大型儀器的長期維護(hù)工作。同時避免了流式分選樣本浪費(fèi)的可能，盡可能地保證了樣本中目的細(xì)胞的順利分選。此外，實(shí)驗(yàn)人員可以參照包括血液學(xué)、免疫學(xué)等不同領(lǐng)域研究的流式操作指南，可以更詳細(xì)了解樣本分選前的樣本處理、樣本染色及分選中和分選后的注意事項(xiàng)。因此只有對流式分選原理和流程有清楚的認(rèn)識，明確分選過程中導(dǎo)致分選中斷的可能原因，才能排除故障并做出及時的處理，從而起到縮短分選時間，保證科研項(xiàng)目的順利進(jìn)行，為高校節(jié)約科研經(jīng)費(fèi)和為醫(yī)院節(jié)省檢驗(yàn)成本的作用。